引用本文： 邵军, 王志鑫, 王虎, 李衍飞, 张灵强, 任利, 侯立朝, 周瀛, 王海久, 樊海宁. 抗体芯片检测泡型包虫病肝组织凋亡因子的表达. 中国普外基础与临床杂志, 2017, 24(4): 426-431. doi: 10.7507/1007-9424.201608097 复制
肝泡型包虫病（hepatic alveolar echinococcosis，HAE）是危害极大的人畜共患的寄生虫病，与肝癌有着相似的生物学行为。HAE 患者临床症状出现较晚，待症状出现时已经到了晚期，目前治疗手段及效果有限，成为临床医生面临的一大挑战。因此对泡型包虫病的早期诊治至关重要[1-2]。近年来对于细胞因子与疾病的关系的研究颇为深入，细胞因子在泡型包虫病发生发展中的作用引起了越来越多的关注。抗体芯片是蛋白组学新兴的一门技术，拥有高通量、特异性高及平行性分析的特点，在肿瘤标志物发现、药物发展、毒素检测、细胞因子研究等领域已有广泛的应用[3]。本研究利用抗体芯片技术检测泡型包虫病患者肝组织中凋亡因子的表达水平，为进一步探索凋亡因子在泡型包虫病疾病进展中的作用及新的泡型包虫病诊断及治疗策略奠定研究基础。
1 材料与方法
1.1 标本来源及处理
选取 2015 年 3–10 月期间青海大学附属医院 6 例肝泡型包虫病患者的手术切除标本。所有患者术前诊断均参照《WS257-2006 包虫病诊断标准》，术前均签署知情同意书。选取的标本均留取病变边缘带肝组织及正常肝组织，边缘带肝组织距病灶边缘 0.5 cm；正常肝组织距病灶边缘 5 cm。所有标本均于手术后 1 h 内处理完毕并置入–80 ℃ 冰箱保存备检。
1.2 主要试剂、材料及设备
1.2.1 AAH-APO-G1 试剂盒 试剂盒购自广州瑞博奥生物科技公司，包括：① 玻片芯片（RayBio®Human Apoptosis G1 Microarray slides，1 个玻片上有 4 个或者 8 个阵列）；② 生物素标记抗体（Biotin-Conjμgated Anti-cytokines，4 个阵列配 1 管，8 个阵列配 2 管）；③ 1 500×荧光标记链霉亲和素（Cy3 equivalent，1 管）；④ 1×封闭缓冲液（Blocking Buffer，30 mL）；⑤ 20×洗液 Ⅰ（20×Wash Buffer Ⅰ，30 mL）；⑥ 20×洗液 Ⅱ（20×Wash Buffer Ⅱ，30 mL）；⑦ 2×细胞裂解液（2×Cell Lysis Buffer，10 mL）。
1.2.2 主要仪器 ① Genepix 荧光扫描仪，型号：MoLecμLar Devices，LLC；1311 OrLeans Drive SunnyvaLe，CA 94089-1136 ；United States。扫描参数：波长 532 nm。解析度：10 μm。② Thermo Scientific Wellwash Versa 芯片洗板机（编号：5165010WellwashVersa，100～240 V，50/60 Hz，THERMOUSA/USA）。③ 冷冻离心机（Sigma 1-16K 小型台式冷冻离心机，1-16K，230 V/50；60 Hz，460 W，24×2.0 mL，15 000 r/min≈20 627×g，100 r/min，Sigma/Germany）。
1.3 组织样品的准备
