引用本文： 李薛鑫, 刘健, 张德巍. 不同类型液体复苏对创伤失血性休克大鼠复苏后血清中 IL-8 与 TNF-α 的影响. 中国普外基础与临床杂志, 2017, 24(2): 174-178. doi: 10.7507/1007-9424.201606020 复制
创伤是导致人类死亡的重要因素，我国每年死于创伤的人数达 70 余万人，其中创伤失血性休克为首位致死因素[1]。有效的液体复苏是救治创伤失血性休克的关键。有研究[2-3]认为，创伤与免疫功能密切相关。因此，研究不同类型的复苏液在创伤失血性休克液体复苏过程中对免疫功能的影响对于创伤失血性休克的救治有着重大的意义。以往对于此问题的研究多偏向于对单一免疫指标的测定，且鲜有关注复苏时间的改变与不同复苏液的应用对于创伤失血性休克液体复苏中免疫功能的共同影响。本研究拟通过复制大鼠创伤失血性休克模型，观察不同类型复苏液在使用过程中不同时相创伤失血性休克大鼠血清中白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量情况，以探究不同复苏方式及不同种类的复苏液对创伤失血性休克大鼠液体复苏后免疫功能的影响，并希望本研究结果对临床工作能提供一定的参考价值。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
健康雄性SD大鼠 64 只，体质量 400～550 g，由中国医科大学实验动物中心提供。在实验温度（24±3）℃、湿度 50%～65% 条件下饲养 1 周，动物符合 SPF 级，实验前 12 h 禁食不禁水。实验动物采用摸球法随机分为 4 组，乳酸钠林格液限制性复苏组（晶体限制性复苏组）、羟乙基淀粉（盈源）限制性复苏组（胶体限制性复苏组）、浓氯化钠（7.5% 氯化钠液）限制性复苏组（浓氯化钠限制性复苏组）及羟乙基淀粉（盈源）非限制性复苏组（胶体非限制性复苏组），每组 16 只大鼠。
1.2 创伤失血性休克大鼠模型的制备
所有大鼠经 1% 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后置于 37% 恒温操作台，行左侧颈动脉置管术、右侧股动脉置管术，测量此时大鼠的血压。采取股骨创伤法：实验大鼠血压稳定 10 min 后，以 2 kg 铁轮自 30 cm 高固定滑道中落下，分别撞击麻醉后大鼠双侧下肢，同时监测平均动脉压降至 40 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）左右，加压包扎创面，减少其进一步出血。若平均动脉压不能达到 40 mm Hg，或持续高于该标准，即采用少量输液或颈动脉放血方法维持创伤失血性休克状态，此状态维持 1 h后开始复苏。
1.3 液体复苏步骤与方法
创伤失血性休克大鼠模型建立后 1 h 开始复苏，复苏标准为平均动脉压维持在 80～90 mm Hg。晶体限制性复苏组给予乳酸钠林格液 20 mL，胶体限制性复苏组给予羟乙基淀粉 20 mL，浓氯化钠限制性复苏组给予 7.5% 氯化钠溶液 2 mL（6 mL/kg），胶体非限制性复苏组给予羟乙基淀粉 40 mL。此过程中控制输液速度以 3 mL/min 为宜，严密观察大鼠生理状况，防止大鼠死亡。
1.4 标本的制备与采集
麻醉复苏后，将大鼠放回鼠笼，自由饮食。分别于复苏后第 2、6、12 及 24 h 时取各组实验大鼠（每个时相 4 只大鼠）腹主动脉血 5 mL 置于–20 ℃冰箱中备用，剖杀实验动物，终止实验。
1.5 检测各组大鼠腹主动脉血中 IL-8 及 TNF-α 的含量
采用固相夹心酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测各组大鼠腹主动脉血中 IL-8 及 TNF-α 的含量。以 IL-8 及 TNF-α 试剂盒标准稀释液按 1∶2 稀释标准品，绘制标准曲线。取标本腹主动脉血上清，做双孔检测，同时每组检测设置空白与标准各两孔。于 450 nm 处读取样品吸光度值，每孔测定 2 次，取均值，根据样品值通过标准曲线确定样品中 IL-8 及 TNF-α 含量。
