引用本文： 刘伟伟, 罗昆仑. 肝再生临床应用研究进展. 中国普外基础与临床杂志, 2017, 24(4): 512-517. doi: 10.7507/1007-9424.201608105 复制
肝脏具有一定的再生能力，受伤后短时间内可以恢复到原有体积[1-2]。临床上肝切除术后、肝移植术后或肝中毒损伤后均可以观察到肝再生，肝再生包括所有细胞的增生。肝切除术后肝细胞在 1 d 内则开始复制，但非实质细胞如内皮细胞、Kupffer 细胞和胆管细胞其修复时间开始得要晚些[3]。目前，负责维持肝脏再生的分子机制仍不十分清楚。但显而易见的是肝脏在细胞损伤和过度增长之间保持着一种微妙的平衡[4]。深入认识肝脏再生离不开临床问题。另外，一些新的实验方法提供了更多的关于肝再生和肝衰竭的信息[5]。笔者现就有关肝再生的研究（表 1）进行综述，旨在深刻了解肝再生机制基础上更好地在临床上开展肝移植及肝脏大部切除术，并为各种肝脏疾病提供更好的诊断及治疗措施。
表1
有关肝再生方面的研究
1 肝再生机制
肝切除术后剩余肝脏相应增生[1]。在部分肝切除术后，非成熟的肝细胞很快进入细胞周期，通过复制肝脏恢复了原有的体积。关于肝再生的生理触发器有2个主要观点[23]，一是肝部分切除术后，单位体积肝脏能量需求的增加产生一个早期的应力信号[24]；另一个是血流动力学因素的改变引起肝再生。虽然血液流动和肝脏再生有明确的相关性，但血液流动在肝再生时所扮演的角色仍不清楚[23]。几种不同的肝脏损伤包括病毒性和中毒引起的肝炎都可以引起类似的肝再生。
1.1 标准肝再生
肝再生的起始阶段，是各种炎症因子共同作用的结果[25]。在正常肝脏中，肝细胞通常处于 G0 期，肝脏损伤后便进入了 G1 期。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）是由 Kupffer 细胞产生的，通过结合各自的受体调控肝再生的启动阶段（G0 期到 G1 期）[26-27]。肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）和转化生长因子-α（transforming growth factor-α，TGF-α）被认为是启动 G1 期到 S 期起作用的因子[28-29]。这些因子通过结合相应的受体刺激了 DNA 的复制和细胞的有丝分裂[30]。TGF-β1 是被证明的肝细胞增殖抑制因子[31-32]。在正常的肝脏组织中，HGF 和 TGF-β 具有拮抗作用。在肝再生的起始阶段，HGF 信号比 TGF-β 更强大，而在肝再生的终末阶段，则会恢复到最初的平衡[33]。激活素是肝再生的一种抑制剂，它可以选择性地抑制肝脏细胞的复制；当肝脏的体积恢复到它原来的体积时，激活素 A、细胞凋亡机制和其他一些因素就会终止肝脏再生的进程[34]。最新研究发现，肝再生过程中各种炎症因子作用的同时会有胆管反应参与[7]。表 2 总结了参与肝再生的各种细胞因子和生长因子的功能[35]。
表2
参与肝脏再生的细胞因子
切应力对肝脏再生是一个强有力的刺激因素。肝切除术后，增加的门静脉血流增强了切应力，通过对肝细胞和肝窦内皮细胞的作用引起肝脏的再生和调节肝脏的大小。在内皮上的切应力是调节肝再生、肝体积、肝生长及萎缩的强大动力[36]。血流动力学增加了肝脏中的切应力，产生了一氧化氮。然后，一氧化氮引起了肝脏的再生级联[37]。近年研究发现，胆汁酸在肝再生过程中起到了重要的调控作用，胆汁酸对肝再生的调控通过其与法尼酯 X 受体（farnesoid X receptor，FXP）的结合激活细胞内受体实现的[9]。