① 将 2×细胞裂解液稀释 2 倍备用，用蒸馏水或者双蒸水稀释。② 配制蛋白酶抑制剂：将 Protease Inhibitor Cocktail 小管简单离心一下，然后将盖子打开，加入 60 μL 稀释好的 1×细胞裂解液在小管中，混匀溶解蛋白酶抑制剂；配制蛋白磷酸酶抑制剂混合物：将磷酸酶抑制剂小管简单离心一下，然后将盖子打开，加入 180 μL 稀释好的 1×细胞裂解液在小管中，混匀溶解蛋白酶抑制剂。③ 分别取 50 μL 和 200 μL 配制好的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，加入到 4 750 μL 的 1×细胞裂解液中，混匀，即配制好的已添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的组织裂解液，备用。④ 往肝脏组织中加入细胞裂解液，在冰上用高速分散切割机进行组织破碎。⑤ 冰上裂解 0.5 h，每 5 min 振荡 1 次。⑥ 冷冻离心机离心（13 000 r/mim）20 min。
1.4 蛋白浓度测定
组织裂解后采用 BCA 法测定其蛋白浓度，测定结果见图 1。
图1
示组织标本裂解后测定的蛋白浓度
1.5 抗体芯片检测方法
采用 AAH-APO-G1 试剂盒进行凋亡因子检测，实验步骤如下。
1.5.1 玻片芯片的完全干燥 将玻片芯片（RayBio®Human Apoptosis G1 Microarray slides）从盒子中取出来，在室温下平衡 20～30 min 后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在室温干燥 1～2 h。
1.5.2 封闭和孵育 ① 每个芯片孔中加入 100 μL 的 1×封闭液，室温摇床上孵育 1 h，避免产生气泡。② 抽去封闭液，每个孔中添加 100 μL 样品（组织样品配制浓度为 500 μg/mL 的上样），1 个阵列 1 个样品〔4 ℃ 振荡过夜孵育，样品离心 10 min （13 000 r/mim）〕。③ 使用赛默飞芯片洗板机清洗玻片，分为两步：首先用 1×洗液 Ⅰ 进行清洗，每孔 250 μL 的 1×洗液 Ⅰ，清洗 8 次，每次震荡 10 s，震荡强度选择高，用去离子水稀释 20×洗液 Ⅰ；然后换用 1×洗液 Ⅱ 进行清洗，每孔 250 μL 的 1×洗液 Ⅱ，清洗 5 次，每次震荡 10 s，震荡强度选择高，用去离子水稀释 20×洗液 Ⅱ。④ 配制生物素标记抗体，快速离心生物素标记抗体的小管，每个小管加入 300 μL 的 1×封闭液，混合均匀；每孔加入 70 μL 生物素标记抗体；室温孵育 2 h。⑤ 清洗，同步骤 3。⑥ 每孔加入 70 μL 1 500 倍稀释的荧光剂-链霉亲和素，快速离心后加入 1.5 mL 的封闭液到荧光剂-链霉亲和素的小管，用密封条贴住玻片，然后用铝箔纸包住玻片避光室温震荡孵育 1～2 h；此步也可在 4 ℃ 过夜孵育。⑦ 清洗，同步骤 3。
1.5.3 芯片荧光检测 采用 Genepix 荧光扫描仪检测芯片信号，获取芯片上各点的荧光强度。
1.6 统计学方法
采用 AAH-APO-G1 软件来进行数据分析。计量资料用均数±标准差（ ）表示，2 组间均数比较采用t 检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 6 例患者的一般资料
本研究纳入的肝泡型包虫病手术患者肝组织标本 6 例，其中男 3 例，女 3 例；年龄 19～47 岁，平均年龄 34 岁；均为藏族，牧民 4 例；未婚者 4 例。手术方式：行右半肝切除术 4 例，肝左三叶切除术 1 例，全离体自体肝移植术 1 例。
2.2 抗体芯片检测情况
