引用本文： 尹彦斌, 王跃生, 张立海, 苏德望. T2DM大鼠行Roux-en-Y胃旁路术后血清Ghrelin和Visfatin水平的变化及意义. 中国普外基础与临床杂志, 2016, 23(12): 1432-1436. doi: 10.7507/1007-9424.20160365 复制
Roux-en-Y胃旁路术（Roux-en-Y gastric bypass surgery，RYGB）作为一种新的治疗糖尿病的方法，已得到了医学界广泛的认同[1-2]。目前已明确，生长激素释放肽（Ghrelin）、内脂素（Visfatin）与2型糖尿病（T2DM）之间有着明确的联系，但其在RYGB后的具体作用机理尚不明确。本实验基于以上背景，观察了RYGB前后Ghrelin和Visfatin水平的变化情况，以探究Ghrelin和Visfatin在RYGB后血糖降低中的作用机制及意义。
1 材料和方法
1.1 实验动物、主要材料和试剂
30只SD健康雄性大鼠，8周龄，体质量240~310 g，购自哈尔滨医科大学动物实验室；高脂高糖饲料（5%蔗糖+10%猪油+1.5%胆固醇+0.25%胆酸钠+83.25%基础饲料）和大鼠清洁级饲料均购自江苏省协同医药生物工程有限公司；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）购自美国Sigma公司；Ghrelin酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒购自研域（上海）化学试剂有限公司，Visfatin ELISA试剂盒（1217）购自上海拜力生物技术有限公司。血糖仪及血糖试纸均购自三诺生物技术传感股份有限公司，Biotek多功能酶标仪系美国Biotek公司产品。
1.2 方法
1.2.1 T2DM大鼠模型的建立
将30只SD大鼠随机（随机数字表法）分为糖尿病组22只和空白对照组（CSO组）8只。糖尿病组大鼠给予高脂高糖饮食6周后，再小剂量腹腔注射STZ（35 mg/kg）；3 d后测定血清空腹血糖（FBG），未建模成功者给予半剂量追加给药。以随机血糖 > 16.7 mmol/L为T2DM造模成功标准[3]。结果建模成功18只，4只未建模成功。
1.2.2 手术
建模成功后，将18只T2DM大鼠随机（随机数字表法）分为RYGB组10只和假手术组（DSO组）8只。术前3组大鼠均采血测定血清FBG、空腹胰岛素（FINS）、Ghrelin及Visfatin水平。所有大鼠于术前禁食12 h，给予10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，待麻醉满意后，将大鼠仰卧固定于解剖台上。RYGB组：取腹部正中切口约4 cm长，首先分离胃体部，用丝线缝合胃远端及近端胃小弯侧，将胃分出1个袋状小胃，然后于十二指肠悬韧带下10 cm处离断空肠袢，将远端空肠与近端大弯侧吻合；将近端空肠吻合于距胃空肠吻合口远端10 cm处空肠，完成RYGB。DSO组和CSO组大鼠均行空肠离断原位吻合术，术前准备、麻醉方式及手术时间均与RYGB组大鼠相似。手术后所有大鼠置于相同环境下，行抗炎治疗1周，且术后均给予清洁级饲料。
1.2.3 标本采集
于术前和术后4周，采用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉大鼠，麻醉满意后，将大鼠仰卧固定于解剖板上，心脏采血约5 mL，静置2 h后离心（4 000 r/min，r=10 cm，15 min），取上层血清，-80 ℃下保存，待用。
1.2.4 指标测定及方法
采用放射免疫法测定FINS水平，采用快速血糖仪测定FBG水平，采用ELISA法测定空腹血清Visfatin和Ghrelin水平，操作均按说明书进行。于术前和术后4周准确称量大鼠体质量，测量鼻肛身长，计算肥胖指数：肥胖指数=；按照公式计算胰岛素敏感指数（ISI）：ISI=Ln〔1/（FINS×FBG）〕。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）或中位数（M）表示，组间比较采用单因素方差分析（两两比较采用LSD法）或成组设计两样本比较的秩和检验；组内比较采用配对t检验；相关性分析采用Pearson简单相关分析。检验水准α=0.050。
2 结果
2.1 术后4周3组大鼠的基本情况比较
