引用本文： 赵大江, 李同昌, 王彪, 段秀庆. 模拟微重力培养对大鼠甲状旁腺细胞形态及分泌功能的影响. 中国普外基础与临床杂志, 2017, 24(2): 179-184. doi: 10.7507/1007-9424.201606022 复制
甲状旁腺移植治疗甲状旁腺功能减退症的研究已历经百年的探索和尝试，国内外许多医院都在开展对此种治疗方法的研究，并已试用于临床，且取得了良好的近期效果。然而足够数量和功能良好的甲状旁腺细胞是保证移植成功的关键。目前，甲状旁腺细胞的培养依然局限于二维平面培养的方式。因此，本研究在旋转细胞培养系统（rotary cell culture system，RCCS）提供的模拟微重力环境下三维培养甲状旁腺细胞，研究其形态和分泌功能，以便探索甲状旁腺细胞更为优良的培养技术。
1 材料与方法
1.1 主要实验材料
雄性 Wistar 大鼠，37 只，体质量 150～200 g，由哈尔滨医科大学第一附属医院实验动物中心提供。细胞支架：聚羟基乙酸（polyglycolic acid，PGA）购于美国 Synthecon 公司。RCCS-L 型回转式生物反应器购自 Synthecon 公司。胎牛血清购于浙江天杭生物科技有限公司。RPMI-1640 培养基、胶原酶 Ⅱ、吖啶橙及碘化丙啶购于 Sigma 公司。
1.2 大鼠甲状旁腺组织的切取[1 ]
1% 戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉。仰卧位，颈胸部备皮，常规碘伏消毒。于颈部正中纵行切开皮肤，钝性分离颈前组织，向两侧牵开颈前肌群，显露气管及双侧甲状腺，于 10 倍解剖显微镜下仔细观察辨认，甲状腺组织为暗红色，呈蝴蝶状位于甲状软骨和气管环两侧，钝性分离胸骨甲状肌，可见呈乳白色或灰白色的组织，即为甲状旁腺，显微剪剪下后经病理证实。
1.3 大鼠甲状旁腺细胞的培养
将手术切取并经病理检测证实的甲状旁腺组织用 4 ℃ 含双抗(青霉素 100 U/mL，链霉素 100 μg/mL)的 RPMI-1640 培养基反复吹打漂洗 2 次，吸弃培养基，用显微剪将甲状旁腺组织剪碎成糊状移入 10 mL 离心管中，加入 2 mL 0.25% 胶原酶 Ⅱ 后在 38 ℃ 恒温水浴中振荡消化 20 min。然后用含 20% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养液 2 mL终止消化。用 100 目无菌不锈钢网过滤后离心去上清，沉淀物加入含 20% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养瓶中，调整细胞浓度为1×105个细胞/mL。同时，用台盼蓝染色计数细胞活力，细胞存活率>95%。将培养瓶置于 37 ℃含 5% CO2 和 95% 空气的恒温培养箱中培养。
1.4 PGA支架的预处理
将 PGA 支架剪切成规格为 5 mm×4 mm×1 mm 大小的小块，漂洗干净，75% 乙醇浸泡 30 min，然后取出用无菌 PBS 洗涤 3 次后，自然晾干，备用。
1.5 实验分组及处理
将经胶原酶 Ⅱ 消化获取的甲状旁腺细胞，根据培养条件不同，分为 3 组。
1.5.1 普通培养组 单纯甲状旁腺细胞静置培养。取 2 mL 浓度为 1×105个细胞/mL 的原代甲状旁腺细胞悬液移入 10 mL 培养瓶中，置于 37 ℃ 含 5% CO2 和 95% 空气的恒温培养箱中培养。
1.5.2 PGA 支架培养组 甲状旁腺细胞接种在 PGA 支架上静置培养。接种培养前，先将固定规格的 PGA 支架置于含 20% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养液中孵育过夜。接种时，将已预湿的 PGA 支架置于 6 孔培养板中，取 2 mL 密度为 1×105个细胞/mL 的细胞悬液，再用吸管将其缓慢逐滴均匀地滴加于 4 块 PGA 支架材料上。将此 6 孔培养板置于 37 ℃ 含 5% CO2 和 95% 空气的恒温培养箱中培养。
