引用本文： 伍刚, 郑波, 黄锐, 杨训. HBx 下调 miR-16 家族表达促进肝癌细胞恶性转化. 中国普外基础与临床杂志, 2017, 24(4): 412-419. doi: 10.7507/1007-9424.201611043 复制
慢性乙肝病毒感染是亚洲及西非地区肝细胞癌（简称肝癌）的主要病因，而乙肝病毒阳性的肝癌相比于阴性者在临床进程中表现出更为激进的生物学特点[1]。乙型肝炎病毒 X（hepatitis B virus X protein，HBx）蛋白是由 HBV 所编码的一种反式激活多功能蛋白，高表达于大部分肝癌组织中，其能在体外促进肝细胞恶性转化，且能导致小鼠 HCC 发生[2]。miRNA 作为基因组的转录产物，虽不编码蛋白，但通过沉默靶标蛋白表达而广泛参与人类各种疾病尤其是肿瘤的发生和进展。根据 miRNA 在特定肿瘤组织中的高/低表达相应地将其称之为促/抑癌 miRNA[3]。基因组中位置变化如断裂/重排，转录水平的表观遗传修饰如甲基化（转录因子调控）以及 miRNA 加工过程变化均可导致 miRNA 自身的表达变化[4]。因此，miRNA 与转录因子等可形成复杂的调控网络进而参与肿瘤的发生及进展。
本研究将肝癌的始动因素 HBx 和 miRNA 联系在一起，将 HBx 的多功能调控作用拓展到非编码 RNA 领域，从 miRNA 这一重要的表观遗传分子来探讨 HBx 促进肝癌发生和进展的分子机制，为临床治疗乙肝相关肝癌提供新思路。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和材料
PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 试剂盒（Takara 生物科技公司，大连，中国）。HBx 和 β-actin 的实时定量聚合酶链反应（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）实验利用 SYBR PrimeScript RT-PCR 试剂盒完成（Takara 生物科技公司）。U6、miR-15a、miR-15b 和 miR-16 的 qRT-PCR 检测盒购自上海吉玛公司（GenePharma，上海）。Western blot 所用的抗体分别是 HBx（sc-71239；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA），β-actin（sc-130301；Santa Cruz），c-myc〔9402；Cell Signaling Technology，Boston，MA，USA〕，CCND1（2926；Cell Signaling Technology），and GAPDH （BA2913；博士德，武汉）。miR-16 抑制物、miR-15a/-16 的模拟物、c-myc 特异的 siRNA 及所有的阴性对照（negative control，NC）参照均购自上海吉玛公司。
1.2 细胞培养
人肝癌细胞系 HepG2、SK-HEP-1 和 Huh7 购自 ATCC 细胞库并培养于添加 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中。空载体对照 HepG2-vc 细胞、单克隆筛选稳定表达 HBx 的 HepG2-hbx 和 HepG2-2.1 细胞除常规培养外额外添加 500 ng/mL G418（Geneticin，遗传霉素，默克公司），HepG2.2.15 细胞（稳定转染整个 HBV 基因组的 HepG2 细胞，国外建系）常规培养外添加 380 ng/mL 的 G418。
1.3 siRNA 和质粒信息
将 HBx 开放阅读框（Adr 亚型，AB299858，按 NCBI 序列由上海生工全序列合成）克隆到 PCDNA3.1 质粒中得到 PCDNA3.1-hbx 质粒。所有 RNA 核苷酸包括 miR-15a/16 的模拟物和抑制物、c-myc 特异的小干扰 RNA（si-myc）和相应的阴性对照均购自上海吉玛公司。
1.4 细胞转染
细胞转染均按照 Lipo2000 试剂盒（invitrogen，美国）说明书进行。除 miR-16 抑制物（200 nmol/L），所有转染浓度均为 50 nmol/L。
1.4.1 HBx 质粒瞬时转染 分别取 1×106 个 HepG2、SK-HEP-1 和 Huh7 细胞置于 6 孔板中，利用 Lipo2000 转染 2 μg PCDNA3.1 和 PCDNA3.1-hbx 质粒，48 h 收集细胞 RNA。
1.4.2 HBx 稳定表达的 HepG2 细胞单克隆挑选 HepG2 细胞转染 PCDNA3.1-hbx 质粒和空载体 24 h 后，加入 900 ng/mL 的 G418 进行抗性筛选，挑选存活的单克隆细胞扩大培养（整合了 PCDNA3.1-hbx 质粒）。通过 qRT-PCR 和 Western blot 对多个单克隆细胞系进行 HBx mRNA 和蛋白表达检测，最终获得 HBx 稳定表达的 HepG2-hbx 和 HepG2-2.1 细胞以及载体对照细胞 HepG2-vc。