本实验期间无大鼠死亡。建模成功后18只T2DM大鼠逐渐出现糖尿病的多饮、多食及多尿症状。相较于术前，RYGB组大鼠的体质量、肥胖指数、FBG水平及FINS水平均降低（P < 0.050），ISI值升高（P < 0.001），但手术前后的体长比较差异无统计学意义（P=0.704）；DSO组和CSO组大鼠手术前后的体质量、体长、肥胖指数、FBG水平、FINS水平及ISI值比较差异均无统计学意义（P > 0.050），见表 1。
表1
术后4周3组大鼠的基本情况比较（x±s）
术前除了体长外（P=0.050），RYGB组和DSO组大鼠的体质量、肥胖指数、FBG水平及FINS水平均高于CSO组，而ISI值低于CSO组，差异均有统计学意义（P < 0.050），但RYGB组和DSO组的上述指标比较差异均无统计学意义（P > 0.050）。术后4周时，除了体长外（P=0.110），RYGB组、DSO组和CSO组大鼠的体质量、肥胖指数、FBG水平、FINS水平及ISI值比较差异均有统计学意义（P < 0.050），DSO组大鼠的体质量、肥胖指数、FBG水平和FINS水平均高于RYGB组和CSO组相应指标（P < 0.050），而ISI值却低于RYGB组和CSO组（P < 0.050）；术后4周RYGB组和CSO组大鼠的上述各指标比较差异均无统计学意义（P > 0.050），见表 1。该结果提示RYGB的降糖效果明显，减肥作用显著。
2.2 3组大鼠手术前后的血清Ghrelin和Visfatin水平比较
与术前比较，RYGB组大鼠的Ghrelin水平升高，而Visfatin水平降低，差异均有统计学意义（P < 0.050），但DSO组和CSO组大鼠手术前后的Ghrelin和Visfatin水平比较差异均无统计学意义（P > 0.050）。3组大鼠手术前后的Ghrelin和Visfatin水平的差值比较差异均有统计学意义（P < 0.001），RYGB组的Ghrelin、Visfatin水平的差值较DSO组和CSO组大（P < 0.050），但DSO和CSO组比较差异均无统计学意义（P > 0.050）。见表 2。
表2
3组大鼠手术前后的Ghrelin和Visfatin水平比较
2.3 Ghrelin水平与ISI值、Visfatin水平与肥胖指数的相关性分析
术后4周时RYGB组大鼠的Ghrelin水平与ISI值呈正相关（r=0.771，P=0.003），Visfatin水平与肥胖指数呈负相关（r=-0.746，P=0.005），见图 1和图 2。
图1
示Ghrelin水平与ISI值关系的散点图 图 2 示Visfatin水平与肥胖指数关系的散点图
3 讨论
中国人群糖尿病的发病率呈逐年增高趋势，并且日趋年轻化，据统计有80%的糖尿病患者伴有肥胖症[4]。在肥胖型糖尿病前期，若能控制体质量，可降低糖尿病发生风险或延缓其进展，甚至扭转糖尿病发展的进程。在过去几十年里，减肥手术治疗肥胖症已被广泛接受，该手术同时对糖尿病的治疗效果亦非常显著，甚至能够治愈，这其中RYGB的作用效果最为显著且最为安全[5-7]。RYGB治疗T2DM的作用机理尚未完全阐明，但肠-胰岛轴学说已得到多数学者的认同[8]。
通过高脂高糖饮食联合注射小剂量STZ造模成功的糖尿病大鼠模型具有高血糖、高血脂、高胰岛素水平等典型肥胖型糖尿病特征。在本实验中，22只大鼠经过长时间的高脂高糖饮食，有18只建模成功，且建模成功的18只大鼠逐渐出现多饮、多尿及多食症状。术后第4周检测发现，DSO组大鼠的体质量、肥胖指数、FBG水平和FINS水平均高于RYGB组和CSO组相应指标（P < 0.050），而ISI值却低于RYGB组和CSO组（P < 0.050）；RYGB组和CSO组大鼠的上述各指标比较差异均无统计学意义（P > 0.050）。该实验结果显示，RYGB在治疗肥胖型T2DM上具有良好的降糖效果和减肥作用，此外，还能很好地改善T2DM大鼠的ISI和肥胖指数，可见改善血糖代谢和脂代谢是RYGB治疗T2DM的两个重要机理[9]。而血糖代谢异常和脂代谢异常是导致T2DM的重要机制，并且二者具有协同作用[10-13]。