1.5.3 微重力培养组 甲状旁腺细胞和 PGA 支架在模拟微重力环境中共培养。取 10 mL 密度为 1×105个细胞/mL 的甲状旁腺细胞悬液，将事先已预湿的 20 块 PGA 支架置于上述细胞悬液中，轻轻混匀，在 CO2 培养箱中预孵育 30 min。取容积为 10 mL 的 RCCS-L 型回转式生物反应器，在无菌条件下安装备好。关闭两个取样孔阀门，经注液孔缓缓注入已孵育的含 PGA 支架的细胞悬液，充满整个容器。去除容器中所有气泡，将微重力装置放于培养箱中，调节转速，以载体不接触容器各壁为宜。
1.6 观测指标
1.6.1 观察细胞形态 分别于细胞培养第 1、3、5 和 7 天时用相差倒置显微镜观察各组细胞的生长形态。
1.6.2 测定细胞分泌功能 在无菌技术下，于细胞培养第 1、3、5、7 天时离心获得各组培养细胞的上清液 1～2 mL，装入EP管，贴好标签，放–20 ℃冰箱中保存，待统一融化检测甲状旁腺激素（PTH）水平。
1.6.3 细胞活性测定 取 0.01 mL 吖啶橙储液与 1 mL 碘化丙啶储液混合，加 9 mL PBS 稀释 10 倍，混匀，取适量与培养第 1、3、5、7 天的甲状旁腺细胞（离心所得）混合，培养箱中孵育 5 min 后，在共聚焦荧光显微镜下，用 490 nm 激发光滤光片，510 nm 光栅滤光片可同时见到绿色（吖啶橙）和红色（碘化丙啶）荧光。活细胞显绿色，死细胞显红色。细胞存活率=（绿色荧光细胞/红色荧光细胞+绿色荧光细胞）×100%。每份样本重复计算 4 次，取其平均值。
1.7 统计学方法
采用 Sigmplot 软件对数据进行分析。实验数据以均数±标准差（ ）表示；组间比较行独立样本t 检验，组内比较行配对样本t 检验，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 甲状旁腺细胞的生长形态观察结果
2.1.1 普通培养组 培养后第 1 天时，细胞绝大部分附于培养瓶底面，呈现明显的聚集性，少量单个细胞悬浮在培养液中；第 3 天时，细胞已贴壁生长，大部分细胞团周边的细胞明显延展，少数单个贴壁细胞仍呈圆形，匀质且透明；第 5 天时，几乎所有细胞已延展，细胞相互接壤成片，呈多角形或星形，核圆，居中，呈现上皮细胞的形态特征；第 7 天时，大部分细胞形态良好，部分细胞团中心出现白色坏死灶，培养液中悬浮细胞及细胞碎片较前增多，并可见少量成纤维细胞贴壁生长。见图 1。
图1
普通培养组培养后不同时相下细胞形态观察结果（相差倒置显微镜 ×100） a：第 5 天；b：第 7 天
2.1.2 PGA 支架培养组 细胞接种于 PGA 支架上第 1 天时，见网状支架表面不少细胞附着，少量单个细胞进入支架空隙内部，6 孔培养板底部亦可见大量细胞；第 3 天时，支架表面及内部细胞未见延展，仍呈圆形，板底面的细胞已开始呈放射状延展，轻轻晃动培养板，细胞无游离支架现象；第 5 天时，细胞在支架上附着牢固，少数细胞开始沿支架向两极延伸，细胞呈短梭形或多角形，板底面的细胞已充分延展；第 7 天时，支架上大部分细胞沿 PGA 纤维纵轴方向向两极伸展，相邻支架被细胞外基质连接。见图 2。
图2
PGA支架培养组培养后不同时相下细胞形态观察结果（相差倒置显微镜 ×200） a：第 5 天；b：第 7 天