1.6 统计学方法
采用 SPSS 21.0 统计软件对数据进行分析。数据以均数±标准差（ ±s）表示，每组分组因素的单独效应分析采用完全随机设计资料的方差分析，多重比较采用q 检验法。检验水准α=0.05。
2 结果
复苏后第 6 h 时，各限制性复苏组血清中IL-8及TNF-α 含量较复苏后第 2 h 时的相应指标均明显升高（P＜0.05），且均达最高峰，然后均开始下降；至复苏后第 12 h 时，各限制性复苏组 IL-8 及 TNF-α 含量继续呈下降趋势（P＜0.05）。非限制性复苏组不具有此变化趋势，本研究对此不做讨论。见表 1、2。
表1
限制性复苏与非限制性复苏各组中大鼠在复苏后不同时相时的血清中 IL-8 含量的比较（ng/L，
）
表2
限制性复苏与非限制性复苏各组中大鼠在复苏后不同时相时的血清中 TNF-α 含量的比较（ng/L，
）
非限制性复苏组各时相点血清中 IL-8 及 TNF-α 含量均明显高于各限制性复苏组相应时相点对应的指标（P<0.05）；同时，晶体限制性复苏组各时相点血清中 IL-8 及 TNF-α 含量又均明显低于胶体及浓氯化钠两种复苏液限制性复苏组各时相点对应的指标（P<0.05）。见表 1、2。
3 讨论
高能量创伤对机体组织的急性损伤会引发一系列的病理综合征，同时也可导致机体免疫系统紊乱，诱发各种炎症因子的释放[4-5]。有研究[6]表明，人体内含有各种炎症因子，包括促炎因子及抗炎因子，它们处于一种动态的平衡之中。发生创伤失血性休克时，机体产生的炎症反应是一个复杂的病理过程，病理检查可发现有大量炎症细胞的局部浸润和组织坏死，在这一过程中，一些细胞因子如 IL-8、TNF-α 等可促进炎症细胞的聚集、活化和炎症介质的释放，可直接刺激发热中枢引起全身发热，加重炎症症状，因此，对 IL-8 及 TNF-α 释放的监测对创伤失血性休克患者的救治及预后起着至关重要的作用[7-8]。
对于创伤失血性休克患者，临床上传统的救治理念是早期快速足量输注复苏液，恢复重要器官的血流灌注，防止休克的进一步发展，但这一理念目前正在逐步被限制性液体复苏所取代[9-10]。有文献[11]报道，创伤失血性休克患者早期未经液体复苏时，血浆内促炎因子的大量释放会导致机体免疫系统的损伤，甚至诱导多器官功能障碍综合征及全身炎症反应综合征的发生。然而早期非限制性复苏液输入则会导致血浆内抗炎因子的大量释放并使得机体处于一种免疫麻痹状态，并引起代偿性抗炎反应综合征，反而使得机体的炎症反应进一步加重[12]。其原因可能是，早期足量液体的输注，使得创伤失血性休克大鼠体内的促炎因子及抗炎因子的动态平衡被打破，加重了机体免疫系统的负担，从而使机体的免疫系统不能有效地发挥其正常的免疫功能。本研究结果发现，限制性液体复苏对于创伤失血性休克大鼠体内 IL-8 及 TNF-α 的控制要远远优于非限制性复苏组，且在晶体、胶体及浓氯化钠3种限制性液体复苏组中，实验大鼠血清中IL-8及TNF-α 含量的变化均呈现出一种先升高再降低的趋势，分析其原因为限制性液体复苏对于实验大鼠体内促炎因子及抗炎因子动态平衡的维持会使得大鼠体内血细胞因子的变化呈现先升高再降低趋势，这也是其有效抑制血液中 IL-8 及 TNF-α 释放的重要原因。有资料[13-14]显示，在组织损伤初期，TNF-α 作为一种单核巨噬细胞产生的细胞毒性蛋白会迅速升高，而 IL-8 又称中性粒细胞激活蛋白质，它的产生主要得益于 TNF-α 在炎症初期的诱导，这种趋势的出现可能是因为 TNF-α 作为整个炎症级联反应的始发因子，会刺激 IL-8 等一系列炎症因子的释放，扩大其生物学效应。因此，在创伤失血性休克初期，体内促炎因子大量释放，抗炎因子与促炎因子的动态平衡被打破，而复苏液的限制性输注，则会迅速促使机体的促炎因子及抗炎因子的动态平衡得以恢复，同时降低了体内炎症因子的含量。
