引用本文： 李衍飞, 邵军, 王志鑫, 姚宝洪, 阳丹才让, 任利, 候立朝, 王海久, 周瀛, 温浩, 王虎, 樊海宁. 泡球蚴囊液对大鼠肝星状细胞TGF-β1、IL-6及TNF-α表达的影响. 中国普外基础与临床杂志, 2016, 23(12): 1500-1502. doi: 10.7507/1007-9424.20160378 复制
泡型肝包虫病是泡球蚴寄生于体内脏器后所引起的疾病，流行于广大牧区，危害极大。近年来对于泡型肝包虫病发生和发展的研究不断深入，然而有关泡球蚴囊液对肝星状细胞作用的相关报道很少见。研究[1]表明，大量的细胞因子参与泡球蚴感染后宿主肝脏的纤维化过程，起到保护宿主、抵抗虫体生长的作用。肝星状细胞的激活是肝纤维化形成初始的中心环节[2]，转化生长因子β1（TGF-β1）、白细胞介素6（IL-6）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）均在肝星状细胞活化及其后续参与的病理生理过程中发挥不同作用。本实验通过检测不同浓度泡球蚴囊液干预后大鼠肝星状细胞培养上清中TGF-β1、IL-6及TNF-α的浓度，以观察泡球蚴囊液对肝星状细胞分泌上述细胞因子能力的影响，初步探究泡型肝包虫病免疫调节作用的潜在机制。
1 材料与方法
1.1 主要材料及试剂
大鼠肝星状细胞株HSC-T6购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；泡球蚴囊液由新疆医科大学提供；大鼠TGF-β1酶联免疫检测试剂盒（70-E-EK3811）、IL-6酶联免疫检测试剂盒（70-E-EK3061）及TNF-α酶联免疫检测试剂盒（70-E-EK3821）均购自杭州联科生物科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
大鼠肝星状细胞株HSC-T6采用含10%胎牛血清、100 u/mL青霉素以及100 g/mL链霉素的DMEM培养液培养，在5% CO2、37 ℃的细胞培养箱中培养24 h后，吸取上清。
1.2.2 细胞上清中TGF-β1、IL-6以及TNF-α浓度的检测
以泡球蚴囊液中蛋白成分的浓度代表囊液浓度。将细胞接种于96孔板中（细胞数为3×105个/孔），孵育24 h后分别以0、0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.9、1.7、3.4、6.8以及13.5 mg/mL的泡球蚴囊液干预24 h后（每个浓度均设3个复孔），采用酶联免疫吸附法检测上清中TGF-β1、IL-6以及TNF-α浓度，操作均按试剂盒说明书进行。
1.3 统计学方法
采用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理与分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间均数比较采用方差分析，两两比较采LSD法。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 不同浓度泡球蚴囊液干预对大鼠HSC-T6细胞中TGF-β1表达的影响
不同浓度泡球蚴囊液干预大鼠HSC-T6细胞24 h后，上清中TGF-β1浓度存在一定程度的波动（图 1），但各浓度组间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。
图1
不同浓度泡球蚴囊液对上清中TGF-β1浓度的影响
2.2 不同浓度泡球蚴囊液干预对大鼠HSC-T6细胞中IL-6表达的影响
不同浓度泡球蚴囊液干预大鼠HSC-T6细胞24 h后，上清中IL-6浓度见图 2。由图 2可见，当泡球蚴囊液浓度≤3.4 mg/mL时，上清中IL-6的浓度趋于平稳，各浓度组间两两比较差异均无统计学意义（P > 0.05）；当泡球蚴囊液浓度为6.8和13.5 mg/mL时，IL-6浓度升高，分别为0 mg/mL组的3 028.65及3 879.23倍，且差异均有统计学意义（P < 0.01）。
图2
不同浓度泡球蚴囊液对上清中IL-6浓度的影响
2.3 不同浓度泡球蚴囊液干预对大鼠HSC-T6细胞中TNF-α表达的影响
不同浓度泡球蚴囊液干预大鼠HSC-T6细胞24 h后，上清中TNF-α浓度见图 3。由图 3可见，当泡球蚴囊液浓度≤0.2 mg/mL时，上清中的TNF-α浓度趋于平稳，各浓度组间两两比较差异均无统计学意义（P > 0.05）；当泡球蚴囊液浓度为0.4 mg/mL时，TNF-α浓度达到最大，为0 mg/mL组的3.53倍（P < 0.05）；此后随浓度增高TNF-α浓度又逐渐降低，但仍高于0 mg/mL组（P < 0.05）。
图3
不同浓度泡球蚴囊液对上清中TNF-α浓度的影响
3 讨论