2.1.3 微重力培养组 在微重力环境中培养后第 1 天时，见大量细胞散布在 PGA 纤维网状支架表面及空隙中，以支架边缘附着的细胞密集，细胞呈圆形；第 3 天时，PGA 支架上黏附的细胞数较前明显增加，均匀分布于支架表面和内部，细胞与支架黏附较为紧密，开始聚集成团，未见细胞延展；第 5 天时，支架表面和空隙中细胞密布，在不同的焦距下均清晰可见不同的细胞，细胞仍呈圆形，大量聚集成团；第 7 天时，细胞团较前增大增多，可见少量细胞碎片开始游离出来。见图 3。
图3
微重力培养组培养后不同时相下细胞形态观察结果（相差倒置显微镜 ×200） a：第 5 天；b：第 7 天
2.2 各组细胞培养液中 PTH 值测定结果
各组细胞培养液中 PTH 值检测结果见表 1。从表 1 可见，培养后第 1 天时，普通培养组和 PGA 支架培养组的 PTH 值比较差异无统计学意义（P>0.05），微重力培养组的 PTH 值明显高于普通培养组（P<0.05）；培养后第 3、5 及 7 天时，PGA 支架培养组和微重力培养组的 PTH 值均明显高于普通培养组（P<0.05），微重力培养组的 PTH 值明显高于 PGA 支架培养组（P<0.05）。
表1
培养不同时相后各组细胞培养液中 PTH 值比较（ng/L，
）
2.3 各组细胞活性测定结果
各组细胞活性检测结果见图 4 和表 2。从表 2 可见，培养后第 1 天时，各组之间比较差异均无统计学意义（P>0.05）；培养后第 3、5 天时，普通培养组与 PGA 支架培养组间比较差异无统计学意义（P>0.05），微重力培养组的细胞存活率明显高于普通培养组（P<0.05）和 PGA 支架培养组（P<0.05）；培养后第 7 天时，PGA 支架培养组和微重力培养组的细胞存活率均明显高于普通培养组（P<0.05），且微重力培养组的细胞存活率明显高于 PGA 支架培养组（P<0.05）。
表2
培养不同时相后各组细胞存活率比较（%，
）
图4
不同培养环境下培养至第 5 天时的细胞形态观察结果（荧光显微镜 ×200） a：普通培养组，细胞存活率为 80.4%；b：微重力培养组，细胞存活率为 89.1%
3 讨论
甲状旁腺移植是甲状旁腺功能减退患者获得生理性血钙水平的理想途径[2]。 随着细胞、生物材料、移植免疫等技术的进步，甲状旁腺移植的方法和疗效都取得了较大的进展[3-4]。但如何找到充足的移植来源、降低移植物的免疫原性以及延长移植后移植组织的存活时间，一直是困扰外科医生的核心问题[5]。目前，甲状旁腺细胞的培养依然局限于二维平面培养的方式，本研究在 RCCS 提供的模拟微重力环境下三维培养甲状旁腺细胞，而微重力组织工程的核心技术是建立动物细胞的三维培养体系[6]。
模拟微重力环境对动物细胞的体外培养有如下优点[7-12]：① 培养液对细胞的机械剪切力小。② 正常的重力向量被持续随机化，可能直接或间接地促进细胞的自分泌以及旁分泌，也可能对细胞基因表达产生影响，更加有利于细胞与细胞之间信号的转导。③ 细胞生长在三维空间中，不易形成中心坏死，对维持细胞正常功能具有重要作用。④ 具有高保真度的优点。⑤ 在微重力培养条件下，细胞、支架和培养液在类似自由落体的状态下运动，细胞和支架载体形成一种持续动态的接种，悬浮着的细胞可以不断有机会与支架接触而黏附，从而使细胞在载体表面及载体内部产生较均匀的分布。而静置培养时，由于培养容器中的培养液无法动态混合，支架内部代谢废物不易排出，容易在局部蓄积，使局部环境的 pH 值发生变化，另外，营养物质和氧气也难以输送给中心部位的细胞，因此，中心部位细胞极易发生生长停滞或死亡。
