引用本文： 何中林, 成正军. PKM2 在肝细胞肝癌中的表达及其与预后的关系. 中国普外基础与临床杂志, 2017, 24(2): 248-251. doi: 10.7507/1007-9424.201606005 复制
Warburg 效应是肿瘤细胞的重要特征，即在氧气充足的环境下，肿瘤细胞依然采用糖酵解进行能量代谢[1]。M2 型丙酮酸激酶（PKM2）是糖酵解的关键酶，在胚胎细胞和多种肿瘤细胞中高表达，在正常细胞中低表达或不表达，对肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移均有重要作用[2]。PKM2 表达与多种实体瘤的发生和预后均有密切关系，但其在肝细胞癌（以下简称“肝癌”）中的报道较少。本研究旨在研究 PKM2 蛋白在肝癌组织中的表达以及其与肝癌预后的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集 2008 年 1 月至 2011 年 1 月期间重庆市第九人民医院和重庆市九龙坡第二人民医院病理科存档的 225 例肝癌标本，其中 29 例不符合要求而被排除（17 例病理诊断为肝内胆管细胞癌，7 例失访，5 例为再次手术鴐，最终纳入术后病理明确诊断为肝癌患者 196 例。其中男 132 例，女 64 例；年龄 18～81 岁，平均年龄 58.6 岁，≤50岁者36例，>50岁者 160 例；TNM 分期：Ⅰ+Ⅱ 期 110 例，Ⅲ+Ⅳ 期 86例；分化程度：中-高分化 148 例，低分化 48 例；肿瘤数目：单结节肿瘤 102 例，多结节肿瘤 94 例；肿瘤最大直径：≤5 cm 者77例，>5 cm 者 119 例；肝硬化：无肝硬化 43 例，有肝硬化 153 例；甲胎蛋白（AFP）水平：≥400 μg/L 者 138 例，<400 μg/L 者 58 例；乙肝表面抗原：阳性 174 例，阴性 22 例。本研究中纳入患者均为首次手术者并获得知情同意且签署知情同意书，并且经重庆市第九人民医院和重庆市九龙坡第二人民医院伦理委员会审核批准。病理诊断结果经两名以上病理医师确认。
1.2 方法
1.2.1 免疫组织化学方法 ①主要试剂：PKM2 抗体购自 Abcam 公司（货号：ab38237鴐，SP 免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司（货号：SP9001鴐。②主要步骤：60 ℃ 烤片，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，3% H2O2 37 ℃ 孵育阻断灭活内源性过氧化物酶，枸橼酸缓冲液煮沸进行抗原修复，正常羊血清工作液封闭，滴加一抗（1∶100 稀释）4 ℃ 冰箱孵育过夜，滴加生物素标记二抗，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，DAB 染色，自来水充分冲洗后，苏木精复染，常规脱水，透明，干燥，封片。采用 PBS 代替一抗作为阴性对照，采用人子宫组织切片（ab4378）作为阳性对照。
1.2.2 结果判断 每例切片随机选取 5 个高倍镜视野进行结果判定，由两位经验丰富的病理科医师采用双盲法观察，免疫组织化学染色结果评分：①染色深度：无染色为 0 分，淡黄色为 1 分，黄或深黄色为 2 分，褐或棕褐色为 3 分；②阳性细胞数：阳性细胞数≤5% 计 0 分，6%～25% 计 1 分，26%～50% 计 2 分，51%～75% 计 3 分，>75%计 4 分。将两者得分相加，<4 分为 PKM2 蛋白低表达，≥4 分为 PKM2 蛋白高表达。
1.3 随访
所有患者均通过电话或门诊复查的方式进行随访，直至患者死亡或随访满 5 年患者，均具有完整随访资料，随访时间为 1～60 个月，中位随访时间为 25 个月。