泡型肝包虫病是由于泡状棘球绦虫幼虫寄生所致的一种人畜共患寄生虫病，分布于全世界各地。在我国，泡型肝包虫病主要分布于新疆维吾尔自治区、甘肃省、四川省、宁夏回族自治区、青海省、西藏自治区等地区，青海省与四川省交界的部分高原区是泡型肝包虫病的重灾区[3-5]。泡状棘球蚴主要寄生于肝脏（75%）[6-7]，呈恶性浸润性生长，可继发于肺和脑，故有“虫癌”之称，预后极差[7-10]。如未经及时治疗，其5年和10年死亡率分别高达70%和93% [11]，危害极大。目前对于泡球蚴所致肝损伤的发生机理尚不清楚。因此，本实验以肝星状细胞为切入点，探索相关细胞因子与泡球蚴所致肝损伤之间的联系，以期为后期研究奠定基础，发现更具体的相关机制。
泡球蚴所致的肝纤维化是肝脏细胞外基质作用的结果。肝星状细胞是肝脏细胞外基质的主要来源，在生理状态下主要调节细胞外基质的产生和降解[12-13]。当肝脏发生损伤时，受损细胞释放产物，激活肝星状细胞，从而促进TNF-α、IL-6等炎症因子的释放。研究[14-18]表明，TGF-β1和IL-6具有促进肝纤维化发展的作用，TNF-α具有促进肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）表达的能力[19-20]，而HGF的分泌对肝纤维化具有一定的抑制作用[21-22]。
有研究[23-24]表明，TGF-β1拮抗剂及CD147抗体的联合应用能够逆转肝纤维化，而肝星状细胞在肝纤维化中发挥重要作用，在某些肝脏疾病的治疗中也是重要的靶细胞。因此，研究肝星状细胞分泌的TGF-β1、IL-6、TNF-α等细胞因子在泡球蚴所致的肝脏损伤中的作用具有特别重要的现实意义。本实验结果表明，当泡球蚴囊液浓度 > 3.4 mg/mL时，肝星状细胞培养液上清中IL-6的浓度逐渐升高；当泡球蚴囊液浓度≥0.4 mg/mL时，TNF-α浓度均显著高于0 mg/mL组；而不同泡球蚴囊液浓度组中TGF-β1的浓度与0 mg/mL组比较差异均无统计学意义。故笔者推测：在一定泡球蚴囊液浓度的刺激下，肝星状细胞分泌的IL-6和TNF-α水平升高，但其对TGF-β1的分泌基本没有影响。
综上所述，笔者初步推测，IL-6和TNF-α的表达水平升高可能进一步导致肝脏炎症细胞浸润，放大炎症反应，加速肝纤维化的进程；而泡球蚴囊液对HSC-T6细胞中TGF-β1的表达无影响，可能是由于TGF-β1的表达因作用细胞的类型、分化程度、外环境及是否有其他生长因子作用而异。肝星状细胞的激活和增殖在泡型肝包虫病的发生中起重要作用，肝星状细胞分泌的IL-6和TNF-α在泡型肝包虫病的纤维化和组织损伤中扮演重要角色。但是，由于实验过程中难免存在偏倚，泡球蚴囊液干预下肝星状细胞的免疫学机制仍需在以后的研究中不断研究和探索。
泡型肝包虫病是泡球蚴寄生于体内脏器后所引起的疾病，流行于广大牧区，危害极大。近年来对于泡型肝包虫病发生和发展的研究不断深入，然而有关泡球蚴囊液对肝星状细胞作用的相关报道很少见。研究[1]表明，大量的细胞因子参与泡球蚴感染后宿主肝脏的纤维化过程，起到保护宿主、抵抗虫体生长的作用。肝星状细胞的激活是肝纤维化形成初始的中心环节[2]，转化生长因子β1（TGF-β1）、白细胞介素6（IL-6）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）均在肝星状细胞活化及其后续参与的病理生理过程中发挥不同作用。本实验通过检测不同浓度泡球蚴囊液干预后大鼠肝星状细胞培养上清中TGF-β1、IL-6及TNF-α的浓度，以观察泡球蚴囊液对肝星状细胞分泌上述细胞因子能力的影响，初步探究泡型肝包虫病免疫调节作用的潜在机制。
1 材料与方法
1.1 主要材料及试剂
大鼠肝星状细胞株HSC-T6购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；泡球蚴囊液由新疆医科大学提供；大鼠TGF-β1酶联免疫检测试剂盒（70-E-EK3811）、IL-6酶联免疫检测试剂盒（70-E-EK3061）及TNF-α酶联免疫检测试剂盒（70-E-EK3821）均购自杭州联科生物科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
大鼠肝星状细胞株HSC-T6采用含10%胎牛血清、100 u/mL青霉素以及100 g/mL链霉素的DMEM培养液培养，在5% CO2、37 ℃的细胞培养箱中培养24 h后，吸取上清。
1.2.2 细胞上清中TGF-β1、IL-6以及TNF-α浓度的检测
以泡球蚴囊液中蛋白成分的浓度代表囊液浓度。将细胞接种于96孔板中（细胞数为3×105个/孔），孵育24 h后分别以0、0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.9、1.7、3.4、6.8以及13.5 mg/mL的泡球蚴囊液干预24 h后（每个浓度均设3个复孔），采用酶联免疫吸附法检测上清中TGF-β1、IL-6以及TNF-α浓度，操作均按试剂盒说明书进行。