1.5 qRT-PCR
细胞总 RNA 提取采用 TRIzol 试剂并经 DNase Ⅰ（Takara，大连） 处理，利用 PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 试剂盒合成 c-myc 的 cDNA，利用 SYBR PrimeScript RT-PCR 试剂盒检测 c-myc 在 HepG2-hbx 细胞、HepG2-2.1 细胞和 HepG2.2.15 细胞中的表达情况，以 HepG2-vc 细胞作为对照。
将 si-myc 瞬时转染 HepG2-hbx 细胞，观察转染后 24、28、72 及 96 h 后 miR-15a、miR-16 和 c-myc 的表达情况，以 NC 转染组作为对照。
miR-15a，miR-15b 和 miR-16 在肝癌细胞系中的表达均采用上海吉玛公司提供的特定 qRT-PCR 检测盒，U6 小分子 RNA 作为内参照。
1.6 免疫印迹
采用 RIPA 液（碧云天，海门）裂解提取肝癌细胞总蛋白，HBx、c-myc 和 CCND1 的 Western blot 检测按相应试剂盒说明进行。
1.7 细胞增殖、细胞凋亡及细胞周期检测
1.7.1 细胞增殖检测 CCK-8 试剂盒（CCK-8，同仁化学，日本）用于细胞增殖检测。① 球囊培养方法：取 1 000 个/mL 的 HepG2-vc 和 HepG2-hbx 细胞悬液培养于无血清的 DMEM-F12 中（添加 1∶50 的 B27 无血清培养基添加因子、20 ng/mL 表皮生长因子、0.4% 的牛血清白蛋白和 4 mg/mL 的胰岛素），培养 10～14 d 后显微镜下观察计数。② 克隆形成实验：miR-15a 和 miR-16 模拟物转染 24 h 后，分别取 500 个有活力的 HepG2-hbx 细胞和 1 000 个 HepG2.2.15 细胞置于添加 10 mL 完全培养基的 6 cm 培养皿中培养 2～3 周。③ 利用亚甲基蓝进行克隆染色完成克隆形成实验，NC 转染组作为对照。
1.7.2 细胞凋亡检测 NC 和 miR-15a/16 mimic 转染后 48 h，采用 Annexin V-FITC 试剂盒（Bender MedSystems，维也纳，奥地利）在流式细胞仪上完成细胞凋亡检测。根据转染后 24、48、72 及 96 h 的吸光度值（A 值）绘制细胞生长曲线。
1.7.3 细胞周期检测 HepG2-hbx 肝癌细胞转染 mimic 及 NC 24 h 后再加入 100 ng/mL 诺考达唑（nocodazole）处理 20 h，收集所有细胞，PBS 洗涤 1 次，70% 乙醇固定。细胞 DNA 含量由 KGA512 试剂盒（凯基生物科技公司，南京）处理后再于流式细胞仪上进行细胞周期分析。
1.8 萤光素酶报告实验
pGL3cm-CCND1-3′UTR 野生型和 pGL3cm-CCND1-3′UTR 突变型载体由中山大学生命科学院庄诗美教授提供。取 1 000 个 HepG2-hbx 和 HepG2-vc 细胞培养于 48 孔培养皿并共转染 2 ng pRL-TK 质粒（Promega，Madison，WI，USA）和 5 ng 野生型或突变体萤光素酶，48 h 后进行萤光素酶活性检测。统计比较细胞中野生型和突变体 2 组之间的萤光素酶活性。
1.9 miRNA 芯片分析
HepG2-hbx 和 HepG2-vc 2 组细胞之间的 miRNA 差异交由深圳微芯公司分析（人 miRNA V3+探针，Invitrogen，美国）。
1.10 统计学方法
采用 SPSS 16.0 软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差（ ）表示，2组间数据比较采用 Student’st 检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 建立 HepG2-hbx、 HepG2-2.1 和 HepG2-vc 细胞系
为研究 HBx 对肝癌细胞内 miRNA 表达谱的影响，本研究通过 G418 抗生素筛选单克隆的方式建立了稳定表达 HBx 及相应空载体的细胞系（HepG2.2.15 细胞作为阳性对照）。qRT-PCR 及 Western blot 实验结果证实各细胞中 HBx 的 mRNA 和蛋白表达情况（图 1 和图 2），HepG2-hbx 和 HepG2-2.1 细胞能稳定表达 HBx 的 mRNA 和蛋白。其中，HepG2-2.10 细胞是挑选的克隆之一。接下来，球囊培养结果证实，HBx 稳定表达可促使 HepG2 细胞形成更大及更多的球囊（图 3 和图 4）。
图1
示 RT-PCR 检测结果，见 HepG2-hbx、 HepG2-2.1 和 HepG2.2.15 细胞中有 HBx mRNA 表达
图2
Western blot 检测结果，见 HepG2-2.1 和 HepG2-hbx 细胞中的 HBx 蛋白表达
图3
HBx 稳定表达促使 HepG2 细胞形成更大的球囊体
图4