本研究利用抗体芯片技术检测泡型包虫病患者肝组织中的 47 种凋亡因子（表 1），通过抗体芯片检测阵列图并对比荧光扫描图片，结果发现，边缘带肝组织中 Bad、Fas、IGFBP-3、P21 及 XIAP 凋亡因子抗体芯片阵列位置标记点荧光强度明显，提示这些凋亡因子在边缘带肝组织中表达水平上调；正常肝组织中 Bad、Fas、IGFBP-3、P21 以及 XIAP 凋亡因子抗体芯片阵列位置标记点荧光强度也存在变化，提示这些凋亡因子在正常组织中也有相应表达（图 2）。
表1
芯片膜上凋亡因子位置列表
图2
示抗体芯片荧光扫描结果。 a：边缘带肝组织；b：正常肝组织；矩形框：显著差异性因子位置
抗体芯片检测后一般选取信号值>400，倍性变化阈值大于 1.2 或小于 0.8 及统计学分析P<0.05 为显著性细胞因子。通过数据对比发现，Bad、Fas、IGFBP-3、P21 及 XIAP 因子在边缘带肝组织中的检测信号值>400，且满足倍性变化阈值大于 1.2 或小于 0.8；泡型包虫病边缘带肝组织与正常肝组织相比 Bad（P=0.008）、Fas（P=0.007、IGFBP-3 （P=0.024）、P21（P=0.036）及 XIAP（P=0.034）凋亡因子的表达水平差异有统计学意义（表 2）。尽管发现正常肝组织和边缘带肝组织中 Bad、Fas、IGFBP-3、P21 及 XIAP 因子信号值水平均>400，但在正常肝组织中 Bad、Fas、IGFBP-3 及 P21 因子信号值水平低于边缘带肝组织，而正常肝组织中 XIAP 因子的信号值水平高于边缘带肝组织（P<0.05），见图 3。
表2
泡型包虫病肝组织中显著性表达因子的信号值
图3
示泡型包虫病肝组织中 5 种显著性表达因子的信号值。 a：Bad；b：Fas；c：IGFBP-3；d：P21；e：XIAP
3 讨论
泡型包虫病是由多房棘球绦虫引起的一种人畜共患病，呈全球性分布。泡型包虫病以肝脏为主要寄生器官，如同肿瘤一样呈恶性浸润性生长[4-5]。泡型包虫病可转移到腹膜后和脑、肺、骨等远处器官，因此有“虫癌”之称[6-9]。泡型包虫病危害极大已成为威胁公众健康的重大问题。
细胞凋亡是当前生物学研究领域中的最新课题之一[10]，对某些疾病的细胞凋亡机制进行研究，寻找在疾病的特异性并应用于疾病的防治已成为治疗学的新领域[11]。细胞凋亡是调节生物体正常发育的重要机制[12]，同时也是细胞自稳中发挥重要作用的调控因子[13-14]。近年来，抗体芯片作为最常用的一种蛋白质芯片，已经逐渐发展成为平行性定性和定量检测生物样品中蛋白质分子的重要检测手段[15-16]，在国内外就抗体芯片技术在肿瘤、一些罕见性疾病或感染性疾病中的应用已有相关文献[17-20]报道。泡型包虫病有着与肿瘤类似的特性，因此本研究利用抗体芯片技术检测泡型包虫病患者肝组织中凋亡因子的表达水平，以探索凋亡因子在泡型包虫病疾病进程中的作用。本研究结果显示：泡型包虫病正常肝组织及边缘带肝组织中凋亡细胞因子均有不同程度的表达。但与正常肝组织比较，边缘带肝组织中多种凋亡因子（Bad、Fas、IGFBP-3、P21 及 XIAP）表达水平变化较为明显（表达上调或下调在1倍以上），其差异均有统计学意义（P<0.05）。
凋亡因子在泡型包虫病的相关研究尚未有文献报告，因此通过阐述本研究中表达显著的凋亡因子的作用机制，推测这些因子与泡型包虫病之间的联系。其中 Bad 蛋白是仅含有 BH3 结构域的 B 细胞淋巴瘤-白血病基因家族的一员，是重要的促凋亡基因之一[21]。有研究[22]表明，Bad 能促进凋亡依赖于细胞信号转导通路和天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族成员的作用。而 Fas 也称“死亡分子”，是肿瘤坏死因子受体和神经生长因子受体超家族一员[23]。