在本研究的晶体、胶体及浓氯化钠 3 种限制性液体复苏组中，晶体液限制性复苏组相比其他两种复苏液能更明显抑制大鼠体内血清中 IL-8 和 TNF-α 因子的释放，其原因可能是，在创伤失血性休克早期，晶体液对于补充丢失的细胞外液是非常适当而有效的[15-16]。早期晶体液限制性的摄入，能迅速建立循环，减少再灌注时氧自由基等活性氧成分的产生，从而改善免疫反应；同时适量的晶体液输入还可以降低毛细血管通透性，更有利于血浆容量的维持和氧合的改善，减少白细胞渗出，抑制白细胞的黏附，有效地阻止创伤组织的缺血再灌注损伤，对创伤失血性休克大鼠机体恢复到正常状态起到十分重要的作用[17-19]。临床研究[20-21]显示，对于创伤失血性休克的患者早期限制性输注林格液，能有效纠正脱水和低钠血症，扩充细胞外液的数量，同时也具有良好的肾功能保护作用，这也可能是使得细胞因子受到有效抑制的原因。本研究结果中，浓氯化钠限制性复苏组和胶体限制性复苏组也可以在一定程度上减少 IL-8 和 TNF-α 因子的释放。这可能是因为 7.5% 氯化钠可产生 2 400 mmol/L 的渗透压，相当于正常血浆渗透压的 8 倍，通过提高血清钠和血清渗透压，产生的渗透压梯度可以将细胞内和组织间隙的水分迅速向血管内转移，从而减轻组织水肿[22-24]。而胶体液则可以通过下调转录因子核因子 κB 和转录激活因子 1 的水平来减少休克状态下炎症反应和氧化应激的发生[25-26]。然而与晶体液相比，它们并不具有与细胞外液近似的电解质成分及渗透压，这可能是本研究中晶体液限制性复苏组相比其他两种复苏液能更明显抑制大鼠体内血清中 IL-8 和 TNF-α 因子释放的原因。
对于创伤失血性休克患者的救治，采取何种类型的液体复苏一直以来广受争议。本研究结果显示，限制性液体复苏对于创伤失血性休克状态的改善要明显优于非限制性液体复苏；同时，在限制性复苏方式中，采用晶体复苏液比采用浓氯化钠和羟乙基淀粉两种复苏液更能有效抑制大鼠体内 IL-8 和 TNF-α 的释放。结果提示，限制性晶体复苏液的使用对于创伤失血性休克的治疗及预后可能具有相对良好的效果。
创伤是导致人类死亡的重要因素，我国每年死于创伤的人数达 70 余万人，其中创伤失血性休克为首位致死因素[1]。有效的液体复苏是救治创伤失血性休克的关键。有研究[2-3]认为，创伤与免疫功能密切相关。因此，研究不同类型的复苏液在创伤失血性休克液体复苏过程中对免疫功能的影响对于创伤失血性休克的救治有着重大的意义。以往对于此问题的研究多偏向于对单一免疫指标的测定，且鲜有关注复苏时间的改变与不同复苏液的应用对于创伤失血性休克液体复苏中免疫功能的共同影响。本研究拟通过复制大鼠创伤失血性休克模型，观察不同类型复苏液在使用过程中不同时相创伤失血性休克大鼠血清中白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量情况，以探究不同复苏方式及不同种类的复苏液对创伤失血性休克大鼠液体复苏后免疫功能的影响，并希望本研究结果对临床工作能提供一定的参考价值。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
健康雄性SD大鼠 64 只，体质量 400～550 g，由中国医科大学实验动物中心提供。在实验温度（24±3）℃、湿度 50%～65% 条件下饲养 1 周，动物符合 SPF 级，实验前 12 h 禁食不禁水。实验动物采用摸球法随机分为 4 组，乳酸钠林格液限制性复苏组（晶体限制性复苏组）、羟乙基淀粉（盈源）限制性复苏组（胶体限制性复苏组）、浓氯化钠（7.5% 氯化钠液）限制性复苏组（浓氯化钠限制性复苏组）及羟乙基淀粉（盈源）非限制性复苏组（胶体非限制性复苏组），每组 16 只大鼠。
1.2 创伤失血性休克大鼠模型的制备
