引用本文： 孙丹, 陶利平, 李骁, 卢静, 耿冲, 王春晖. 塞来昔布对 SGC-7901 人胃癌细胞 NHE1 表达及细胞内 pH 的影响. 中国普外基础与临床杂志, 2017, 24(4): 420-425. doi: 10.7507/1007-9424.201611052 复制
胃癌（gastric carcinoma）为胃上皮细胞来源的恶性肿瘤，是最常见的恶性肿瘤之一，居癌症发病率第 4 位，位居全球癌症死亡原因第 2 位[1]。环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）因为通过促进肿瘤细胞增殖并抑制其凋亡、促进新生血管形成和加速基质降解，在肿瘤的发生、发展及转移方面发挥作用而成为肿瘤研究的热点。现有研究[2-3]已证实，选择性 COX-2 抑制剂可有效抑制胃癌的进展。
钠氢交换体（Na+-H+exchanger，NHE）是存在于所有脊椎动物细胞的跨膜蛋白，主要作用为调节细胞内 pH 值（pHi）、稳定细胞容量及影响细胞离子转运，NHE1 为目前研究最为透彻的一个亚型。生理情况下，NHE 发挥的作用很小，但是在缺血缺氧情况下或在肿瘤细胞内，因细胞内大量 H+ 潴留导致多种信号通路上调而激活 NHE 系统。所以，尽管肿瘤细胞本身存在糖酵解优势，导致肿瘤细胞内产生大量乳酸和 H+，但是核磁共振波谱技术证明肿瘤细胞的 pHi 为中性或偏碱性。本研究旨在观察塞来昔布对细胞增殖的影响，并测定不同浓度的塞来昔布干预后 NHE1 表达和 pHi 改变情况，以明确塞来昔布是否通过影响 pHi 水平而抑制胃癌细胞的生长。
1 材料与方法
1.1 实验细胞株
人胃腺癌细胞株 SGC-7901 由四川大学华西医院多肽实验室惠赠。
1.2 主要材料及设备
主要材料包括 BCECF-AM 及 MTT（碧云天公司），塞来昔布及尼日利亚菌素（Sigma 公司），0.25% 胰酶、双抗（青霉素+链霉素）及 RPMI 1640 培养基（Hyclone 公司），DMSO（Amresco 公司），兔抗人 NHE1 抗体（Abcam 公司），β-actin 抗体（北京博奥森公司），山羊抗兔抗体及 ECL 化学发光试剂盒（中山金桥公司），标准胎牛血清（FBS，上海复蒙公司）。主要仪器包括台式离心机（Heraeus 公司），CO2 培养箱（SANYO 公司），酶标仪（BIO-RAD 公司），倒置显微镜、普通光学显微镜及共聚焦荧光显微镜（Olympus 公司），Western blot 成像系统（BIO-RAD 公司）。
1.3 实验分组及方案设计
1.3.1 塞来昔布对人胃癌细胞 SGC-7901 生长的影响 SGC-7901 细胞用 RPMI 1640 完全培养基，在含 5% CO2、37 ℃ 孵箱中培养至 80% 以上融合，胰酶消化、完全培养基制成细胞悬液后接种于 96 孔板中，每孔（2～3）×103 个细胞。接种好的 96 孔板放于孵箱中继续培养 24 h 后，使用无血清 RPMI 1640 培养基饥饿 24 h 后，换用事先配置的含不同浓度（5、12.5、25、50、75 及 100 μmol/L）塞来昔布的培养基继续培养，每浓度设 5 个复孔，分别培养 24 h、48 h 和 72 h 后使用 MTT 法测定塞来昔布对 SGC-7901 细胞增殖的影响。实验同时设置无水 DMSO 对照组（1 μL/100 μL）和 5 个空白孔。每组进行 MTT 测定前均于倒置显微镜下观察细胞形态并摄片。
1.3.2 NHE1 蛋白表达及 pHi 变化干预分组设计 用不同浓度（5、12.5、25、50 及 75 μmol/L）的塞来昔布干预 SGC-7901 细胞 24 h，每组 3 个独立样本。
1.4 检测指标及方法
1.4.1 MTT 法测定 SGC-7901 细胞活力 向 96 孔板中相应孔内加入 MTT 溶液（5 mg/mL） 10 μL/孔，在 5% CO2、37 ℃ 孵箱孵育 4 h 后，每孔加入 100 μL Formazan 溶解液（Formazan dissolving solution）。孵箱中继续孵育 4 h 后，上酶标仪检测，选择 570 nm 波长读取吸光度值（A 值），计算细胞抑制率。细胞抑制率（%）=（1–实验组A 值/对照组A 值）×100%。每组实验重复 3 次，取均值。