本研究结果发现，普通培养组的细胞在培养第 3 天时已经开始延展，第 5 天时几乎所有细胞都已伸展，呈现多角形或星形；PGA支架培养组细胞于培养第 5 天时开始沿支架向两极延伸，呈现短梭形或多角形，第 7 天时，支架上细胞大部分沿 PGA 纤维纵轴方向向两极伸展；而微重力培养组的细胞在培养第 7 天时细胞仍呈圆形，聚集成团，并逐渐增大。细胞相互聚集成团，有利于细胞与细胞之间的信号传递，更加有利于细胞外基质在细胞周围的固守，而细胞外基质能对细胞的增殖分化、生长代谢发挥巨大的调节作用，从而为细胞的生长代谢及功能发挥创造更加适宜的微环境[13]。细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的联系调控细胞骨架蛋白基因的表达，从而使细胞呈现不同的形态，而细胞的形态与细胞功能密切相关[14]。
本研究中，在细胞培养的第 1、3、5、7 天时，取适量细胞进行吖啶橙和碘化丙啶染色，检测细胞存活情况，结果显示，除第 1 天外，微重力培养组细胞存活率均明显高于 PGA 支架培养组（P<0.05）和普通培养组（P<0.05），且PTH值也均明显高于PGA支架培养组和普通培养组（P<0.05）。PGA 支架培养组细胞培养液中 PTH 浓度均明显高于普通培养组。我们认为，可能由于普通培养组是二维培养，营养物质的吸收及代谢废物的排出受到了限制，加速了甲状旁腺细胞的死亡；而 PGA 支架培养组的细胞由于有了 PGA 支架的支持和维护，使细胞成三维立体生长，而三维培养更加有利于营养成分的吸收和气体的交换以及代谢废物的排出，所以与普通培养组相比，支架组甲状旁腺细胞的活性较强，细胞存活率高于普通培养组。同时我们还发现，各培养组细胞分泌峰值均是在培养后的第 5 天，第 7 天开始下降，由此推测培养 5 d 的甲状旁腺细胞分泌功能最强，状态最佳，可作为移植的最佳供体[15]。考虑原因可能为：①细胞培养前几日测出的 PTH 可能主要为细胞已合成储存在细胞体内的 PTH；②体外培养的甲状旁腺细胞由于缺乏 PTH 合成的原料及相关细胞因子，其合成 PTH 的能力处于较低的水平；③体外培养的甲状旁腺细胞的增殖及分化功能较分泌功能显著。
本实验结果提示，甲状旁腺细胞和 PGA 支架共培养，细胞能在 PGA 支架上黏附生长并形成三维立体的生长方式，细胞形态良好，PGA 支架上的细胞存活率高，分泌 PTH 功能较好，PGA 支架可以作为甲状旁腺细胞培养的良好载体。
甲状旁腺移植治疗甲状旁腺功能减退症的研究已历经百年的探索和尝试，国内外许多医院都在开展对此种治疗方法的研究，并已试用于临床，且取得了良好的近期效果。然而足够数量和功能良好的甲状旁腺细胞是保证移植成功的关键。目前，甲状旁腺细胞的培养依然局限于二维平面培养的方式。因此，本研究在旋转细胞培养系统（rotary cell culture system，RCCS）提供的模拟微重力环境下三维培养甲状旁腺细胞，研究其形态和分泌功能，以便探索甲状旁腺细胞更为优良的培养技术。
1 材料与方法
1.1 主要实验材料
雄性 Wistar 大鼠，37 只，体质量 150～200 g，由哈尔滨医科大学第一附属医院实验动物中心提供。细胞支架：聚羟基乙酸（polyglycolic acid，PGA）购于美国 Synthecon 公司。RCCS-L 型回转式生物反应器购自 Synthecon 公司。胎牛血清购于浙江天杭生物科技有限公司。RPMI-1640 培养基、胶原酶 Ⅱ、吖啶橙及碘化丙啶购于 Sigma 公司。
1.2 大鼠甲状旁腺组织的切取[1 ]
1% 戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉。仰卧位，颈胸部备皮，常规碘伏消毒。于颈部正中纵行切开皮肤，钝性分离颈前组织，向两侧牵开颈前肌群，显露气管及双侧甲状腺，于 10 倍解剖显微镜下仔细观察辨认，甲状腺组织为暗红色，呈蝴蝶状位于甲状软骨和气管环两侧，钝性分离胸骨甲状肌，可见呈乳白色或灰白色的组织，即为甲状旁腺，显微剪剪下后经病理证实。
1.3 大鼠甲状旁腺细胞的培养