1.2 卵圆细胞介导肝再生
在大鼠或小鼠的肝部分切除模型中，肝部分切除术后，当肝细胞复制被抑制时可以检测到卵圆细胞。在慢性肝脏疾病的患者中很难找到卵圆细胞介导肝再生。卵圆细胞的起源尚不清楚，但也有证据证明其可能来自胆管成分[38]。不像标准肝再生，卵圆细胞介导的肝再生没有肝细胞增殖。当肝细胞增殖受到限制时，胆管细胞增殖和扩大变成卵圆细胞。在这些细胞的基因中有胆管细胞和肝细胞的特征，卵圆细胞可转变成肝细胞表型[39]。
2 肝再生的临床应用
对肝再生的研究主要集中在对肝脏疾病的治疗，特别是对肝脏慢性疾病和肝脏肿瘤的各种肝切除术。近些年来，对肝再生的这些创新研究，肝切除术的效果得到了明显的提高[40]。但是术后肝衰竭仍然是肝切除术后最危险且是致命的术后并发症[41]。有许多不同的标准评价术后肝衰竭。最常用的是 50-50 的标准，即术后 5 d 的凝血酶原时间≤50%，血清总胆红素≥50 μmol/L[42]。在 2011 年，国际肝脏研究小组描述了术后肝衰竭的 3 个等级[43]。这个标准的制定是基于临床上对慢性肝脏疾病肝再生潜力有了更深刻的了解。
2.1 门静脉栓塞（PVE）
PVE 是最好的例子说明肝脏再生的研究在临床上的应用。术后肝衰竭与剩余肝脏体积较小有关[44]。门静脉阻断（PVO）后使剩余肝脏体积增大后行二期肝切除术是一种较好的策略[3]。在 20 世纪 80 年代，Kinoshita 等[45]最早应用 PVE。通常有两种阻断门静脉的方法，即放射学 PVE 和外科门静脉结扎（PVL）。肝脏损伤后，各种生长因子被激活并从小肠到达肝脏，这些因子是通过门静脉而非肝动脉到达肝脏的，进而诱导了许多分子和细胞的改变[46]。门静脉阻断诱导了阻断侧细胞的凋亡和对侧肝细胞的增生[47]。PVE 仅用于高风险肝切除术后剩余肝脏体积相对较小的患者[48]，没有普遍适用性。Schindl 等[44]观察了肝功能异常评分与相对肝脏剩余体积的关系后指出，需要避免肝功能异常的剩余肝脏体积的最小值为 26.6%。对于正常肝脏，如果剩余肝脏体积大于原肝体积的 30%，肝切除术是安全的；对于肝硬变的肝脏，基于我们目前的实践和可用数据，这个临界值是 50%[3]。
2.2 活体肝移植
活体供肝移植是肝再生方面最有代表性的研究，虽然亚洲提供的临床结果是可观的，但仍然有障碍需要克服。2008 年，Ghobrial 等[49]观察了活体肝脏供体的并发症发生情况，总体并发症发生率是 38%，148 例活体肝脏供体术后发生的并发症有 220 种，根据 Clavien 分级标准，Ⅰ级并发症占 48%，Ⅱ级并发症占 47%，Ⅲ级并发症<4%，Ⅳ级并发症（直接导致死亡）占 1.4%。为了活体肝脏供体的安全，需要尽量缩小移植肝的大小，但是移植肝的大小又与接受者的预后明确相关，因此必须保持两者之间的平衡。就供体安全性和受者预后而言，肝再生方面的研究对于改善供受体的临床预后是十分重要的。
2.3 小肝综合征
通过活体供肝移植进一步认识了肝再生，在小肝综合征的治疗方面也取得了一定进步。小肝综合征主要表现为长期胆汁郁积和难治性腹水[50]。术后 14 d 血清总胆红素大于 86.2 mol/L 被定义为长期胆汁淤积；难治性腹水被定义为术后 14 d 腹水量为 1 L/d 或者是术后 28 d 腹水量为 500 mL/d[51]。2008 年，Ikegami 等[52]总结了小肝综合征的可能原因及其可能的解决方案：移植物的体积大小、质量和血流量多少作为移植物相关因素，门静脉高压和肝脏疾病严重程度作为受者相关因素。右肝叶移植、辅助移植可克服移植物体积的不足；门静脉分流、脾区血流控制有利于入肝血流量的调控，可预防小肝综合征的发生。对移植物质量差者，可采用年轻的供者或供者的饮食计划以改善肝脏的脂肪变性；对于病情较重的受者，增加移植物的体积和调控血流量可能有助于其接受移植物。