在生理状况下，Fas 抗原可广泛表达于胸腺细胞、活化的T淋巴细胞等免疫细胞表面，也可表达于肝、肺等组织细胞表面[24]。Fas/FasL 在维持机体免疫自稳和肿瘤发生发展过程扮演重要角色，能够在肿瘤逃避机体免疫系统的监视中发挥直接或间接促进作用，从而有利于肿瘤细胞的侵袭和转移，但这也为肿瘤的治疗提供了可能的途径[25-26]。近年的研究[27]表明，Fas/FasL 系统就像一把“双刃剑”，在促进肿瘤增殖及凋亡中发挥着不同的作用。IGFBP-3 是血液中一种重要的 IGF 载体蛋白，其水平变化可作为多种肿瘤诊断和预警的指标[28]；此外，IGFBP-3 还可能介导 P53 的对癌细胞的生长抑制和细胞凋亡，因此 IGFBP-3 在癌症治疗方面前景广阔[29-31]。P21 是目前最具 CDK 抑制活性的细胞抑制蛋白，其与肿瘤的分化、浸润深度、增生和转移有关且具有判断预后的价值，同时参与细胞的多种功能活动并对细胞周期具有负性调控作用[32-33]；P21 可以通过调控 P21 基因可抑制肿瘤增长，激活 P21 基因可抑制肝癌细胞增殖[34-36]。XIAP 与上述凋亡因子作用相反，其属于 IAP（凋亡抑制蛋白）家族是凋亡过程中的重要调节因子，是唯一能在起始阶段和效应阶段同时起抑制作用的蛋白[37]；XIAP 与肿瘤的发生发展和预后密切相关，许多肿瘤高表达通过抑制凋亡信号转导通路中起核心作用的半胱天冬氨酸蛋白酶分子，对凋亡产生阻断作用[38-39]。
综上所述，Bad、Fas、IGFBP-3、P21 等凋亡因子能够促进细胞的凋亡，而 X-相关凋亡抑制蛋白（XIAP）能够抑制细胞的凋亡。本研究结果提示：凋亡相关因子在泡型包虫病的慢性进程中发挥相应作用，可能参与泡型包虫病的免疫逃逸，为泡型包虫病的侵袭和转移创造条件。而促凋亡因子与抑制性凋亡因子之间也可能存在功能失衡，两者在泡型包虫病的具体作用机制尚不确切。由于本研究样本量较少，对于凋亡因子在泡型包虫病的作用机制研究仍需进一步深入，为泡型包虫病免疫疗法方面的研究提供新思路及潜在靶点。
肝泡型包虫病（hepatic alveolar echinococcosis，HAE）是危害极大的人畜共患的寄生虫病，与肝癌有着相似的生物学行为。HAE 患者临床症状出现较晚，待症状出现时已经到了晚期，目前治疗手段及效果有限，成为临床医生面临的一大挑战。因此对泡型包虫病的早期诊治至关重要[1-2]。近年来对于细胞因子与疾病的关系的研究颇为深入，细胞因子在泡型包虫病发生发展中的作用引起了越来越多的关注。抗体芯片是蛋白组学新兴的一门技术，拥有高通量、特异性高及平行性分析的特点，在肿瘤标志物发现、药物发展、毒素检测、细胞因子研究等领域已有广泛的应用[3]。本研究利用抗体芯片技术检测泡型包虫病患者肝组织中凋亡因子的表达水平，为进一步探索凋亡因子在泡型包虫病疾病进展中的作用及新的泡型包虫病诊断及治疗策略奠定研究基础。
1 材料与方法
1.1 标本来源及处理
选取 2015 年 3–10 月期间青海大学附属医院 6 例肝泡型包虫病患者的手术切除标本。所有患者术前诊断均参照《WS257-2006 包虫病诊断标准》，术前均签署知情同意书。选取的标本均留取病变边缘带肝组织及正常肝组织，边缘带肝组织距病灶边缘 0.5 cm；正常肝组织距病灶边缘 5 cm。所有标本均于手术后 1 h 内处理完毕并置入–80 ℃ 冰箱保存备检。
1.2 主要试剂、材料及设备