将手术切取并经病理检测证实的甲状旁腺组织用 4 ℃ 含双抗(青霉素 100 U/mL，链霉素 100 μg/mL)的 RPMI-1640 培养基反复吹打漂洗 2 次，吸弃培养基，用显微剪将甲状旁腺组织剪碎成糊状移入 10 mL 离心管中，加入 2 mL 0.25% 胶原酶 Ⅱ 后在 38 ℃ 恒温水浴中振荡消化 20 min。然后用含 20% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养液 2 mL终止消化。用 100 目无菌不锈钢网过滤后离心去上清，沉淀物加入含 20% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养瓶中，调整细胞浓度为1×105个细胞/mL。同时，用台盼蓝染色计数细胞活力，细胞存活率>95%。将培养瓶置于 37 ℃含 5% CO2 和 95% 空气的恒温培养箱中培养。
1.4 PGA支架的预处理
将 PGA 支架剪切成规格为 5 mm×4 mm×1 mm 大小的小块，漂洗干净，75% 乙醇浸泡 30 min，然后取出用无菌 PBS 洗涤 3 次后，自然晾干，备用。
1.5 实验分组及处理
将经胶原酶 Ⅱ 消化获取的甲状旁腺细胞，根据培养条件不同，分为 3 组。
1.5.1 普通培养组 单纯甲状旁腺细胞静置培养。取 2 mL 浓度为 1×105个细胞/mL 的原代甲状旁腺细胞悬液移入 10 mL 培养瓶中，置于 37 ℃ 含 5% CO2 和 95% 空气的恒温培养箱中培养。
1.5.2 PGA 支架培养组 甲状旁腺细胞接种在 PGA 支架上静置培养。接种培养前，先将固定规格的 PGA 支架置于含 20% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养液中孵育过夜。接种时，将已预湿的 PGA 支架置于 6 孔培养板中，取 2 mL 密度为 1×105个细胞/mL 的细胞悬液，再用吸管将其缓慢逐滴均匀地滴加于 4 块 PGA 支架材料上。将此 6 孔培养板置于 37 ℃ 含 5% CO2 和 95% 空气的恒温培养箱中培养。
1.5.3 微重力培养组 甲状旁腺细胞和 PGA 支架在模拟微重力环境中共培养。取 10 mL 密度为 1×105个细胞/mL 的甲状旁腺细胞悬液，将事先已预湿的 20 块 PGA 支架置于上述细胞悬液中，轻轻混匀，在 CO2 培养箱中预孵育 30 min。取容积为 10 mL 的 RCCS-L 型回转式生物反应器，在无菌条件下安装备好。关闭两个取样孔阀门，经注液孔缓缓注入已孵育的含 PGA 支架的细胞悬液，充满整个容器。去除容器中所有气泡，将微重力装置放于培养箱中，调节转速，以载体不接触容器各壁为宜。
1.6 观测指标
1.6.1 观察细胞形态 分别于细胞培养第 1、3、5 和 7 天时用相差倒置显微镜观察各组细胞的生长形态。
1.6.2 测定细胞分泌功能 在无菌技术下，于细胞培养第 1、3、5、7 天时离心获得各组培养细胞的上清液 1～2 mL，装入EP管，贴好标签，放–20 ℃冰箱中保存，待统一融化检测甲状旁腺激素（PTH）水平。
1.6.3 细胞活性测定 取 0.01 mL 吖啶橙储液与 1 mL 碘化丙啶储液混合，加 9 mL PBS 稀释 10 倍，混匀，取适量与培养第 1、3、5、7 天的甲状旁腺细胞（离心所得）混合，培养箱中孵育 5 min 后，在共聚焦荧光显微镜下，用 490 nm 激发光滤光片，510 nm 光栅滤光片可同时见到绿色（吖啶橙）和红色（碘化丙啶）荧光。活细胞显绿色，死细胞显红色。细胞存活率=（绿色荧光细胞/红色荧光细胞+绿色荧光细胞）×100%。每份样本重复计算 4 次，取其平均值。
1.7 统计学方法
采用 Sigmplot 软件对数据进行分析。实验数据以均数±标准差（ ）表示；组间比较行独立样本t 检验，组内比较行配对样本t 检验，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 甲状旁腺细胞的生长形态观察结果