2.4 联合肝脏分割和门静脉结扎分步肝切除术
联合肝脏分割和门静脉结扎分步肝切除术（associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy，ALPPS）指的是肝脏原位离断和门静脉选择性阻断，目的是诱导肝脏肥大。2012 年，Schnitzbauer 等[53]首次报道了此种手术方式，据报道该方法诱导肝脏肥大平均达 74%，结果优越于单独运用 PVL 或 PVE。Knoefel 等[54]证明 ALPPS 为治疗肝切除术以及 PVE 术后失败的患者导致的肝脏剩余体积不足提供了一个机会。Zhang 等[55]报道 ALPPS 明显提高了肝癌的可切除性，但其机制目前仍不明确。
2.5 干细胞和肝脏再生
2007 年，Takahashi 等[56]发现多能干细胞来自成人成纤维细胞。在以细胞为基础治疗肝脏疾病方面，该发现将有可能引发明显的治疗策略的改变。最近，有肝细胞移植成功的动物实验，证明肝干细胞的可能标志物是 lgr5, 并且干细胞需要 Wnt 蛋白的维持[57]。如果能解决干细胞的来源问题，将可以用不同的干细胞如自体诱导的多能干细胞、间叶细胞的干细胞、内源性肝干细胞/祖细胞等尽可能多的材料用于肝移植[58]。有研究[59]表明，骨髓间充质干细胞可以增加血管生长因子的表达，从而促进肝细胞生长因子的表达。2015 年，Wang 等[8]报道有分泌性蛋白 Wnt 覆盖的细胞就是干细胞，同时该报道称发现了位于中央静脉周围的干细胞，并且肝干细胞需要 Wnt 信号以保持它们干细胞的身份。这将有望提取肝干细胞进行体外培养出类肝器官。
3 最近的趋势和未来前景
组织工程学联合细胞、生物支架和活性分子可以作为一种有用的治疗方法[60]。其中 3D 支架起到至关重要的作用，通过调节细胞功能和诱导形成新的组织和器官，可为移植细胞提供足够的空间以及物理和生物信号，这些物理和生物信号促进了细胞的黏附、迁移、复制和分化；同时 3D 支架可以集合这些新生的细胞和基质释放入有功能的组织和器官[61]。2010 年，Ott 等[62]用脱细胞肺制造了人工生物肺，他们通过洗涤剂灌注成功制造了没有细胞的血管、气管和肺泡支架，并成功将再生的人工肺移植到原来的位置。在 2010 年，Uygun 等[63]演示了脱细胞三维肝脏的体系结构和它的功能脉管系统以及原始的基质成分；而且，移植物在体外可以达到再细胞化。说明这种人工肝是可行的。2013 年，Takebe 等[29]用多能干细胞构造了有功能的人工器官，通过体外培养的多能干细胞生产出了有脉管系统的人类肝脏。3D 打印技术指的是用 3D 模型或其他电子数据来源通过许多的过程制作三维物体，主要是在电脑的控制下通过对连续层的添加过程。在不久的将来，我们可以用 3D 打印技术打印生物肝脏。
4 总结
肝再生在许多年前就被人们所熟知，在最近几十年我们开始去了解其机制。近来研究者们专注于了解肝切除术后和肝移植术后肝脏的再生。用新的方法可以改变对肝功能异常的治疗策略，例如：术后肝剩余体积的不足和小肝综合征。肝再生有许多的临床应用，利用门静脉阻断可以允许切除大量的肝脏组织而又避免了肝功能衰竭的风险。肝细胞移植可以重新将肝细胞注入肝脏来治疗先天性肝脏代谢疾病。此外，肝再生疗法可以为活体肝移植提供创新支持。在不久的将来，我们可以用个人自己的细胞制作人工肝脏，这是最好的方法去支持肝脏移植，不需要用免疫抑制药物。总之，肝再生的研究为检测和治疗一系列肝脏疾病提供了新的策略。