HBx 稳定表达使得 HepG2 细胞形成更多的球囊体。 与 HepG2-vc 比较，***P<0.001
2.2 HBx 在肝癌细胞中下调 miR-16 家族表达
miRNA 芯片分析结果显示，相比于 HepG2-vc 细胞，HBx-hbx 细胞内 miR-16 家族包括 miR-15a、miR-15b 和 miR-16 显著低表达（>2 倍），经典的促癌 miRNA miR-21 高表达（>2 倍）。qRT-PCR 结果证实，HBx 稳定（图 5）或瞬时（图 6）转染均可显著抑制 miR-16 家族在 HepG2 细胞中的表达，这也验证了芯片结果的可靠性。同样，HBx 瞬时转染还能在 Huh7（图 7）和 SK-HEP-1（图 8）肝癌细胞中下调 miR-16 家族表达，提示 HBx 对于 miR-16 家族的抑制在不同肝癌细胞株中具有普遍性。
图5
HBx 稳定转染在 HepG2 细胞中显著下调 miR-16 家族的表达。与 HepG2-vc 细胞比较，**P<0.01；***P<0.001
图6
HBx 瞬时转染在 HepG2 细胞中显著下调 miR-16 家族表达。 与载体比较，***P<0.001
图7
HBx 瞬时转染在 Huh7 肝癌细胞中显著下调 miR-16 家族表达。 与载体比较，*P<0.05；***P<0.001
图8
HBx 瞬时转染在 SK-HEP-1 肝癌细胞中显著下调 miR-16 家族表达。 与载体比较，*P<0.05；**P<0.01
本研究进一步检测了 HBx 对于 CCND1（miR-16 家族靶基因之一）表达量及活性的影响，后者作用于细胞周期 G1/S 检查点，能促进细胞增殖。荧光素酶报告系统检测结果显示：相比对照组，HBx 可显著升高 HepG2 细胞中 CCND1 的活性〔（38±5）%，图 9〕。此外，Western blot 实验证实，在 HBx 稳定表达的 HepG2 细胞中，CCND1 表达出现明显上调（图 10）。该结果提示，HBx 可在体外导致肝癌细胞中 miR-16 家族低表达，并上调其靶基因 CCND1 的表达及活性。
图9
HBx 稳定表达在 HepG2 细胞中显著上调 CCND1 的活性。 与突变体 CCND1 比较，***P<0.001
图10
HBx 稳定表达在 HepG2 细胞中显著上调 CCND1 蛋白表达
2.3 沉默 c-myc 表达可恢复 HepG2-hbx 细胞中 miR-15a/16 的表达
qRT-PCR（图 11）及 Western blot（图 12）实验结果显示，相比于载体对照细胞，HBx 稳定转染可显著上调 HepG2 细胞中 c-myc 的 mRNA 和蛋白表达。此外，Western blot 结果也验证了 si-myc 的有效性，相比于 si-NC，si-myc 可在转染后 48 和 72 h 显著下调 c-myc 的表达（图 12）。进一步的 qRT-PCR 结果证实：在转染 si-myc（即沉默 c-myc 表达）后不同时间点（24、28、72 及 96 h）miR-15a 和 miR-16 的表达明显上调（图 13），其中以 miR-15a 更为明显。该结果提示，HBx 在 HepG2 细胞中下调 miR-16 家族的表达，可能在一定程度上由 c-myc 介导。
图11
HBx 稳定表达在 HepG2 细胞中显著上调 c-myc 的 mRNA 表达。 与 HepG2-vc 细胞比较，*P<0.05；**P<0.01
图12
HBx 稳定表达在 HepG2 细胞中显著上调 c-myc 的蛋白表达，si-myc 能显著下调 c-myc 的蛋白表达
图13
si-myc 瞬时转染 HepG2-hbx 细胞后明显上调了 miR-15a 和 miR-16 的表达，下调 c-myc 表达。 与 NC 组相比，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001
2.4 沉默 miR-16 表达可促进 HepG2 细胞的周期进展和增殖
CCK-8 实验结果显示，相比于 NC 转染组，转染 miR-16 抑制物后 48、72 和 96 h 可明显促进 HepG2 细胞的增殖（图 14）。相对应的是，miR-16 抑制物可加速 HepG2 细胞的 G1/S 期进展（图 15）。
图14
miR-16 抑制物可显著促进 HepG2 细胞的生长。 与 NC 转染组相比，***P<0.001
图15
miR-16 抑制物可使 HepG2 细胞快速通过 G1/S 期。 与 NC 组相比，**P<0.01；***P<0.001
2.5 外源表达的 miR-15a/16 可以通过阻滞细胞周期的进展和诱导凋亡以抑制 HepG2-hbx 细胞的生存
CCK-8 实验结果显示，miR-15a 和 miR-16 模拟物均能在转染 72 及 96 h 后显著抑制 HepG2-hbx 细胞的增殖（图 16）。克隆形成（图 17）及球囊培养实验（图 18）结果证实，miR-15a 和 miR-16 模拟物可明显降低 HepG2-hbx 细胞的生存能力。相比于 miR-15a 和 miR-16 转染组，NC 组能形成更大和更多的球囊和克隆（图 19）。