1.4 统计学方法
采用 SPSS 19.0 统计学软件对数据进行分析，计数资料采用卡方检验，生存分析采用 Kaplan-Meier法，采用单因素及多因素 Cox 回归分析进行危险因素分析。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 PKM2 蛋白在肝癌组织中的表达及其与肝癌患者的临床病理特征的关系
PKM2 蛋白表达阳性染色主要定位于细胞浆，见图 1。有 129 例（65.8%）肝癌患者的肝癌组织中 PKM2 蛋白高表达，有 67 例（34.2%）肝癌患者的肝癌组织中 PKM2 蛋白低表达。肝癌组织中 PKM2蛋白表达与肝癌患者的性别（P=0.049鴐、肿瘤分化程度（P=0.000鴐、血清 AFP 水平（P=0.010鴐、肿瘤数目（P=0.002）及 TNM 分期（P=0.001）有关，而与患者的年龄、有无肝硬化、肿瘤最大直径及乙肝表面抗原无关（P>0.05鴐。见表 1。
图1
PKM2 蛋白在肝癌组织中的表达(SP ×400) a：阴性表达； b：阳性表达
表1
PKM2 蛋白表达与肝癌患者的临床病理特征的关系
2.2 PKM2蛋白在肝癌组织中的表达与肝癌患者预后的关系
1、3、5 年总体生存率在 PKM2 蛋白高表达患者中分别为 63.3%、32.6%、24.0%，明显低于其在 PKM2 低表达患者中的 85.1%、61.2%、52.2%，差异有统计学意义（P<0.05）；1、3、5 年无瘤生存率在 PKM2 高表达患者中分别为 52.7%、23.3%、14.7%，明显低于其在 PKM2 低表达患者中的 80.6%、52.2%、38.8%，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 2。
图2
PKM2 蛋白在肝癌组织中的表达与肝癌患者预后关系的生存曲线图 a：总体生存率； b：无瘤生存率
2.3 影响肝癌患者预后因素的分析结果
①单因素分析结果显示，肝癌患者的总体生存率与肿瘤的分化程度、肿瘤最大直径、肿瘤数目、 TNM 分期、乙肝表面抗原及 PKM2 蛋白表达有关（P<0.05鴐；肝癌患者的无瘤生存率与肿瘤的分化程度、肿瘤最大直径、TNM 分期、乙肝表面抗原及 PKM2 蛋白表达有关（P<0.05鴐。②多因素 Cox 回归分析结果显示，肿瘤的分化程度、TNM 分期及乙肝表面抗原与肝癌患者的总体生存率及无瘤生存率均有关（P<0.05鴐。③多因素 Cox 回归分析均显示 PKM2 蛋白表达是肝癌患者总体生存率（HR=1.661，P=0.024）及无瘤生存率（HR=1.662，P=0.013）的独立危险因素。见表 2、3。
表2
影响肝癌患者术后总体生存率的单因素及多因素 Cox 回归分析结果
表3
影响肝癌患者术后无瘤生存率的单因素及多因素 Cox 回归分析结果
3 讨论
早在 1930 年，德国生物化学家 Otto Warburg 发现癌细胞采用一种特殊的方式产生能量，即使在氧气充足的条件，大多数肿瘤细胞通过产能率相对较低的糖酵解作用为自身供能[3]。PKM2 为肿瘤细胞维持这种代谢方式的关键酶，同时又可作为蛋白激酶、转录因子等调控肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，是肿瘤代谢和细胞功能的重要纽带[4-6]。已有研究发现，PKM2与多种肿瘤的分化和预后密切相关。Zhang 等[7]对 86 例食管鳞状细胞癌进行免疫组织化学染色后发现，PKM2 在肿瘤的细胞浆和细胞核中均有表达，且明显高于其癌旁组织，细胞核中 PKM2 的表达与食管鳞状细胞癌生存时间呈明显的负相关；Zhan 等[8]的研究再次明确了 PKM2 与食管鳞状细胞癌的分化及预后的密切关系；后来相继有研究发现，PKM2 的表达与子宫内膜癌[9]、胃癌[10]等的预后均有关。