2.1.1 普通培养组 培养后第 1 天时，细胞绝大部分附于培养瓶底面，呈现明显的聚集性，少量单个细胞悬浮在培养液中；第 3 天时，细胞已贴壁生长，大部分细胞团周边的细胞明显延展，少数单个贴壁细胞仍呈圆形，匀质且透明；第 5 天时，几乎所有细胞已延展，细胞相互接壤成片，呈多角形或星形，核圆，居中，呈现上皮细胞的形态特征；第 7 天时，大部分细胞形态良好，部分细胞团中心出现白色坏死灶，培养液中悬浮细胞及细胞碎片较前增多，并可见少量成纤维细胞贴壁生长。见图 1。
图1
普通培养组培养后不同时相下细胞形态观察结果（相差倒置显微镜 ×100） a：第 5 天；b：第 7 天
2.1.2 PGA 支架培养组 细胞接种于 PGA 支架上第 1 天时，见网状支架表面不少细胞附着，少量单个细胞进入支架空隙内部，6 孔培养板底部亦可见大量细胞；第 3 天时，支架表面及内部细胞未见延展，仍呈圆形，板底面的细胞已开始呈放射状延展，轻轻晃动培养板，细胞无游离支架现象；第 5 天时，细胞在支架上附着牢固，少数细胞开始沿支架向两极延伸，细胞呈短梭形或多角形，板底面的细胞已充分延展；第 7 天时，支架上大部分细胞沿 PGA 纤维纵轴方向向两极伸展，相邻支架被细胞外基质连接。见图 2。
图2
PGA支架培养组培养后不同时相下细胞形态观察结果（相差倒置显微镜 ×200） a：第 5 天；b：第 7 天
2.1.3 微重力培养组 在微重力环境中培养后第 1 天时，见大量细胞散布在 PGA 纤维网状支架表面及空隙中，以支架边缘附着的细胞密集，细胞呈圆形；第 3 天时，PGA 支架上黏附的细胞数较前明显增加，均匀分布于支架表面和内部，细胞与支架黏附较为紧密，开始聚集成团，未见细胞延展；第 5 天时，支架表面和空隙中细胞密布，在不同的焦距下均清晰可见不同的细胞，细胞仍呈圆形，大量聚集成团；第 7 天时，细胞团较前增大增多，可见少量细胞碎片开始游离出来。见图 3。
图3
微重力培养组培养后不同时相下细胞形态观察结果（相差倒置显微镜 ×200） a：第 5 天；b：第 7 天
2.2 各组细胞培养液中 PTH 值测定结果
各组细胞培养液中 PTH 值检测结果见表 1。从表 1 可见，培养后第 1 天时，普通培养组和 PGA 支架培养组的 PTH 值比较差异无统计学意义（P>0.05），微重力培养组的 PTH 值明显高于普通培养组（P<0.05）；培养后第 3、5 及 7 天时，PGA 支架培养组和微重力培养组的 PTH 值均明显高于普通培养组（P<0.05），微重力培养组的 PTH 值明显高于 PGA 支架培养组（P<0.05）。
表1
培养不同时相后各组细胞培养液中 PTH 值比较（ng/L，
）
2.3 各组细胞活性测定结果
各组细胞活性检测结果见图 4 和表 2。从表 2 可见，培养后第 1 天时，各组之间比较差异均无统计学意义（P>0.05）；培养后第 3、5 天时，普通培养组与 PGA 支架培养组间比较差异无统计学意义（P>0.05），微重力培养组的细胞存活率明显高于普通培养组（P<0.05）和 PGA 支架培养组（P<0.05）；培养后第 7 天时，PGA 支架培养组和微重力培养组的细胞存活率均明显高于普通培养组（P<0.05），且微重力培养组的细胞存活率明显高于 PGA 支架培养组（P<0.05）。
表2
培养不同时相后各组细胞存活率比较（%，
）
图4
不同培养环境下培养至第 5 天时的细胞形态观察结果（荧光显微镜 ×200） a：普通培养组，细胞存活率为 80.4%；b：微重力培养组，细胞存活率为 89.1%
3 讨论