图16
miR-15a/16 的模拟物瞬时转染可显著抑制 HepG2-hbx 细胞的增殖。 与 NC 组相比，*P<0.05；***P<0.001
图17
外源表达的 miR-15a 和 miR-16 可显著降低 HepG2-hbx 和 HepG2.2.15 细胞的平板克隆形成能力
图18
外源表达的 miR-15a 和 miR-16 导致 HepG2-hbx 细胞形成较小的球囊体
图19
外源表达的 miR-15a 和 miR-16 导致 HepG2-hbx 细胞形成更少的球囊体。 与 NC 组相比，***P<0.001
细胞周期实验结果显示，外源表达的 miR-15a 和 miR-16 可将 HepG2-hbx 细胞周期阻滞于 G1 期，NC 转染组处于 G1 期的细胞数量显著少于其他转染组（图 20）。此外，流式细胞仪检测结果显示，miR-15a 和 miR-16 模拟物可诱导 HepG2-hbx 细胞发生明显的早期凋亡（图 21）。
图20
外源表达的 miR-15a 和 miR-16 阻滞 HepG2-hbx 细胞于 G1 期
图21
外源表达的 miR-15a 和 miR-16 导致 HepG2-hbx 细胞发生明显的早期凋亡
3 讨论
HBx 具有协转录激活功能，可通过调控蛋白编码基因表达而激活细胞内多个肿瘤相关信号通路来参与肝癌的起始和进展。然而，人基因组大部分转录产物为非编码 RNA，包括 siRNA、miRNA 及 lncRNA（长链非编码 RNA），它们均能调控基因表达[5]。miRNA 广泛参与了人类疾病进程包括肿瘤的发生和进展[6]。本研究将 HBx 的调控功能拓展到非编码 RNA 领域以明确 miRNAs 在 HBV 相关肝癌发生进展中所扮演的角色。
HBx 在 HepG2 细胞内导致大量的 miRNAs 低表达包括 miR-16 家族，只上调少数 miRNAs 包括 miR-21 这一公认的促癌 miRNA。这种 miRNA 表达模式被认为是肿瘤所特有的[4]。Liu 等[6]利用 miRNA 芯片及 Northern blot 比较了 HepG2.2.15 细胞（整合了整个 HBV 基因组，可分泌乙肝表面抗原）和父系 HepG2 细胞之间的 miRNA 表达差异，其中 miR-15a、miR-16、miR-338 和 miR-422a 在 HepG2.2.15 细胞中的低表达与本研究结果是一致的。本研究直接将 HBx 转入 HepG2 细胞并发现 miR-16 家族显著低表达于 HepG2-hbx 和 HepG2.2.15 细胞中。尽管如此，HepG2.2.15 细胞仍然不能模拟 HBV 在肝脏内的自然感染过程，miR-16 家族在 HBV 感染导致肝脏病变中的表达和作用仍有待进一步的研究。
miR-16 家族包括 miR-15a/16-1 和 miR-15b/16-2，分别位于人 13q14 和 3 号染色体，且与 DLEU2/SMC4 共转录[7]。该家族通过靶向调控 CCND1-3、CCNE1 和 CDK6 而成为细胞周期 G1/S 检查点的关键调控者[8-9]。该家族在多种实体和血液肿瘤中低表达并能靶向沉默多个癌基因包括 c-myb、Bmi-1、bcl-2、WNT3A 和 Wip1[10]。此外，该家族还与肿瘤化疗敏感性相关[11]。相应地，13q14 染色体（miR-15a/16-1）的缺失与分化肝癌的细胞周期进展和增殖有关[12]，也和恶性程度高的肝细胞癌生物学特点相关[13]。具体到肝癌，miR-15a/16-1 参与预测肝癌患者静脉转移和总体生存[14]，miR-15b 高表达与肝癌切除术后的低复发率有关[15]。此外，miR-15b 和 miR-16 在鼠肝星状细胞激活过程中低表达[16]，后者还能促进星状细胞凋亡[17]。值得注意的是，HBx 能在人和鼠肝中激活肝星状细胞并促其生长[18]。因此，上述报道及本研究结果均提示 miR-16 家族的异常表达参与了 HBV 感染相关的肝纤维化、肝硬变及肝癌的发生进展。
除能靶向沉默上述癌基因外，miR-16 家族自身也是肿瘤相关信号通路的下游靶点。P53 能促进 miR-15a/16-1 的转录后加工成熟过程[19]，E2F1 和 E2F3 能在 G1/S 检查点直接诱导 miR-15b/16-2 表达[20]。射线照射能在人脑胶质瘤和内皮细胞中诱导 miR-15a/-16 的表达[21-22]。相反，c-myc 和 Lin28B 能在人 B 细胞淋巴瘤中抑制 miR-16 家族表达>1.5 倍[23]，这也与本研究发现的 HBx-c-myc-miR-16 通路相呼应。 重要的是，c-myc 在肝癌的发生中被认为占据中心地位[24]。因此，本研究发现的 HBx 能上调 c-myc 表达充分说明了 HBV 感染在肝癌发生中的重要性。
综上，本研究发现 HBx 能在体外导致人肝癌细胞内 miRNA 异常表达，包括 c-myc 介导的 miR-16 家族低表达。外源表达的 miR-15a/-16 能通过诱导细胞周期阻滞和诱导凋亡而抑制 HepG2-hbx 的增殖、克隆形成和非贴壁生长能力。因此，本实验结果也展示了 miR-16 家族在治疗人肝脏 HBV 慢性感染疾病中的前景。