1.2.1 AAH-APO-G1 试剂盒 试剂盒购自广州瑞博奥生物科技公司，包括：① 玻片芯片（RayBio®Human Apoptosis G1 Microarray slides，1 个玻片上有 4 个或者 8 个阵列）；② 生物素标记抗体（Biotin-Conjμgated Anti-cytokines，4 个阵列配 1 管，8 个阵列配 2 管）；③ 1 500×荧光标记链霉亲和素（Cy3 equivalent，1 管）；④ 1×封闭缓冲液（Blocking Buffer，30 mL）；⑤ 20×洗液 Ⅰ（20×Wash Buffer Ⅰ，30 mL）；⑥ 20×洗液 Ⅱ（20×Wash Buffer Ⅱ，30 mL）；⑦ 2×细胞裂解液（2×Cell Lysis Buffer，10 mL）。
1.2.2 主要仪器 ① Genepix 荧光扫描仪，型号：MoLecμLar Devices，LLC；1311 OrLeans Drive SunnyvaLe，CA 94089-1136 ；United States。扫描参数：波长 532 nm。解析度：10 μm。② Thermo Scientific Wellwash Versa 芯片洗板机（编号：5165010WellwashVersa，100～240 V，50/60 Hz，THERMOUSA/USA）。③ 冷冻离心机（Sigma 1-16K 小型台式冷冻离心机，1-16K，230 V/50；60 Hz，460 W，24×2.0 mL，15 000 r/min≈20 627×g，100 r/min，Sigma/Germany）。
1.3 组织样品的准备
① 将 2×细胞裂解液稀释 2 倍备用，用蒸馏水或者双蒸水稀释。② 配制蛋白酶抑制剂：将 Protease Inhibitor Cocktail 小管简单离心一下，然后将盖子打开，加入 60 μL 稀释好的 1×细胞裂解液在小管中，混匀溶解蛋白酶抑制剂；配制蛋白磷酸酶抑制剂混合物：将磷酸酶抑制剂小管简单离心一下，然后将盖子打开，加入 180 μL 稀释好的 1×细胞裂解液在小管中，混匀溶解蛋白酶抑制剂。③ 分别取 50 μL 和 200 μL 配制好的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，加入到 4 750 μL 的 1×细胞裂解液中，混匀，即配制好的已添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的组织裂解液，备用。④ 往肝脏组织中加入细胞裂解液，在冰上用高速分散切割机进行组织破碎。⑤ 冰上裂解 0.5 h，每 5 min 振荡 1 次。⑥ 冷冻离心机离心（13 000 r/mim）20 min。
1.4 蛋白浓度测定
组织裂解后采用 BCA 法测定其蛋白浓度，测定结果见图 1。
图1
示组织标本裂解后测定的蛋白浓度
1.5 抗体芯片检测方法
采用 AAH-APO-G1 试剂盒进行凋亡因子检测，实验步骤如下。
1.5.1 玻片芯片的完全干燥 将玻片芯片（RayBio®Human Apoptosis G1 Microarray slides）从盒子中取出来，在室温下平衡 20～30 min 后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在室温干燥 1～2 h。
1.5.2 封闭和孵育 ① 每个芯片孔中加入 100 μL 的 1×封闭液，室温摇床上孵育 1 h，避免产生气泡。② 抽去封闭液，每个孔中添加 100 μL 样品（组织样品配制浓度为 500 μg/mL 的上样），1 个阵列 1 个样品〔4 ℃ 振荡过夜孵育，样品离心 10 min （13 000 r/mim）〕。③ 使用赛默飞芯片洗板机清洗玻片，分为两步：首先用 1×洗液 Ⅰ 进行清洗，每孔 250 μL 的 1×洗液 Ⅰ，清洗 8 次，每次震荡 10 s，震荡强度选择高，用去离子水稀释 20×洗液 Ⅰ；然后换用 1×洗液 Ⅱ 进行清洗，每孔 250 μL 的 1×洗液 Ⅱ，清洗 5 次，每次震荡 10 s，震荡强度选择高，用去离子水稀释 20×洗液 Ⅱ。