肝脏具有一定的再生能力，受伤后短时间内可以恢复到原有体积[1-2]。临床上肝切除术后、肝移植术后或肝中毒损伤后均可以观察到肝再生，肝再生包括所有细胞的增生。肝切除术后肝细胞在 1 d 内则开始复制，但非实质细胞如内皮细胞、Kupffer 细胞和胆管细胞其修复时间开始得要晚些[3]。目前，负责维持肝脏再生的分子机制仍不十分清楚。但显而易见的是肝脏在细胞损伤和过度增长之间保持着一种微妙的平衡[4]。深入认识肝脏再生离不开临床问题。另外，一些新的实验方法提供了更多的关于肝再生和肝衰竭的信息[5]。笔者现就有关肝再生的研究（表 1）进行综述，旨在深刻了解肝再生机制基础上更好地在临床上开展肝移植及肝脏大部切除术，并为各种肝脏疾病提供更好的诊断及治疗措施。
表1
有关肝再生方面的研究
1 肝再生机制
肝切除术后剩余肝脏相应增生[1]。在部分肝切除术后，非成熟的肝细胞很快进入细胞周期，通过复制肝脏恢复了原有的体积。关于肝再生的生理触发器有2个主要观点[23]，一是肝部分切除术后，单位体积肝脏能量需求的增加产生一个早期的应力信号[24]；另一个是血流动力学因素的改变引起肝再生。虽然血液流动和肝脏再生有明确的相关性，但血液流动在肝再生时所扮演的角色仍不清楚[23]。几种不同的肝脏损伤包括病毒性和中毒引起的肝炎都可以引起类似的肝再生。
1.1 标准肝再生
肝再生的起始阶段，是各种炎症因子共同作用的结果[25]。在正常肝脏中，肝细胞通常处于 G0 期，肝脏损伤后便进入了 G1 期。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）是由 Kupffer 细胞产生的，通过结合各自的受体调控肝再生的启动阶段（G0 期到 G1 期）[26-27]。肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）和转化生长因子-α（transforming growth factor-α，TGF-α）被认为是启动 G1 期到 S 期起作用的因子[28-29]。这些因子通过结合相应的受体刺激了 DNA 的复制和细胞的有丝分裂[30]。TGF-β1 是被证明的肝细胞增殖抑制因子[31-32]。在正常的肝脏组织中，HGF 和 TGF-β 具有拮抗作用。在肝再生的起始阶段，HGF 信号比 TGF-β 更强大，而在肝再生的终末阶段，则会恢复到最初的平衡[33]。激活素是肝再生的一种抑制剂，它可以选择性地抑制肝脏细胞的复制；当肝脏的体积恢复到它原来的体积时，激活素 A、细胞凋亡机制和其他一些因素就会终止肝脏再生的进程[34]。最新研究发现，肝再生过程中各种炎症因子作用的同时会有胆管反应参与[7]。表 2 总结了参与肝再生的各种细胞因子和生长因子的功能[35]。
表2
参与肝脏再生的细胞因子
切应力对肝脏再生是一个强有力的刺激因素。肝切除术后，增加的门静脉血流增强了切应力，通过对肝细胞和肝窦内皮细胞的作用引起肝脏的再生和调节肝脏的大小。在内皮上的切应力是调节肝再生、肝体积、肝生长及萎缩的强大动力[36]。血流动力学增加了肝脏中的切应力，产生了一氧化氮。然后，一氧化氮引起了肝脏的再生级联[37]。近年研究发现，胆汁酸在肝再生过程中起到了重要的调控作用，胆汁酸对肝再生的调控通过其与法尼酯 X 受体（farnesoid X receptor，FXP）的结合激活细胞内受体实现的[9]。
1.2 卵圆细胞介导肝再生