慢性乙肝病毒感染是亚洲及西非地区肝细胞癌（简称肝癌）的主要病因，而乙肝病毒阳性的肝癌相比于阴性者在临床进程中表现出更为激进的生物学特点[1]。乙型肝炎病毒 X（hepatitis B virus X protein，HBx）蛋白是由 HBV 所编码的一种反式激活多功能蛋白，高表达于大部分肝癌组织中，其能在体外促进肝细胞恶性转化，且能导致小鼠 HCC 发生[2]。miRNA 作为基因组的转录产物，虽不编码蛋白，但通过沉默靶标蛋白表达而广泛参与人类各种疾病尤其是肿瘤的发生和进展。根据 miRNA 在特定肿瘤组织中的高/低表达相应地将其称之为促/抑癌 miRNA[3]。基因组中位置变化如断裂/重排，转录水平的表观遗传修饰如甲基化（转录因子调控）以及 miRNA 加工过程变化均可导致 miRNA 自身的表达变化[4]。因此，miRNA 与转录因子等可形成复杂的调控网络进而参与肿瘤的发生及进展。
本研究将肝癌的始动因素 HBx 和 miRNA 联系在一起，将 HBx 的多功能调控作用拓展到非编码 RNA 领域，从 miRNA 这一重要的表观遗传分子来探讨 HBx 促进肝癌发生和进展的分子机制，为临床治疗乙肝相关肝癌提供新思路。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和材料
PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 试剂盒（Takara 生物科技公司，大连，中国）。HBx 和 β-actin 的实时定量聚合酶链反应（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）实验利用 SYBR PrimeScript RT-PCR 试剂盒完成（Takara 生物科技公司）。U6、miR-15a、miR-15b 和 miR-16 的 qRT-PCR 检测盒购自上海吉玛公司（GenePharma，上海）。Western blot 所用的抗体分别是 HBx（sc-71239；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA），β-actin（sc-130301；Santa Cruz），c-myc〔9402；Cell Signaling Technology，Boston，MA，USA〕，CCND1（2926；Cell Signaling Technology），and GAPDH （BA2913；博士德，武汉）。miR-16 抑制物、miR-15a/-16 的模拟物、c-myc 特异的 siRNA 及所有的阴性对照（negative control，NC）参照均购自上海吉玛公司。
1.2 细胞培养
人肝癌细胞系 HepG2、SK-HEP-1 和 Huh7 购自 ATCC 细胞库并培养于添加 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中。空载体对照 HepG2-vc 细胞、单克隆筛选稳定表达 HBx 的 HepG2-hbx 和 HepG2-2.1 细胞除常规培养外额外添加 500 ng/mL G418（Geneticin，遗传霉素，默克公司），HepG2.2.15 细胞（稳定转染整个 HBV 基因组的 HepG2 细胞，国外建系）常规培养外添加 380 ng/mL 的 G418。
1.3 siRNA 和质粒信息
将 HBx 开放阅读框（Adr 亚型，AB299858，按 NCBI 序列由上海生工全序列合成）克隆到 PCDNA3.1 质粒中得到 PCDNA3.1-hbx 质粒。所有 RNA 核苷酸包括 miR-15a/16 的模拟物和抑制物、c-myc 特异的小干扰 RNA（si-myc）和相应的阴性对照均购自上海吉玛公司。
1.4 细胞转染
细胞转染均按照 Lipo2000 试剂盒（invitrogen，美国）说明书进行。除 miR-16 抑制物（200 nmol/L），所有转染浓度均为 50 nmol/L。
1.4.1 HBx 质粒瞬时转染 分别取 1×106 个 HepG2、SK-HEP-1 和 Huh7 细胞置于 6 孔板中，利用 Lipo2000 转染 2 μg PCDNA3.1 和 PCDNA3.1-hbx 质粒，48 h 收集细胞 RNA。
1.4.2 HBx 稳定表达的 HepG2 细胞单克隆挑选 HepG2 细胞转染 PCDNA3.1-hbx 质粒和空载体 24 h 后，加入 900 ng/mL 的 G418 进行抗性筛选，挑选存活的单克隆细胞扩大培养（整合了 PCDNA3.1-hbx 质粒）。通过 qRT-PCR 和 Western blot 对多个单克隆细胞系进行 HBx mRNA 和蛋白表达检测，最终获得 HBx 稳定表达的 HepG2-hbx 和 HepG2-2.1 细胞以及载体对照细胞 HepG2-vc。
1.5 qRT-PCR