1.3 统计学方法
采用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理与分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间均数比较采用方差分析，两两比较采LSD法。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 不同浓度泡球蚴囊液干预对大鼠HSC-T6细胞中TGF-β1表达的影响
不同浓度泡球蚴囊液干预大鼠HSC-T6细胞24 h后，上清中TGF-β1浓度存在一定程度的波动（图 1），但各浓度组间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。
图1
不同浓度泡球蚴囊液对上清中TGF-β1浓度的影响
2.2 不同浓度泡球蚴囊液干预对大鼠HSC-T6细胞中IL-6表达的影响
不同浓度泡球蚴囊液干预大鼠HSC-T6细胞24 h后，上清中IL-6浓度见图 2。由图 2可见，当泡球蚴囊液浓度≤3.4 mg/mL时，上清中IL-6的浓度趋于平稳，各浓度组间两两比较差异均无统计学意义（P > 0.05）；当泡球蚴囊液浓度为6.8和13.5 mg/mL时，IL-6浓度升高，分别为0 mg/mL组的3 028.65及3 879.23倍，且差异均有统计学意义（P < 0.01）。
图2
不同浓度泡球蚴囊液对上清中IL-6浓度的影响
2.3 不同浓度泡球蚴囊液干预对大鼠HSC-T6细胞中TNF-α表达的影响
不同浓度泡球蚴囊液干预大鼠HSC-T6细胞24 h后，上清中TNF-α浓度见图 3。由图 3可见，当泡球蚴囊液浓度≤0.2 mg/mL时，上清中的TNF-α浓度趋于平稳，各浓度组间两两比较差异均无统计学意义（P > 0.05）；当泡球蚴囊液浓度为0.4 mg/mL时，TNF-α浓度达到最大，为0 mg/mL组的3.53倍（P < 0.05）；此后随浓度增高TNF-α浓度又逐渐降低，但仍高于0 mg/mL组（P < 0.05）。
图3
不同浓度泡球蚴囊液对上清中TNF-α浓度的影响
3 讨论
泡型肝包虫病是由于泡状棘球绦虫幼虫寄生所致的一种人畜共患寄生虫病，分布于全世界各地。在我国，泡型肝包虫病主要分布于新疆维吾尔自治区、甘肃省、四川省、宁夏回族自治区、青海省、西藏自治区等地区，青海省与四川省交界的部分高原区是泡型肝包虫病的重灾区[3-5]。泡状棘球蚴主要寄生于肝脏（75%）[6-7]，呈恶性浸润性生长，可继发于肺和脑，故有“虫癌”之称，预后极差[7-10]。如未经及时治疗，其5年和10年死亡率分别高达70%和93% [11]，危害极大。目前对于泡球蚴所致肝损伤的发生机理尚不清楚。因此，本实验以肝星状细胞为切入点，探索相关细胞因子与泡球蚴所致肝损伤之间的联系，以期为后期研究奠定基础，发现更具体的相关机制。
泡球蚴所致的肝纤维化是肝脏细胞外基质作用的结果。肝星状细胞是肝脏细胞外基质的主要来源，在生理状态下主要调节细胞外基质的产生和降解[12-13]。当肝脏发生损伤时，受损细胞释放产物，激活肝星状细胞，从而促进TNF-α、IL-6等炎症因子的释放。研究[14-18]表明，TGF-β1和IL-6具有促进肝纤维化发展的作用，TNF-α具有促进肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）表达的能力[19-20]，而HGF的分泌对肝纤维化具有一定的抑制作用[21-22]。
有研究[23-24]表明，TGF-β1拮抗剂及CD147抗体的联合应用能够逆转肝纤维化，而肝星状细胞在肝纤维化中发挥重要作用，在某些肝脏疾病的治疗中也是重要的靶细胞。因此，研究肝星状细胞分泌的TGF-β1、IL-6、TNF-α等细胞因子在泡球蚴所致的肝脏损伤中的作用具有特别重要的现实意义。本实验结果表明，当泡球蚴囊液浓度 > 3.4 mg/mL时，肝星状细胞培养液上清中IL-6的浓度逐渐升高；当泡球蚴囊液浓度≥0.4 mg/mL时，TNF-α浓度均显著高于0 mg/mL组；而不同泡球蚴囊液浓度组中TGF-β1的浓度与0 mg/mL组比较差异均无统计学意义。故笔者推测：在一定泡球蚴囊液浓度的刺激下，肝星状细胞分泌的IL-6和TNF-α水平升高，但其对TGF-β1的分泌基本没有影响。
综上所述，笔者初步推测，IL-6和TNF-α的表达水平升高可能进一步导致肝脏炎症细胞浸润，放大炎症反应，加速肝纤维化的进程；而泡球蚴囊液对HSC-T6细胞中TGF-β1的表达无影响，可能是由于TGF-β1的表达因作用细胞的类型、分化程度、外环境及是否有其他生长因子作用而异。肝星状细胞的激活和增殖在泡型肝包虫病的发生中起重要作用，肝星状细胞分泌的IL-6和TNF-α在泡型肝包虫病的纤维化和组织损伤中扮演重要角色。但是，由于实验过程中难免存在偏倚，泡球蚴囊液干预下肝星状细胞的免疫学机制仍需在以后的研究中不断研究和探索。