Ghrelin与Visfatin是分别反映血糖代谢和脂代谢的重要因子。Ghrelin是Kojima等[14]发现的一种生长激素促泌素受体的内源性配体，是由胃黏膜下层的X/A样细胞合成和分泌的小分子脑肠肽。研究[15-16]表明，Ghrelin能够调节食物摄入、体质量和葡萄糖代谢，是T2DM发生的影响因素，并且影响糖尿病以及肥胖症的发病和病情进展。近期研究[17]表明，Ghrelin与肥胖程度密切相关。RYGB改变了消化道的生理结构后，胃排空加快，使摄入的营养物质提前与低位小肠接触，导致Ghrelin分泌增加，刺激小肠上的L细胞分泌胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）。Ghrelin分泌的增加同时能抑制胰岛素释放肽（glucose-dependent insulinotropic peptide，GIP）的分泌，该因子亦能通过下丘脑增加胰岛素分泌、胰岛素敏感性而改善血糖的代谢[18-19]。另外Ghrelin分泌的增加还会导致食欲降低，进食随之减少，遂能够达到长期控制体质量的效果[20-23]。Visfatin是新发现的由内脏脂肪细胞分泌的一种脂肪细胞因子，可结合并激活胰岛素受体的非胰岛素结合部位，激活胰岛素受体信号通路，从而模拟胰岛素作用，降低机体血糖。Visfatin与T2DM的发生密切相关，有促进脂肪组织分化、脂肪合成和积累的作用；其还能通过激活胰岛素受体信号通路，从而模拟胰岛素作用，降低血糖水平，并且能够结合并激活胰岛素受体，模拟胰岛素的作用。研究[24-26]显示，T2DM患者的血清Visfatin水平明显高于非糖尿病人群，且血清Visfatin水平与FBG水平呈正相关，是T2DM发生的危险因素。在将编码Visfatin基因的质粒转染到小鼠体内后，小鼠血糖和胰岛素水平均显著下降；而在敲除Visfatin基因的小鼠体内发现，血清Visfatin水平下降，血糖浓度水平升高[27-28]。本实验结果显示，RYGB组的Ghrelin水平在术后4周时，与术前相比有明显升高，并与ISI值呈正相关（r=0.771，P=0.003）；RYGB组的Visfatin水平在术后4周时，与术前相比较含量明显下降，并与肥胖指数呈负相关（r=-0.746，P=0.005）。
胃转流手术改变了消化道的正常生理结构，使进入胃部的食物排空加快，从而促进Ghrelin的分泌，Ghrelin分泌的增加最终促使胰岛素分泌，起到降低血糖的作用；同时手术使Visfatin水平得以恢复至正常，使脂肪积聚受到抑制，从而起到减肥作用。本实验结果提示，Ghrelin与Visfatin在RYGB治疗肥胖和T2DM的过程中，具有不可或缺的作用，为未来的新药开发提供了一定的理论基础。Ghrelin类似物或Visfatin拮抗剂的合成，以及两者的配合使用，将会是治疗T2DM患者的一项重要方法。
Roux-en-Y胃旁路术（Roux-en-Y gastric bypass surgery，RYGB）作为一种新的治疗糖尿病的方法，已得到了医学界广泛的认同[1-2]。目前已明确，生长激素释放肽（Ghrelin）、内脂素（Visfatin）与2型糖尿病（T2DM）之间有着明确的联系，但其在RYGB后的具体作用机理尚不明确。本实验基于以上背景，观察了RYGB前后Ghrelin和Visfatin水平的变化情况，以探究Ghrelin和Visfatin在RYGB后血糖降低中的作用机制及意义。
1 材料和方法
1.1 实验动物、主要材料和试剂
30只SD健康雄性大鼠，8周龄，体质量240~310 g，购自哈尔滨医科大学动物实验室；高脂高糖饲料（5%蔗糖+10%猪油+1.5%胆固醇+0.25%胆酸钠+83.25%基础饲料）和大鼠清洁级饲料均购自江苏省协同医药生物工程有限公司；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）购自美国Sigma公司；Ghrelin酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒购自研域（上海）化学试剂有限公司，Visfatin ELISA试剂盒（1217）购自上海拜力生物技术有限公司。血糖仪及血糖试纸均购自三诺生物技术传感股份有限公司，Biotek多功能酶标仪系美国Biotek公司产品。
1.2 方法
1.2.1 T2DM大鼠模型的建立
将30只SD大鼠随机（随机数字表法）分为糖尿病组22只和空白对照组（CSO组）8只。糖尿病组大鼠给予高脂高糖饮食6周后，再小剂量腹腔注射STZ（35 mg/kg）；3 d后测定血清空腹血糖（FBG），未建模成功者给予半剂量追加给药。以随机血糖 > 16.7 mmol/L为T2DM造模成功标准[3]。结果建模成功18只，4只未建模成功。
1.2.2 手术