甲状旁腺移植是甲状旁腺功能减退患者获得生理性血钙水平的理想途径[2]。 随着细胞、生物材料、移植免疫等技术的进步，甲状旁腺移植的方法和疗效都取得了较大的进展[3-4]。但如何找到充足的移植来源、降低移植物的免疫原性以及延长移植后移植组织的存活时间，一直是困扰外科医生的核心问题[5]。目前，甲状旁腺细胞的培养依然局限于二维平面培养的方式，本研究在 RCCS 提供的模拟微重力环境下三维培养甲状旁腺细胞，而微重力组织工程的核心技术是建立动物细胞的三维培养体系[6]。
模拟微重力环境对动物细胞的体外培养有如下优点[7-12]：① 培养液对细胞的机械剪切力小。② 正常的重力向量被持续随机化，可能直接或间接地促进细胞的自分泌以及旁分泌，也可能对细胞基因表达产生影响，更加有利于细胞与细胞之间信号的转导。③ 细胞生长在三维空间中，不易形成中心坏死，对维持细胞正常功能具有重要作用。④ 具有高保真度的优点。⑤ 在微重力培养条件下，细胞、支架和培养液在类似自由落体的状态下运动，细胞和支架载体形成一种持续动态的接种，悬浮着的细胞可以不断有机会与支架接触而黏附，从而使细胞在载体表面及载体内部产生较均匀的分布。而静置培养时，由于培养容器中的培养液无法动态混合，支架内部代谢废物不易排出，容易在局部蓄积，使局部环境的 pH 值发生变化，另外，营养物质和氧气也难以输送给中心部位的细胞，因此，中心部位细胞极易发生生长停滞或死亡。
本研究结果发现，普通培养组的细胞在培养第 3 天时已经开始延展，第 5 天时几乎所有细胞都已伸展，呈现多角形或星形；PGA支架培养组细胞于培养第 5 天时开始沿支架向两极延伸，呈现短梭形或多角形，第 7 天时，支架上细胞大部分沿 PGA 纤维纵轴方向向两极伸展；而微重力培养组的细胞在培养第 7 天时细胞仍呈圆形，聚集成团，并逐渐增大。细胞相互聚集成团，有利于细胞与细胞之间的信号传递，更加有利于细胞外基质在细胞周围的固守，而细胞外基质能对细胞的增殖分化、生长代谢发挥巨大的调节作用，从而为细胞的生长代谢及功能发挥创造更加适宜的微环境[13]。细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的联系调控细胞骨架蛋白基因的表达，从而使细胞呈现不同的形态，而细胞的形态与细胞功能密切相关[14]。
本研究中，在细胞培养的第 1、3、5、7 天时，取适量细胞进行吖啶橙和碘化丙啶染色，检测细胞存活情况，结果显示，除第 1 天外，微重力培养组细胞存活率均明显高于 PGA 支架培养组（P<0.05）和普通培养组（P<0.05），且PTH值也均明显高于PGA支架培养组和普通培养组（P<0.05）。PGA 支架培养组细胞培养液中 PTH 浓度均明显高于普通培养组。我们认为，可能由于普通培养组是二维培养，营养物质的吸收及代谢废物的排出受到了限制，加速了甲状旁腺细胞的死亡；而 PGA 支架培养组的细胞由于有了 PGA 支架的支持和维护，使细胞成三维立体生长，而三维培养更加有利于营养成分的吸收和气体的交换以及代谢废物的排出，所以与普通培养组相比，支架组甲状旁腺细胞的活性较强，细胞存活率高于普通培养组。同时我们还发现，各培养组细胞分泌峰值均是在培养后的第 5 天，第 7 天开始下降，由此推测培养 5 d 的甲状旁腺细胞分泌功能最强，状态最佳，可作为移植的最佳供体[15]。考虑原因可能为：①细胞培养前几日测出的 PTH 可能主要为细胞已合成储存在细胞体内的 PTH；②体外培养的甲状旁腺细胞由于缺乏 PTH 合成的原料及相关细胞因子，其合成 PTH 的能力处于较低的水平；③体外培养的甲状旁腺细胞的增殖及分化功能较分泌功能显著。
本实验结果提示，甲状旁腺细胞和 PGA 支架共培养，细胞能在 PGA 支架上黏附生长并形成三维立体的生长方式，细胞形态良好，PGA 支架上的细胞存活率高，分泌 PTH 功能较好，PGA 支架可以作为甲状旁腺细胞培养的良好载体。