所有大鼠经 1% 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后置于 37% 恒温操作台，行左侧颈动脉置管术、右侧股动脉置管术，测量此时大鼠的血压。采取股骨创伤法：实验大鼠血压稳定 10 min 后，以 2 kg 铁轮自 30 cm 高固定滑道中落下，分别撞击麻醉后大鼠双侧下肢，同时监测平均动脉压降至 40 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）左右，加压包扎创面，减少其进一步出血。若平均动脉压不能达到 40 mm Hg，或持续高于该标准，即采用少量输液或颈动脉放血方法维持创伤失血性休克状态，此状态维持 1 h后开始复苏。
1.3 液体复苏步骤与方法
创伤失血性休克大鼠模型建立后 1 h 开始复苏，复苏标准为平均动脉压维持在 80～90 mm Hg。晶体限制性复苏组给予乳酸钠林格液 20 mL，胶体限制性复苏组给予羟乙基淀粉 20 mL，浓氯化钠限制性复苏组给予 7.5% 氯化钠溶液 2 mL（6 mL/kg），胶体非限制性复苏组给予羟乙基淀粉 40 mL。此过程中控制输液速度以 3 mL/min 为宜，严密观察大鼠生理状况，防止大鼠死亡。
1.4 标本的制备与采集
麻醉复苏后，将大鼠放回鼠笼，自由饮食。分别于复苏后第 2、6、12 及 24 h 时取各组实验大鼠（每个时相 4 只大鼠）腹主动脉血 5 mL 置于–20 ℃冰箱中备用，剖杀实验动物，终止实验。
1.5 检测各组大鼠腹主动脉血中 IL-8 及 TNF-α 的含量
采用固相夹心酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测各组大鼠腹主动脉血中 IL-8 及 TNF-α 的含量。以 IL-8 及 TNF-α 试剂盒标准稀释液按 1∶2 稀释标准品，绘制标准曲线。取标本腹主动脉血上清，做双孔检测，同时每组检测设置空白与标准各两孔。于 450 nm 处读取样品吸光度值，每孔测定 2 次，取均值，根据样品值通过标准曲线确定样品中 IL-8 及 TNF-α 含量。
1.6 统计学方法
采用 SPSS 21.0 统计软件对数据进行分析。数据以均数±标准差（ ±s）表示，每组分组因素的单独效应分析采用完全随机设计资料的方差分析，多重比较采用q 检验法。检验水准α=0.05。
2 结果
复苏后第 6 h 时，各限制性复苏组血清中IL-8及TNF-α 含量较复苏后第 2 h 时的相应指标均明显升高（P＜0.05），且均达最高峰，然后均开始下降；至复苏后第 12 h 时，各限制性复苏组 IL-8 及 TNF-α 含量继续呈下降趋势（P＜0.05）。非限制性复苏组不具有此变化趋势，本研究对此不做讨论。见表 1、2。
表1
限制性复苏与非限制性复苏各组中大鼠在复苏后不同时相时的血清中 IL-8 含量的比较（ng/L，
）
表2
限制性复苏与非限制性复苏各组中大鼠在复苏后不同时相时的血清中 TNF-α 含量的比较（ng/L，
）
非限制性复苏组各时相点血清中 IL-8 及 TNF-α 含量均明显高于各限制性复苏组相应时相点对应的指标（P<0.05）；同时，晶体限制性复苏组各时相点血清中 IL-8 及 TNF-α 含量又均明显低于胶体及浓氯化钠两种复苏液限制性复苏组各时相点对应的指标（P<0.05）。见表 1、2。
3 讨论
高能量创伤对机体组织的急性损伤会引发一系列的病理综合征，同时也可导致机体免疫系统紊乱，诱发各种炎症因子的释放[4-5]。有研究[6]表明，人体内含有各种炎症因子，包括促炎因子及抗炎因子，它们处于一种动态的平衡之中。发生创伤失血性休克时，机体产生的炎症反应是一个复杂的病理过程，病理检查可发现有大量炎症细胞的局部浸润和组织坏死，在这一过程中，一些细胞因子如 IL-8、TNF-α 等可促进炎症细胞的聚集、活化和炎症介质的释放，可直接刺激发热中枢引起全身发热，加重炎症症状，因此，对 IL-8 及 TNF-α 释放的监测对创伤失血性休克患者的救治及预后起着至关重要的作用[7-8]。