建模成功后，将18只T2DM大鼠随机（随机数字表法）分为RYGB组10只和假手术组（DSO组）8只。术前3组大鼠均采血测定血清FBG、空腹胰岛素（FINS）、Ghrelin及Visfatin水平。所有大鼠于术前禁食12 h，给予10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，待麻醉满意后，将大鼠仰卧固定于解剖台上。RYGB组：取腹部正中切口约4 cm长，首先分离胃体部，用丝线缝合胃远端及近端胃小弯侧，将胃分出1个袋状小胃，然后于十二指肠悬韧带下10 cm处离断空肠袢，将远端空肠与近端大弯侧吻合；将近端空肠吻合于距胃空肠吻合口远端10 cm处空肠，完成RYGB。DSO组和CSO组大鼠均行空肠离断原位吻合术，术前准备、麻醉方式及手术时间均与RYGB组大鼠相似。手术后所有大鼠置于相同环境下，行抗炎治疗1周，且术后均给予清洁级饲料。
1.2.3 标本采集
于术前和术后4周，采用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉大鼠，麻醉满意后，将大鼠仰卧固定于解剖板上，心脏采血约5 mL，静置2 h后离心（4 000 r/min，r=10 cm，15 min），取上层血清，-80 ℃下保存，待用。
1.2.4 指标测定及方法
采用放射免疫法测定FINS水平，采用快速血糖仪测定FBG水平，采用ELISA法测定空腹血清Visfatin和Ghrelin水平，操作均按说明书进行。于术前和术后4周准确称量大鼠体质量，测量鼻肛身长，计算肥胖指数：肥胖指数=；按照公式计算胰岛素敏感指数（ISI）：ISI=Ln〔1/（FINS×FBG）〕。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）或中位数（M）表示，组间比较采用单因素方差分析（两两比较采用LSD法）或成组设计两样本比较的秩和检验；组内比较采用配对t检验；相关性分析采用Pearson简单相关分析。检验水准α=0.050。
2 结果
2.1 术后4周3组大鼠的基本情况比较
本实验期间无大鼠死亡。建模成功后18只T2DM大鼠逐渐出现糖尿病的多饮、多食及多尿症状。相较于术前，RYGB组大鼠的体质量、肥胖指数、FBG水平及FINS水平均降低（P < 0.050），ISI值升高（P < 0.001），但手术前后的体长比较差异无统计学意义（P=0.704）；DSO组和CSO组大鼠手术前后的体质量、体长、肥胖指数、FBG水平、FINS水平及ISI值比较差异均无统计学意义（P > 0.050），见表 1。
表1
术后4周3组大鼠的基本情况比较（x±s）
术前除了体长外（P=0.050），RYGB组和DSO组大鼠的体质量、肥胖指数、FBG水平及FINS水平均高于CSO组，而ISI值低于CSO组，差异均有统计学意义（P < 0.050），但RYGB组和DSO组的上述指标比较差异均无统计学意义（P > 0.050）。术后4周时，除了体长外（P=0.110），RYGB组、DSO组和CSO组大鼠的体质量、肥胖指数、FBG水平、FINS水平及ISI值比较差异均有统计学意义（P < 0.050），DSO组大鼠的体质量、肥胖指数、FBG水平和FINS水平均高于RYGB组和CSO组相应指标（P < 0.050），而ISI值却低于RYGB组和CSO组（P < 0.050）；术后4周RYGB组和CSO组大鼠的上述各指标比较差异均无统计学意义（P > 0.050），见表 1。该结果提示RYGB的降糖效果明显，减肥作用显著。
2.2 3组大鼠手术前后的血清Ghrelin和Visfatin水平比较
与术前比较，RYGB组大鼠的Ghrelin水平升高，而Visfatin水平降低，差异均有统计学意义（P < 0.050），但DSO组和CSO组大鼠手术前后的Ghrelin和Visfatin水平比较差异均无统计学意义（P > 0.050）。3组大鼠手术前后的Ghrelin和Visfatin水平的差值比较差异均有统计学意义（P < 0.001），RYGB组的Ghrelin、Visfatin水平的差值较DSO组和CSO组大（P < 0.050），但DSO和CSO组比较差异均无统计学意义（P > 0.050）。见表 2。
表2
3组大鼠手术前后的Ghrelin和Visfatin水平比较
2.3 Ghrelin水平与ISI值、Visfatin水平与肥胖指数的相关性分析
术后4周时RYGB组大鼠的Ghrelin水平与ISI值呈正相关（r=0.771，P=0.003），Visfatin水平与肥胖指数呈负相关（r=-0.746，P=0.005），见图 1和图 2。