细胞总 RNA 提取采用 TRIzol 试剂并经 DNase Ⅰ（Takara，大连） 处理，利用 PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 试剂盒合成 c-myc 的 cDNA，利用 SYBR PrimeScript RT-PCR 试剂盒检测 c-myc 在 HepG2-hbx 细胞、HepG2-2.1 细胞和 HepG2.2.15 细胞中的表达情况，以 HepG2-vc 细胞作为对照。
将 si-myc 瞬时转染 HepG2-hbx 细胞，观察转染后 24、28、72 及 96 h 后 miR-15a、miR-16 和 c-myc 的表达情况，以 NC 转染组作为对照。
miR-15a，miR-15b 和 miR-16 在肝癌细胞系中的表达均采用上海吉玛公司提供的特定 qRT-PCR 检测盒，U6 小分子 RNA 作为内参照。
1.6 免疫印迹
采用 RIPA 液（碧云天，海门）裂解提取肝癌细胞总蛋白，HBx、c-myc 和 CCND1 的 Western blot 检测按相应试剂盒说明进行。
1.7 细胞增殖、细胞凋亡及细胞周期检测
1.7.1 细胞增殖检测 CCK-8 试剂盒（CCK-8，同仁化学，日本）用于细胞增殖检测。① 球囊培养方法：取 1 000 个/mL 的 HepG2-vc 和 HepG2-hbx 细胞悬液培养于无血清的 DMEM-F12 中（添加 1∶50 的 B27 无血清培养基添加因子、20 ng/mL 表皮生长因子、0.4% 的牛血清白蛋白和 4 mg/mL 的胰岛素），培养 10～14 d 后显微镜下观察计数。② 克隆形成实验：miR-15a 和 miR-16 模拟物转染 24 h 后，分别取 500 个有活力的 HepG2-hbx 细胞和 1 000 个 HepG2.2.15 细胞置于添加 10 mL 完全培养基的 6 cm 培养皿中培养 2～3 周。③ 利用亚甲基蓝进行克隆染色完成克隆形成实验，NC 转染组作为对照。
1.7.2 细胞凋亡检测 NC 和 miR-15a/16 mimic 转染后 48 h，采用 Annexin V-FITC 试剂盒（Bender MedSystems，维也纳，奥地利）在流式细胞仪上完成细胞凋亡检测。根据转染后 24、48、72 及 96 h 的吸光度值（A 值）绘制细胞生长曲线。
1.7.3 细胞周期检测 HepG2-hbx 肝癌细胞转染 mimic 及 NC 24 h 后再加入 100 ng/mL 诺考达唑（nocodazole）处理 20 h，收集所有细胞，PBS 洗涤 1 次，70% 乙醇固定。细胞 DNA 含量由 KGA512 试剂盒（凯基生物科技公司，南京）处理后再于流式细胞仪上进行细胞周期分析。
1.8 萤光素酶报告实验
pGL3cm-CCND1-3′UTR 野生型和 pGL3cm-CCND1-3′UTR 突变型载体由中山大学生命科学院庄诗美教授提供。取 1 000 个 HepG2-hbx 和 HepG2-vc 细胞培养于 48 孔培养皿并共转染 2 ng pRL-TK 质粒（Promega，Madison，WI，USA）和 5 ng 野生型或突变体萤光素酶，48 h 后进行萤光素酶活性检测。统计比较细胞中野生型和突变体 2 组之间的萤光素酶活性。
1.9 miRNA 芯片分析
HepG2-hbx 和 HepG2-vc 2 组细胞之间的 miRNA 差异交由深圳微芯公司分析（人 miRNA V3+探针，Invitrogen，美国）。
1.10 统计学方法
采用 SPSS 16.0 软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差（ ）表示，2组间数据比较采用 Student’st 检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 建立 HepG2-hbx、 HepG2-2.1 和 HepG2-vc 细胞系
为研究 HBx 对肝癌细胞内 miRNA 表达谱的影响，本研究通过 G418 抗生素筛选单克隆的方式建立了稳定表达 HBx 及相应空载体的细胞系（HepG2.2.15 细胞作为阳性对照）。qRT-PCR 及 Western blot 实验结果证实各细胞中 HBx 的 mRNA 和蛋白表达情况（图 1 和图 2），HepG2-hbx 和 HepG2-2.1 细胞能稳定表达 HBx 的 mRNA 和蛋白。其中，HepG2-2.10 细胞是挑选的克隆之一。接下来，球囊培养结果证实，HBx 稳定表达可促使 HepG2 细胞形成更大及更多的球囊（图 3 和图 4）。
图1
示 RT-PCR 检测结果，见 HepG2-hbx、 HepG2-2.1 和 HepG2.2.15 细胞中有 HBx mRNA 表达
图2
Western blot 检测结果，见 HepG2-2.1 和 HepG2-hbx 细胞中的 HBx 蛋白表达
图3
HBx 稳定表达促使 HepG2 细胞形成更大的球囊体
图4
HBx 稳定表达使得 HepG2 细胞形成更多的球囊体。 与 HepG2-vc 比较，***P<0.001