在大鼠或小鼠的肝部分切除模型中，肝部分切除术后，当肝细胞复制被抑制时可以检测到卵圆细胞。在慢性肝脏疾病的患者中很难找到卵圆细胞介导肝再生。卵圆细胞的起源尚不清楚，但也有证据证明其可能来自胆管成分[38]。不像标准肝再生，卵圆细胞介导的肝再生没有肝细胞增殖。当肝细胞增殖受到限制时，胆管细胞增殖和扩大变成卵圆细胞。在这些细胞的基因中有胆管细胞和肝细胞的特征，卵圆细胞可转变成肝细胞表型[39]。
2 肝再生的临床应用
对肝再生的研究主要集中在对肝脏疾病的治疗，特别是对肝脏慢性疾病和肝脏肿瘤的各种肝切除术。近些年来，对肝再生的这些创新研究，肝切除术的效果得到了明显的提高[40]。但是术后肝衰竭仍然是肝切除术后最危险且是致命的术后并发症[41]。有许多不同的标准评价术后肝衰竭。最常用的是 50-50 的标准，即术后 5 d 的凝血酶原时间≤50%，血清总胆红素≥50 μmol/L[42]。在 2011 年，国际肝脏研究小组描述了术后肝衰竭的 3 个等级[43]。这个标准的制定是基于临床上对慢性肝脏疾病肝再生潜力有了更深刻的了解。
2.1 门静脉栓塞（PVE）
PVE 是最好的例子说明肝脏再生的研究在临床上的应用。术后肝衰竭与剩余肝脏体积较小有关[44]。门静脉阻断（PVO）后使剩余肝脏体积增大后行二期肝切除术是一种较好的策略[3]。在 20 世纪 80 年代，Kinoshita 等[45]最早应用 PVE。通常有两种阻断门静脉的方法，即放射学 PVE 和外科门静脉结扎（PVL）。肝脏损伤后，各种生长因子被激活并从小肠到达肝脏，这些因子是通过门静脉而非肝动脉到达肝脏的，进而诱导了许多分子和细胞的改变[46]。门静脉阻断诱导了阻断侧细胞的凋亡和对侧肝细胞的增生[47]。PVE 仅用于高风险肝切除术后剩余肝脏体积相对较小的患者[48]，没有普遍适用性。Schindl 等[44]观察了肝功能异常评分与相对肝脏剩余体积的关系后指出，需要避免肝功能异常的剩余肝脏体积的最小值为 26.6%。对于正常肝脏，如果剩余肝脏体积大于原肝体积的 30%，肝切除术是安全的；对于肝硬变的肝脏，基于我们目前的实践和可用数据，这个临界值是 50%[3]。
2.2 活体肝移植
活体供肝移植是肝再生方面最有代表性的研究，虽然亚洲提供的临床结果是可观的，但仍然有障碍需要克服。2008 年，Ghobrial 等[49]观察了活体肝脏供体的并发症发生情况，总体并发症发生率是 38%，148 例活体肝脏供体术后发生的并发症有 220 种，根据 Clavien 分级标准，Ⅰ级并发症占 48%，Ⅱ级并发症占 47%，Ⅲ级并发症<4%，Ⅳ级并发症（直接导致死亡）占 1.4%。为了活体肝脏供体的安全，需要尽量缩小移植肝的大小，但是移植肝的大小又与接受者的预后明确相关，因此必须保持两者之间的平衡。就供体安全性和受者预后而言，肝再生方面的研究对于改善供受体的临床预后是十分重要的。
2.3 小肝综合征
通过活体供肝移植进一步认识了肝再生，在小肝综合征的治疗方面也取得了一定进步。小肝综合征主要表现为长期胆汁郁积和难治性腹水[50]。术后 14 d 血清总胆红素大于 86.2 mol/L 被定义为长期胆汁淤积；难治性腹水被定义为术后 14 d 腹水量为 1 L/d 或者是术后 28 d 腹水量为 500 mL/d[51]。2008 年，Ikegami 等[52]总结了小肝综合征的可能原因及其可能的解决方案：移植物的体积大小、质量和血流量多少作为移植物相关因素，门静脉高压和肝脏疾病严重程度作为受者相关因素。右肝叶移植、辅助移植可克服移植物体积的不足；门静脉分流、脾区血流控制有利于入肝血流量的调控，可预防小肝综合征的发生。对移植物质量差者，可采用年轻的供者或供者的饮食计划以改善肝脏的脂肪变性；对于病情较重的受者，增加移植物的体积和调控血流量可能有助于其接受移植物。