④ 配制生物素标记抗体，快速离心生物素标记抗体的小管，每个小管加入 300 μL 的 1×封闭液，混合均匀；每孔加入 70 μL 生物素标记抗体；室温孵育 2 h。⑤ 清洗，同步骤 3。⑥ 每孔加入 70 μL 1 500 倍稀释的荧光剂-链霉亲和素，快速离心后加入 1.5 mL 的封闭液到荧光剂-链霉亲和素的小管，用密封条贴住玻片，然后用铝箔纸包住玻片避光室温震荡孵育 1～2 h；此步也可在 4 ℃ 过夜孵育。⑦ 清洗，同步骤 3。
1.5.3 芯片荧光检测 采用 Genepix 荧光扫描仪检测芯片信号，获取芯片上各点的荧光强度。
1.6 统计学方法
采用 AAH-APO-G1 软件来进行数据分析。计量资料用均数±标准差（ ）表示，2 组间均数比较采用t 检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 6 例患者的一般资料
本研究纳入的肝泡型包虫病手术患者肝组织标本 6 例，其中男 3 例，女 3 例；年龄 19～47 岁，平均年龄 34 岁；均为藏族，牧民 4 例；未婚者 4 例。手术方式：行右半肝切除术 4 例，肝左三叶切除术 1 例，全离体自体肝移植术 1 例。
2.2 抗体芯片检测情况
本研究利用抗体芯片技术检测泡型包虫病患者肝组织中的 47 种凋亡因子（表 1），通过抗体芯片检测阵列图并对比荧光扫描图片，结果发现，边缘带肝组织中 Bad、Fas、IGFBP-3、P21 及 XIAP 凋亡因子抗体芯片阵列位置标记点荧光强度明显，提示这些凋亡因子在边缘带肝组织中表达水平上调；正常肝组织中 Bad、Fas、IGFBP-3、P21 以及 XIAP 凋亡因子抗体芯片阵列位置标记点荧光强度也存在变化，提示这些凋亡因子在正常组织中也有相应表达（图 2）。
表1
芯片膜上凋亡因子位置列表
图2
示抗体芯片荧光扫描结果。 a：边缘带肝组织；b：正常肝组织；矩形框：显著差异性因子位置
抗体芯片检测后一般选取信号值>400，倍性变化阈值大于 1.2 或小于 0.8 及统计学分析P<0.05 为显著性细胞因子。通过数据对比发现，Bad、Fas、IGFBP-3、P21 及 XIAP 因子在边缘带肝组织中的检测信号值>400，且满足倍性变化阈值大于 1.2 或小于 0.8；泡型包虫病边缘带肝组织与正常肝组织相比 Bad（P=0.008）、Fas（P=0.007、IGFBP-3 （P=0.024）、P21（P=0.036）及 XIAP（P=0.034）凋亡因子的表达水平差异有统计学意义（表 2）。尽管发现正常肝组织和边缘带肝组织中 Bad、Fas、IGFBP-3、P21 及 XIAP 因子信号值水平均>400，但在正常肝组织中 Bad、Fas、IGFBP-3 及 P21 因子信号值水平低于边缘带肝组织，而正常肝组织中 XIAP 因子的信号值水平高于边缘带肝组织（P<0.05），见图 3。
表2
泡型包虫病肝组织中显著性表达因子的信号值
图3
示泡型包虫病肝组织中 5 种显著性表达因子的信号值。 a：Bad；b：Fas；c：IGFBP-3；d：P21；e：XIAP
3 讨论
泡型包虫病是由多房棘球绦虫引起的一种人畜共患病，呈全球性分布。泡型包虫病以肝脏为主要寄生器官，如同肿瘤一样呈恶性浸润性生长[4-5]。泡型包虫病可转移到腹膜后和脑、肺、骨等远处器官，因此有“虫癌”之称[6-9]。泡型包虫病危害极大已成为威胁公众健康的重大问题。