众多的基础研究发现，PKM2 可通过多种细胞分子机制参与肝癌的增殖、侵袭及转移。2011 年日本的 Kitamura 等[11]的研究发现，PKM2可改变肝癌的糖代谢状态，与肝癌的增殖能力有重要关系。PKM2 还可通过上调缺氧诱导因子-1α 和 Bcl-xL 的表达，从而促进肝癌细胞增殖[12]。PKM2 还可调节上皮间质化从而促进肝癌细胞的侵袭[4]。Liu等[13]发现，PKM2 可募集骨髓来源的抑制性细胞从而促进肝癌的转移。但 PKM2 的表达与肝癌患者的临床病理特征和预后的关系较少有报道。
本研究对 PKM2 的表达与肝癌患者的临床病理特征和预后的关系进行了研究，结果显示，肝癌组织中 PKM2 蛋白高表达率为 65.8%，阳性染色主要定位于细胞浆。肝癌组织中 PKM2 蛋白表达与肝癌患者的性别、肿瘤分化程度、血清 AFP 水平、肿瘤数目及 TNM 分期有关（P<0.05）；无论是总体生存率还是无瘤生存率，在 PKM2 蛋白高表达的患者中均低于其低表达的患者，且 PKM2 蛋白高表达是肝癌预后的独立危险因素（P<0.05）。中山大学[14]和复旦大学[15]也从临床的角度对 PKM2 表达与肝癌的关系进行了相关报道，均认为 PKM2 可单独或联合 TRIM35 作为判断肝癌预后的指标，本研究结果与之基本相符。但本研究中，PKM2 蛋白表达阳性率为 65.8%，高于中山大学和复旦大学（52.2%、32.6%）[14-15]，这种差异可能与患者的基线水平有关，在本研究中单结节肿瘤和Ⅰ～Ⅱ期的患者所占比例为 52.0%、56.1%，明显低于中山大学的 59.8%、51.8%[14]和复旦大学的 82.2%、79.2%[15]。
本研究的数据来自西南地区的基层医疗机构，可与国内大的医学中心发表的数据形成互补，通过不同人群、地域、不同肝癌基础特征的临床数据进一步验证了 PKM2 蛋白表达与肝癌预后的关系，PKM2 对肝癌细胞的生物学行为有重要影响，可作为判断肝癌预后的一个新的指标，但仍需要大样本的临床研究，进行更加深入的分子机制探索。
Warburg 效应是肿瘤细胞的重要特征，即在氧气充足的环境下，肿瘤细胞依然采用糖酵解进行能量代谢[1]。M2 型丙酮酸激酶（PKM2）是糖酵解的关键酶，在胚胎细胞和多种肿瘤细胞中高表达，在正常细胞中低表达或不表达，对肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移均有重要作用[2]。PKM2 表达与多种实体瘤的发生和预后均有密切关系，但其在肝细胞癌（以下简称“肝癌”）中的报道较少。本研究旨在研究 PKM2 蛋白在肝癌组织中的表达以及其与肝癌预后的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集 2008 年 1 月至 2011 年 1 月期间重庆市第九人民医院和重庆市九龙坡第二人民医院病理科存档的 225 例肝癌标本，其中 29 例不符合要求而被排除（17 例病理诊断为肝内胆管细胞癌，7 例失访，5 例为再次手术鴐，最终纳入术后病理明确诊断为肝癌患者 196 例。其中男 132 例，女 64 例；年龄 18～81 岁，平均年龄 58.6 岁，≤50岁者36例，>50岁者 160 例；TNM 分期：Ⅰ+Ⅱ 期 110 例，Ⅲ+Ⅳ 期 86例；分化程度：中-高分化 148 例，低分化 48 例；肿瘤数目：单结节肿瘤 102 例，多结节肿瘤 94 例；肿瘤最大直径：≤5 cm 者77例，>5 cm 者 119 例；肝硬化：无肝硬化 43 例，有肝硬化 153 例；甲胎蛋白（AFP）水平：≥400 μg/L 者 138 例，<400 μg/L 者 58 例；乙肝表面抗原：阳性 174 例，阴性 22 例。本研究中纳入患者均为首次手术者并获得知情同意且签署知情同意书，并且经重庆市第九人民医院和重庆市九龙坡第二人民医院伦理委员会审核批准。病理诊断结果经两名以上病理医师确认。