2.4 联合肝脏分割和门静脉结扎分步肝切除术
联合肝脏分割和门静脉结扎分步肝切除术（associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy，ALPPS）指的是肝脏原位离断和门静脉选择性阻断，目的是诱导肝脏肥大。2012 年，Schnitzbauer 等[53]首次报道了此种手术方式，据报道该方法诱导肝脏肥大平均达 74%，结果优越于单独运用 PVL 或 PVE。Knoefel 等[54]证明 ALPPS 为治疗肝切除术以及 PVE 术后失败的患者导致的肝脏剩余体积不足提供了一个机会。Zhang 等[55]报道 ALPPS 明显提高了肝癌的可切除性，但其机制目前仍不明确。
2.5 干细胞和肝脏再生
2007 年，Takahashi 等[56]发现多能干细胞来自成人成纤维细胞。在以细胞为基础治疗肝脏疾病方面，该发现将有可能引发明显的治疗策略的改变。最近，有肝细胞移植成功的动物实验，证明肝干细胞的可能标志物是 lgr5, 并且干细胞需要 Wnt 蛋白的维持[57]。如果能解决干细胞的来源问题，将可以用不同的干细胞如自体诱导的多能干细胞、间叶细胞的干细胞、内源性肝干细胞/祖细胞等尽可能多的材料用于肝移植[58]。有研究[59]表明，骨髓间充质干细胞可以增加血管生长因子的表达，从而促进肝细胞生长因子的表达。2015 年，Wang 等[8]报道有分泌性蛋白 Wnt 覆盖的细胞就是干细胞，同时该报道称发现了位于中央静脉周围的干细胞，并且肝干细胞需要 Wnt 信号以保持它们干细胞的身份。这将有望提取肝干细胞进行体外培养出类肝器官。
3 最近的趋势和未来前景
组织工程学联合细胞、生物支架和活性分子可以作为一种有用的治疗方法[60]。其中 3D 支架起到至关重要的作用，通过调节细胞功能和诱导形成新的组织和器官，可为移植细胞提供足够的空间以及物理和生物信号，这些物理和生物信号促进了细胞的黏附、迁移、复制和分化；同时 3D 支架可以集合这些新生的细胞和基质释放入有功能的组织和器官[61]。2010 年，Ott 等[62]用脱细胞肺制造了人工生物肺，他们通过洗涤剂灌注成功制造了没有细胞的血管、气管和肺泡支架，并成功将再生的人工肺移植到原来的位置。在 2010 年，Uygun 等[63]演示了脱细胞三维肝脏的体系结构和它的功能脉管系统以及原始的基质成分；而且，移植物在体外可以达到再细胞化。说明这种人工肝是可行的。2013 年，Takebe 等[29]用多能干细胞构造了有功能的人工器官，通过体外培养的多能干细胞生产出了有脉管系统的人类肝脏。3D 打印技术指的是用 3D 模型或其他电子数据来源通过许多的过程制作三维物体，主要是在电脑的控制下通过对连续层的添加过程。在不久的将来，我们可以用 3D 打印技术打印生物肝脏。
4 总结
肝再生在许多年前就被人们所熟知，在最近几十年我们开始去了解其机制。近来研究者们专注于了解肝切除术后和肝移植术后肝脏的再生。用新的方法可以改变对肝功能异常的治疗策略，例如：术后肝剩余体积的不足和小肝综合征。肝再生有许多的临床应用，利用门静脉阻断可以允许切除大量的肝脏组织而又避免了肝功能衰竭的风险。肝细胞移植可以重新将肝细胞注入肝脏来治疗先天性肝脏代谢疾病。此外，肝再生疗法可以为活体肝移植提供创新支持。在不久的将来，我们可以用个人自己的细胞制作人工肝脏，这是最好的方法去支持肝脏移植，不需要用免疫抑制药物。总之，肝再生的研究为检测和治疗一系列肝脏疾病提供了新的策略。