细胞凋亡是当前生物学研究领域中的最新课题之一[10]，对某些疾病的细胞凋亡机制进行研究，寻找在疾病的特异性并应用于疾病的防治已成为治疗学的新领域[11]。细胞凋亡是调节生物体正常发育的重要机制[12]，同时也是细胞自稳中发挥重要作用的调控因子[13-14]。近年来，抗体芯片作为最常用的一种蛋白质芯片，已经逐渐发展成为平行性定性和定量检测生物样品中蛋白质分子的重要检测手段[15-16]，在国内外就抗体芯片技术在肿瘤、一些罕见性疾病或感染性疾病中的应用已有相关文献[17-20]报道。泡型包虫病有着与肿瘤类似的特性，因此本研究利用抗体芯片技术检测泡型包虫病患者肝组织中凋亡因子的表达水平，以探索凋亡因子在泡型包虫病疾病进程中的作用。本研究结果显示：泡型包虫病正常肝组织及边缘带肝组织中凋亡细胞因子均有不同程度的表达。但与正常肝组织比较，边缘带肝组织中多种凋亡因子（Bad、Fas、IGFBP-3、P21 及 XIAP）表达水平变化较为明显（表达上调或下调在1倍以上），其差异均有统计学意义（P<0.05）。
凋亡因子在泡型包虫病的相关研究尚未有文献报告，因此通过阐述本研究中表达显著的凋亡因子的作用机制，推测这些因子与泡型包虫病之间的联系。其中 Bad 蛋白是仅含有 BH3 结构域的 B 细胞淋巴瘤-白血病基因家族的一员，是重要的促凋亡基因之一[21]。有研究[22]表明，Bad 能促进凋亡依赖于细胞信号转导通路和天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族成员的作用。而 Fas 也称“死亡分子”，是肿瘤坏死因子受体和神经生长因子受体超家族一员[23]。在生理状况下，Fas 抗原可广泛表达于胸腺细胞、活化的T淋巴细胞等免疫细胞表面，也可表达于肝、肺等组织细胞表面[24]。Fas/FasL 在维持机体免疫自稳和肿瘤发生发展过程扮演重要角色，能够在肿瘤逃避机体免疫系统的监视中发挥直接或间接促进作用，从而有利于肿瘤细胞的侵袭和转移，但这也为肿瘤的治疗提供了可能的途径[25-26]。近年的研究[27]表明，Fas/FasL 系统就像一把“双刃剑”，在促进肿瘤增殖及凋亡中发挥着不同的作用。IGFBP-3 是血液中一种重要的 IGF 载体蛋白，其水平变化可作为多种肿瘤诊断和预警的指标[28]；此外，IGFBP-3 还可能介导 P53 的对癌细胞的生长抑制和细胞凋亡，因此 IGFBP-3 在癌症治疗方面前景广阔[29-31]。P21 是目前最具 CDK 抑制活性的细胞抑制蛋白，其与肿瘤的分化、浸润深度、增生和转移有关且具有判断预后的价值，同时参与细胞的多种功能活动并对细胞周期具有负性调控作用[32-33]；P21 可以通过调控 P21 基因可抑制肿瘤增长，激活 P21 基因可抑制肝癌细胞增殖[34-36]。XIAP 与上述凋亡因子作用相反，其属于 IAP（凋亡抑制蛋白）家族是凋亡过程中的重要调节因子，是唯一能在起始阶段和效应阶段同时起抑制作用的蛋白[37]；XIAP 与肿瘤的发生发展和预后密切相关，许多肿瘤高表达通过抑制凋亡信号转导通路中起核心作用的半胱天冬氨酸蛋白酶分子，对凋亡产生阻断作用[38-39]。
综上所述，Bad、Fas、IGFBP-3、P21 等凋亡因子能够促进细胞的凋亡，而 X-相关凋亡抑制蛋白（XIAP）能够抑制细胞的凋亡。本研究结果提示：凋亡相关因子在泡型包虫病的慢性进程中发挥相应作用，可能参与泡型包虫病的免疫逃逸，为泡型包虫病的侵袭和转移创造条件。而促凋亡因子与抑制性凋亡因子之间也可能存在功能失衡，两者在泡型包虫病的具体作用机制尚不确切。由于本研究样本量较少，对于凋亡因子在泡型包虫病的作用机制研究仍需进一步深入，为泡型包虫病免疫疗法方面的研究提供新思路及潜在靶点。