1.2 方法
1.2.1 免疫组织化学方法 ①主要试剂：PKM2 抗体购自 Abcam 公司（货号：ab38237鴐，SP 免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司（货号：SP9001鴐。②主要步骤：60 ℃ 烤片，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，3% H2O2 37 ℃ 孵育阻断灭活内源性过氧化物酶，枸橼酸缓冲液煮沸进行抗原修复，正常羊血清工作液封闭，滴加一抗（1∶100 稀释）4 ℃ 冰箱孵育过夜，滴加生物素标记二抗，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，DAB 染色，自来水充分冲洗后，苏木精复染，常规脱水，透明，干燥，封片。采用 PBS 代替一抗作为阴性对照，采用人子宫组织切片（ab4378）作为阳性对照。
1.2.2 结果判断 每例切片随机选取 5 个高倍镜视野进行结果判定，由两位经验丰富的病理科医师采用双盲法观察，免疫组织化学染色结果评分：①染色深度：无染色为 0 分，淡黄色为 1 分，黄或深黄色为 2 分，褐或棕褐色为 3 分；②阳性细胞数：阳性细胞数≤5% 计 0 分，6%～25% 计 1 分，26%～50% 计 2 分，51%～75% 计 3 分，>75%计 4 分。将两者得分相加，<4 分为 PKM2 蛋白低表达，≥4 分为 PKM2 蛋白高表达。
1.3 随访
所有患者均通过电话或门诊复查的方式进行随访，直至患者死亡或随访满 5 年患者，均具有完整随访资料，随访时间为 1～60 个月，中位随访时间为 25 个月。
1.4 统计学方法
采用 SPSS 19.0 统计学软件对数据进行分析，计数资料采用卡方检验，生存分析采用 Kaplan-Meier法，采用单因素及多因素 Cox 回归分析进行危险因素分析。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 PKM2 蛋白在肝癌组织中的表达及其与肝癌患者的临床病理特征的关系
PKM2 蛋白表达阳性染色主要定位于细胞浆，见图 1。有 129 例（65.8%）肝癌患者的肝癌组织中 PKM2 蛋白高表达，有 67 例（34.2%）肝癌患者的肝癌组织中 PKM2 蛋白低表达。肝癌组织中 PKM2蛋白表达与肝癌患者的性别（P=0.049鴐、肿瘤分化程度（P=0.000鴐、血清 AFP 水平（P=0.010鴐、肿瘤数目（P=0.002）及 TNM 分期（P=0.001）有关，而与患者的年龄、有无肝硬化、肿瘤最大直径及乙肝表面抗原无关（P>0.05鴐。见表 1。
图1
PKM2 蛋白在肝癌组织中的表达(SP ×400) a：阴性表达； b：阳性表达
表1
PKM2 蛋白表达与肝癌患者的临床病理特征的关系
2.2 PKM2蛋白在肝癌组织中的表达与肝癌患者预后的关系
1、3、5 年总体生存率在 PKM2 蛋白高表达患者中分别为 63.3%、32.6%、24.0%，明显低于其在 PKM2 低表达患者中的 85.1%、61.2%、52.2%，差异有统计学意义（P<0.05）；1、3、5 年无瘤生存率在 PKM2 高表达患者中分别为 52.7%、23.3%、14.7%，明显低于其在 PKM2 低表达患者中的 80.6%、52.2%、38.8%，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 2。
图2
PKM2 蛋白在肝癌组织中的表达与肝癌患者预后关系的生存曲线图 a：总体生存率； b：无瘤生存率
2.3 影响肝癌患者预后因素的分析结果