对于创伤失血性休克患者，临床上传统的救治理念是早期快速足量输注复苏液，恢复重要器官的血流灌注，防止休克的进一步发展，但这一理念目前正在逐步被限制性液体复苏所取代[9-10]。有文献[11]报道，创伤失血性休克患者早期未经液体复苏时，血浆内促炎因子的大量释放会导致机体免疫系统的损伤，甚至诱导多器官功能障碍综合征及全身炎症反应综合征的发生。然而早期非限制性复苏液输入则会导致血浆内抗炎因子的大量释放并使得机体处于一种免疫麻痹状态，并引起代偿性抗炎反应综合征，反而使得机体的炎症反应进一步加重[12]。其原因可能是，早期足量液体的输注，使得创伤失血性休克大鼠体内的促炎因子及抗炎因子的动态平衡被打破，加重了机体免疫系统的负担，从而使机体的免疫系统不能有效地发挥其正常的免疫功能。本研究结果发现，限制性液体复苏对于创伤失血性休克大鼠体内 IL-8 及 TNF-α 的控制要远远优于非限制性复苏组，且在晶体、胶体及浓氯化钠3种限制性液体复苏组中，实验大鼠血清中IL-8及TNF-α 含量的变化均呈现出一种先升高再降低的趋势，分析其原因为限制性液体复苏对于实验大鼠体内促炎因子及抗炎因子动态平衡的维持会使得大鼠体内血细胞因子的变化呈现先升高再降低趋势，这也是其有效抑制血液中 IL-8 及 TNF-α 释放的重要原因。有资料[13-14]显示，在组织损伤初期，TNF-α 作为一种单核巨噬细胞产生的细胞毒性蛋白会迅速升高，而 IL-8 又称中性粒细胞激活蛋白质，它的产生主要得益于 TNF-α 在炎症初期的诱导，这种趋势的出现可能是因为 TNF-α 作为整个炎症级联反应的始发因子，会刺激 IL-8 等一系列炎症因子的释放，扩大其生物学效应。因此，在创伤失血性休克初期，体内促炎因子大量释放，抗炎因子与促炎因子的动态平衡被打破，而复苏液的限制性输注，则会迅速促使机体的促炎因子及抗炎因子的动态平衡得以恢复，同时降低了体内炎症因子的含量。
在本研究的晶体、胶体及浓氯化钠 3 种限制性液体复苏组中，晶体液限制性复苏组相比其他两种复苏液能更明显抑制大鼠体内血清中 IL-8 和 TNF-α 因子的释放，其原因可能是，在创伤失血性休克早期，晶体液对于补充丢失的细胞外液是非常适当而有效的[15-16]。早期晶体液限制性的摄入，能迅速建立循环，减少再灌注时氧自由基等活性氧成分的产生，从而改善免疫反应；同时适量的晶体液输入还可以降低毛细血管通透性，更有利于血浆容量的维持和氧合的改善，减少白细胞渗出，抑制白细胞的黏附，有效地阻止创伤组织的缺血再灌注损伤，对创伤失血性休克大鼠机体恢复到正常状态起到十分重要的作用[17-19]。临床研究[20-21]显示，对于创伤失血性休克的患者早期限制性输注林格液，能有效纠正脱水和低钠血症，扩充细胞外液的数量，同时也具有良好的肾功能保护作用，这也可能是使得细胞因子受到有效抑制的原因。本研究结果中，浓氯化钠限制性复苏组和胶体限制性复苏组也可以在一定程度上减少 IL-8 和 TNF-α 因子的释放。这可能是因为 7.5% 氯化钠可产生 2 400 mmol/L 的渗透压，相当于正常血浆渗透压的 8 倍，通过提高血清钠和血清渗透压，产生的渗透压梯度可以将细胞内和组织间隙的水分迅速向血管内转移，从而减轻组织水肿[22-24]。而胶体液则可以通过下调转录因子核因子 κB 和转录激活因子 1 的水平来减少休克状态下炎症反应和氧化应激的发生[25-26]。然而与晶体液相比，它们并不具有与细胞外液近似的电解质成分及渗透压，这可能是本研究中晶体液限制性复苏组相比其他两种复苏液能更明显抑制大鼠体内血清中 IL-8 和 TNF-α 因子释放的原因。
对于创伤失血性休克患者的救治，采取何种类型的液体复苏一直以来广受争议。本研究结果显示，限制性液体复苏对于创伤失血性休克状态的改善要明显优于非限制性液体复苏；同时，在限制性复苏方式中，采用晶体复苏液比采用浓氯化钠和羟乙基淀粉两种复苏液更能有效抑制大鼠体内 IL-8 和 TNF-α 的释放。结果提示，限制性晶体复苏液的使用对于创伤失血性休克的治疗及预后可能具有相对良好的效果。