图1
示Ghrelin水平与ISI值关系的散点图 图 2 示Visfatin水平与肥胖指数关系的散点图
3 讨论
中国人群糖尿病的发病率呈逐年增高趋势，并且日趋年轻化，据统计有80%的糖尿病患者伴有肥胖症[4]。在肥胖型糖尿病前期，若能控制体质量，可降低糖尿病发生风险或延缓其进展，甚至扭转糖尿病发展的进程。在过去几十年里，减肥手术治疗肥胖症已被广泛接受，该手术同时对糖尿病的治疗效果亦非常显著，甚至能够治愈，这其中RYGB的作用效果最为显著且最为安全[5-7]。RYGB治疗T2DM的作用机理尚未完全阐明，但肠-胰岛轴学说已得到多数学者的认同[8]。
通过高脂高糖饮食联合注射小剂量STZ造模成功的糖尿病大鼠模型具有高血糖、高血脂、高胰岛素水平等典型肥胖型糖尿病特征。在本实验中，22只大鼠经过长时间的高脂高糖饮食，有18只建模成功，且建模成功的18只大鼠逐渐出现多饮、多尿及多食症状。术后第4周检测发现，DSO组大鼠的体质量、肥胖指数、FBG水平和FINS水平均高于RYGB组和CSO组相应指标（P < 0.050），而ISI值却低于RYGB组和CSO组（P < 0.050）；RYGB组和CSO组大鼠的上述各指标比较差异均无统计学意义（P > 0.050）。该实验结果显示，RYGB在治疗肥胖型T2DM上具有良好的降糖效果和减肥作用，此外，还能很好地改善T2DM大鼠的ISI和肥胖指数，可见改善血糖代谢和脂代谢是RYGB治疗T2DM的两个重要机理[9]。而血糖代谢异常和脂代谢异常是导致T2DM的重要机制，并且二者具有协同作用[10-13]。
Ghrelin与Visfatin是分别反映血糖代谢和脂代谢的重要因子。Ghrelin是Kojima等[14]发现的一种生长激素促泌素受体的内源性配体，是由胃黏膜下层的X/A样细胞合成和分泌的小分子脑肠肽。研究[15-16]表明，Ghrelin能够调节食物摄入、体质量和葡萄糖代谢，是T2DM发生的影响因素，并且影响糖尿病以及肥胖症的发病和病情进展。近期研究[17]表明，Ghrelin与肥胖程度密切相关。RYGB改变了消化道的生理结构后，胃排空加快，使摄入的营养物质提前与低位小肠接触，导致Ghrelin分泌增加，刺激小肠上的L细胞分泌胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）。Ghrelin分泌的增加同时能抑制胰岛素释放肽（glucose-dependent insulinotropic peptide，GIP）的分泌，该因子亦能通过下丘脑增加胰岛素分泌、胰岛素敏感性而改善血糖的代谢[18-19]。另外Ghrelin分泌的增加还会导致食欲降低，进食随之减少，遂能够达到长期控制体质量的效果[20-23]。Visfatin是新发现的由内脏脂肪细胞分泌的一种脂肪细胞因子，可结合并激活胰岛素受体的非胰岛素结合部位，激活胰岛素受体信号通路，从而模拟胰岛素作用，降低机体血糖。Visfatin与T2DM的发生密切相关，有促进脂肪组织分化、脂肪合成和积累的作用；其还能通过激活胰岛素受体信号通路，从而模拟胰岛素作用，降低血糖水平，并且能够结合并激活胰岛素受体，模拟胰岛素的作用。研究[24-26]显示，T2DM患者的血清Visfatin水平明显高于非糖尿病人群，且血清Visfatin水平与FBG水平呈正相关，是T2DM发生的危险因素。在将编码Visfatin基因的质粒转染到小鼠体内后，小鼠血糖和胰岛素水平均显著下降；而在敲除Visfatin基因的小鼠体内发现，血清Visfatin水平下降，血糖浓度水平升高[27-28]。本实验结果显示，RYGB组的Ghrelin水平在术后4周时，与术前相比有明显升高，并与ISI值呈正相关（r=0.771，P=0.003）；RYGB组的Visfatin水平在术后4周时，与术前相比较含量明显下降，并与肥胖指数呈负相关（r=-0.746，P=0.005）。
胃转流手术改变了消化道的正常生理结构，使进入胃部的食物排空加快，从而促进Ghrelin的分泌，Ghrelin分泌的增加最终促使胰岛素分泌，起到降低血糖的作用；同时手术使Visfatin水平得以恢复至正常，使脂肪积聚受到抑制，从而起到减肥作用。本实验结果提示，Ghrelin与Visfatin在RYGB治疗肥胖和T2DM的过程中，具有不可或缺的作用，为未来的新药开发提供了一定的理论基础。Ghrelin类似物或Visfatin拮抗剂的合成，以及两者的配合使用，将会是治疗T2DM患者的一项重要方法。