①单因素分析结果显示，肝癌患者的总体生存率与肿瘤的分化程度、肿瘤最大直径、肿瘤数目、 TNM 分期、乙肝表面抗原及 PKM2 蛋白表达有关（P<0.05鴐；肝癌患者的无瘤生存率与肿瘤的分化程度、肿瘤最大直径、TNM 分期、乙肝表面抗原及 PKM2 蛋白表达有关（P<0.05鴐。②多因素 Cox 回归分析结果显示，肿瘤的分化程度、TNM 分期及乙肝表面抗原与肝癌患者的总体生存率及无瘤生存率均有关（P<0.05鴐。③多因素 Cox 回归分析均显示 PKM2 蛋白表达是肝癌患者总体生存率（HR=1.661，P=0.024）及无瘤生存率（HR=1.662，P=0.013）的独立危险因素。见表 2、3。
表2
影响肝癌患者术后总体生存率的单因素及多因素 Cox 回归分析结果
表3
影响肝癌患者术后无瘤生存率的单因素及多因素 Cox 回归分析结果
3 讨论
早在 1930 年，德国生物化学家 Otto Warburg 发现癌细胞采用一种特殊的方式产生能量，即使在氧气充足的条件，大多数肿瘤细胞通过产能率相对较低的糖酵解作用为自身供能[3]。PKM2 为肿瘤细胞维持这种代谢方式的关键酶，同时又可作为蛋白激酶、转录因子等调控肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，是肿瘤代谢和细胞功能的重要纽带[4-6]。已有研究发现，PKM2与多种肿瘤的分化和预后密切相关。Zhang 等[7]对 86 例食管鳞状细胞癌进行免疫组织化学染色后发现，PKM2 在肿瘤的细胞浆和细胞核中均有表达，且明显高于其癌旁组织，细胞核中 PKM2 的表达与食管鳞状细胞癌生存时间呈明显的负相关；Zhan 等[8]的研究再次明确了 PKM2 与食管鳞状细胞癌的分化及预后的密切关系；后来相继有研究发现，PKM2 的表达与子宫内膜癌[9]、胃癌[10]等的预后均有关。
众多的基础研究发现，PKM2 可通过多种细胞分子机制参与肝癌的增殖、侵袭及转移。2011 年日本的 Kitamura 等[11]的研究发现，PKM2可改变肝癌的糖代谢状态，与肝癌的增殖能力有重要关系。PKM2 还可通过上调缺氧诱导因子-1α 和 Bcl-xL 的表达，从而促进肝癌细胞增殖[12]。PKM2 还可调节上皮间质化从而促进肝癌细胞的侵袭[4]。Liu等[13]发现，PKM2 可募集骨髓来源的抑制性细胞从而促进肝癌的转移。但 PKM2 的表达与肝癌患者的临床病理特征和预后的关系较少有报道。
本研究对 PKM2 的表达与肝癌患者的临床病理特征和预后的关系进行了研究，结果显示，肝癌组织中 PKM2 蛋白高表达率为 65.8%，阳性染色主要定位于细胞浆。肝癌组织中 PKM2 蛋白表达与肝癌患者的性别、肿瘤分化程度、血清 AFP 水平、肿瘤数目及 TNM 分期有关（P<0.05）；无论是总体生存率还是无瘤生存率，在 PKM2 蛋白高表达的患者中均低于其低表达的患者，且 PKM2 蛋白高表达是肝癌预后的独立危险因素（P<0.05）。中山大学[14]和复旦大学[15]也从临床的角度对 PKM2 表达与肝癌的关系进行了相关报道，均认为 PKM2 可单独或联合 TRIM35 作为判断肝癌预后的指标，本研究结果与之基本相符。但本研究中，PKM2 蛋白表达阳性率为 65.8%，高于中山大学和复旦大学（52.2%、32.6%）[14-15]，这种差异可能与患者的基线水平有关，在本研究中单结节肿瘤和Ⅰ～Ⅱ期的患者所占比例为 52.0%、56.1%，明显低于中山大学的 59.8%、51.8%[14]和复旦大学的 82.2%、79.2%[15]。
本研究的数据来自西南地区的基层医疗机构，可与国内大的医学中心发表的数据形成互补，通过不同人群、地域、不同肝癌基础特征的临床数据进一步验证了 PKM2 蛋白表达与肝癌预后的关系，PKM2 对肝癌细胞的生物学行为有重要影响，可作为判断肝癌预后的一个新的指标，但仍需要大样本的临床研究，进行更加深入的分子机制探索。