2.2 HBx 在肝癌细胞中下调 miR-16 家族表达
miRNA 芯片分析结果显示，相比于 HepG2-vc 细胞，HBx-hbx 细胞内 miR-16 家族包括 miR-15a、miR-15b 和 miR-16 显著低表达（>2 倍），经典的促癌 miRNA miR-21 高表达（>2 倍）。qRT-PCR 结果证实，HBx 稳定（图 5）或瞬时（图 6）转染均可显著抑制 miR-16 家族在 HepG2 细胞中的表达，这也验证了芯片结果的可靠性。同样，HBx 瞬时转染还能在 Huh7（图 7）和 SK-HEP-1（图 8）肝癌细胞中下调 miR-16 家族表达，提示 HBx 对于 miR-16 家族的抑制在不同肝癌细胞株中具有普遍性。
图5
HBx 稳定转染在 HepG2 细胞中显著下调 miR-16 家族的表达。与 HepG2-vc 细胞比较，**P<0.01；***P<0.001
图6
HBx 瞬时转染在 HepG2 细胞中显著下调 miR-16 家族表达。 与载体比较，***P<0.001
图7
HBx 瞬时转染在 Huh7 肝癌细胞中显著下调 miR-16 家族表达。 与载体比较，*P<0.05；***P<0.001
图8
HBx 瞬时转染在 SK-HEP-1 肝癌细胞中显著下调 miR-16 家族表达。 与载体比较，*P<0.05；**P<0.01
本研究进一步检测了 HBx 对于 CCND1（miR-16 家族靶基因之一）表达量及活性的影响，后者作用于细胞周期 G1/S 检查点，能促进细胞增殖。荧光素酶报告系统检测结果显示：相比对照组，HBx 可显著升高 HepG2 细胞中 CCND1 的活性〔（38±5）%，图 9〕。此外，Western blot 实验证实，在 HBx 稳定表达的 HepG2 细胞中，CCND1 表达出现明显上调（图 10）。该结果提示，HBx 可在体外导致肝癌细胞中 miR-16 家族低表达，并上调其靶基因 CCND1 的表达及活性。
图9
HBx 稳定表达在 HepG2 细胞中显著上调 CCND1 的活性。 与突变体 CCND1 比较，***P<0.001
图10
HBx 稳定表达在 HepG2 细胞中显著上调 CCND1 蛋白表达
2.3 沉默 c-myc 表达可恢复 HepG2-hbx 细胞中 miR-15a/16 的表达
qRT-PCR（图 11）及 Western blot（图 12）实验结果显示，相比于载体对照细胞，HBx 稳定转染可显著上调 HepG2 细胞中 c-myc 的 mRNA 和蛋白表达。此外，Western blot 结果也验证了 si-myc 的有效性，相比于 si-NC，si-myc 可在转染后 48 和 72 h 显著下调 c-myc 的表达（图 12）。进一步的 qRT-PCR 结果证实：在转染 si-myc（即沉默 c-myc 表达）后不同时间点（24、28、72 及 96 h）miR-15a 和 miR-16 的表达明显上调（图 13），其中以 miR-15a 更为明显。该结果提示，HBx 在 HepG2 细胞中下调 miR-16 家族的表达，可能在一定程度上由 c-myc 介导。
图11
HBx 稳定表达在 HepG2 细胞中显著上调 c-myc 的 mRNA 表达。 与 HepG2-vc 细胞比较，*P<0.05；**P<0.01
图12
HBx 稳定表达在 HepG2 细胞中显著上调 c-myc 的蛋白表达，si-myc 能显著下调 c-myc 的蛋白表达
图13
si-myc 瞬时转染 HepG2-hbx 细胞后明显上调了 miR-15a 和 miR-16 的表达，下调 c-myc 表达。 与 NC 组相比，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001
2.4 沉默 miR-16 表达可促进 HepG2 细胞的周期进展和增殖
CCK-8 实验结果显示，相比于 NC 转染组，转染 miR-16 抑制物后 48、72 和 96 h 可明显促进 HepG2 细胞的增殖（图 14）。相对应的是，miR-16 抑制物可加速 HepG2 细胞的 G1/S 期进展（图 15）。
图14
miR-16 抑制物可显著促进 HepG2 细胞的生长。 与 NC 转染组相比，***P<0.001
图15
miR-16 抑制物可使 HepG2 细胞快速通过 G1/S 期。 与 NC 组相比，**P<0.01；***P<0.001
2.5 外源表达的 miR-15a/16 可以通过阻滞细胞周期的进展和诱导凋亡以抑制 HepG2-hbx 细胞的生存
CCK-8 实验结果显示，miR-15a 和 miR-16 模拟物均能在转染 72 及 96 h 后显著抑制 HepG2-hbx 细胞的增殖（图 16）。克隆形成（图 17）及球囊培养实验（图 18）结果证实，miR-15a 和 miR-16 模拟物可明显降低 HepG2-hbx 细胞的生存能力。相比于 miR-15a 和 miR-16 转染组，NC 组能形成更大和更多的球囊和克隆（图 19）。
图16
miR-15a/16 的模拟物瞬时转染可显著抑制 HepG2-hbx 细胞的增殖。 与 NC 组相比，*P<0.05；***P<0.001
图17
外源表达的 miR-15a 和 miR-16 可显著降低 HepG2-hbx 和 HepG2.2.15 细胞的平板克隆形成能力
图18
外源表达的 miR-15a 和 miR-16 导致 HepG2-hbx 细胞形成较小的球囊体
图19
外源表达的 miR-15a 和 miR-16 导致 HepG2-hbx 细胞形成更少的球囊体。 与 NC 组相比，***P<0.001
细胞周期实验结果显示，外源表达的 miR-15a 和 miR-16 可将 HepG2-hbx 细胞周期阻滞于 G1 期，NC 转染组处于 G1 期的细胞数量显著少于其他转染组（图 20）。此外，流式细胞仪检测结果显示，miR-15a 和 miR-16 模拟物可诱导 HepG2-hbx 细胞发生明显的早期凋亡（图 21）。
图20
外源表达的 miR-15a 和 miR-16 阻滞 HepG2-hbx 细胞于 G1 期
图21
外源表达的 miR-15a 和 miR-16 导致 HepG2-hbx 细胞发生明显的早期凋亡
3 讨论
HBx 具有协转录激活功能，可通过调控蛋白编码基因表达而激活细胞内多个肿瘤相关信号通路来参与肝癌的起始和进展。然而，人基因组大部分转录产物为非编码 RNA，包括 siRNA、miRNA 及 lncRNA（长链非编码 RNA），它们均能调控基因表达[5]。miRNA 广泛参与了人类疾病进程包括肿瘤的发生和进展[6]。本研究将 HBx 的调控功能拓展到非编码 RNA 领域以明确 miRNAs 在 HBV 相关肝癌发生进展中所扮演的角色。
HBx 在 HepG2 细胞内导致大量的 miRNAs 低表达包括 miR-16 家族，只上调少数 miRNAs 包括 miR-21 这一公认的促癌 miRNA。这种 miRNA 表达模式被认为是肿瘤所特有的[4]。Liu 等[6]利用 miRNA 芯片及 Northern blot 比较了 HepG2.2.15 细胞（整合了整个 HBV 基因组，可分泌乙肝表面抗原）和父系 HepG2 细胞之间的 miRNA 表达差异，其中 miR-15a、miR-16、miR-338 和 miR-422a 在 HepG2.2.15 细胞中的低表达与本研究结果是一致的。本研究直接将 HBx 转入 HepG2 细胞并发现 miR-16 家族显著低表达于 HepG2-hbx 和 HepG2.2.15 细胞中。尽管如此，HepG2.2.15 细胞仍然不能模拟 HBV 在肝脏内的自然感染过程，miR-16 家族在 HBV 感染导致肝脏病变中的表达和作用仍有待进一步的研究。
miR-16 家族包括 miR-15a/16-1 和 miR-15b/16-2，分别位于人 13q14 和 3 号染色体，且与 DLEU2/SMC4 共转录[7]。该家族通过靶向调控 CCND1-3、CCNE1 和 CDK6 而成为细胞周期 G1/S 检查点的关键调控者[8-9]。该家族在多种实体和血液肿瘤中低表达并能靶向沉默多个癌基因包括 c-myb、Bmi-1、bcl-2、WNT3A 和 Wip1[10]。此外，该家族还与肿瘤化疗敏感性相关[11]。相应地，13q14 染色体（miR-15a/16-1）的缺失与分化肝癌的细胞周期进展和增殖有关[12]，也和恶性程度高的肝细胞癌生物学特点相关[13]。具体到肝癌，miR-15a/16-1 参与预测肝癌患者静脉转移和总体生存[14]，miR-15b 高表达与肝癌切除术后的低复发率有关[15]。此外，miR-15b 和 miR-16 在鼠肝星状细胞激活过程中低表达[16]，后者还能促进星状细胞凋亡[17]。值得注意的是，HBx 能在人和鼠肝中激活肝星状细胞并促其生长[18]。因此，上述报道及本研究结果均提示 miR-16 家族的异常表达参与了 HBV 感染相关的肝纤维化、肝硬变及肝癌的发生进展。
除能靶向沉默上述癌基因外，miR-16 家族自身也是肿瘤相关信号通路的下游靶点。P53 能促进 miR-15a/16-1 的转录后加工成熟过程[19]，E2F1 和 E2F3 能在 G1/S 检查点直接诱导 miR-15b/16-2 表达[20]。射线照射能在人脑胶质瘤和内皮细胞中诱导 miR-15a/-16 的表达[21-22]。相反，c-myc 和 Lin28B 能在人 B 细胞淋巴瘤中抑制 miR-16 家族表达>1.5 倍[23]，这也与本研究发现的 HBx-c-myc-miR-16 通路相呼应。 重要的是，c-myc 在肝癌的发生中被认为占据中心地位[24]。因此，本研究发现的 HBx 能上调 c-myc 表达充分说明了 HBV 感染在肝癌发生中的重要性。
综上，本研究发现 HBx 能在体外导致人肝癌细胞内 miRNA 异常表达，包括 c-myc 介导的 miR-16 家族低表达。外源表达的 miR-15a/-16 能通过诱导细胞周期阻滞和诱导凋亡而抑制 HepG2-hbx 的增殖、克隆形成和非贴壁生长能力。因此，本实验结果也展示了 miR-16 家族在治疗人肝脏 HBV 慢性感染疾病中的前景。