1.4.2 Western blot 法测定 SGC-7901 细胞的 NHE1 表达 采用 BCA 试剂盒提取总蛋白并测定蛋白质浓度，取 30 μg/孔蛋白质上样，在 100 V 电压下电泳至溴酚蓝迁移到分离胶底部；清水洗涤之后进行转膜；转膜结束后，用含 5% 脱脂奶粉的 TBST（Tris Buffered Saline and Tween 20）溶液封闭 2 h 后，将聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜置于 TBST 溶液中洗涤，然后分别放入 1∶200 稀释的兔抗人 NHE1 抗体和 1∶2 000 稀释的 β-actin 抗体 4 ℃ 过夜；将 PVDF 膜用 TBST 洗涤 3 次，然后同 1∶5 000 稀释的山羊抗兔二抗共同孵育 2 h；将 PVDF 膜用 TBST 洗涤 4 次后进行显色；采用凝胶分析软件 Quantity One 进行结果分析。
1.4.3 pHi 测定 将细胞悬液接种在 24 孔板〔（0.5～1.0）×104 个细胞/孔〕及 6 孔板〔（2～4） ×104 个细胞/孔〕中培养过夜（弃去外周一圈不用）；实验前用羟乙基哌嗪乙硫磺酸〔2-[4-（2-Hydroxyethyl）-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid，HEPES〕缓冲液（NaCl 142 mmol/L；KCl 3 mmol/L；MgSO4 1 mmol/L；HEPES 20 mmol/L；葡萄糖 10 mmol/L；0.2% 白蛋白，调节 pH 至 7.4）漂洗 2 次；用 HEPES 缓冲液配制浓度为 2 mmol/L 的 BCECF-AM 荧光染料，加入 24 孔板内，在 5% CO2、37 ℃ 孵箱内孵育 30 min；吸出 HEPES 缓冲液，使用 3-吗啉基丙磺酸〔3-（morpho-lino）propanesulfonic acid，MOPS〕缓冲液（KCl 130 mmol/L；NaCl 10 mmol/L；MgSO4 1 mmol/L；MOPS 10 mmol/L）漂洗 2 次；加入含有尼日利亚菌素但 pH 值不同的 MOPS 缓冲液，在 5% CO2、37 ℃ 孵箱内孵育 5 min；在共聚焦荧光显微镜下选择细胞分布和荧光染料均匀的视野，以 488 nm 为激发波长，发射波长为 530 nm，每孔拍摄 5 个视野，每个视野内以 3 个较独立细胞为一组，每个视野计算 3 组，计算其平均荧光强度；将检测出的荧光强度与相应缓冲液的 pH 值进行相关性分析，制定出标准曲线，测得不同 pH 值对应的细胞内荧光强度。
对照组及塞来昔布干预组细胞的准备同标准曲线制备，仅将含尼日利亚菌素的 MOPS 缓冲液换为 HEPES 缓冲液，上机检测。根据测得的荧光强度在标准曲线上计算出相应的 pH 值。重复 3 次实验。
1.5 统计学方法
采用 SPSS 17.0 软件进行统计分析。计量资料采用均数+标准差（ ）表示，对各组数据先进行正态性检验与方差齐性检验，采用单因素方差分析的方法，两两比较采用q 检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 MTT 法测定塞来昔布对 SGC-7901 细胞增殖的抑制作用
低浓度塞来昔布（5 μmol/L）对 SGC-7901 细胞增殖无明显抑制作用（P>0.05），塞来昔布浓度越高（12.5～100 μmol/L），其对 SGC-7901 细胞增殖的抑制作用越明显（P<0.05），且各浓度组之间差异具有统计学意义（P<0.05）。干预 24 h、48 h 及 72 h 后，同一药物浓度其增殖抑制作用逐渐增强（图 1）。100 μmol/L 塞来昔布干预 72 h 后 SGS-7901 细胞增殖抑制率达 97%（图 1）。
图1
示不同浓度的塞来昔布干预 24 h、48 h 及 72 h 后 SGC-7901 细胞增殖抑制率检测结果
2.2 塞来昔布对 SGC-7901 细胞 NHE1 表达的影响
5 μmol/L 组塞来昔布干预 SGC-7901 细胞 24 h 后，其 NHE1 表达与 DMSO 对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）；12.5、25、50 及 75 μmol/L 塞来昔布干预 SGC-7901 细胞 24 h 后与 DMSO 对照组比较，其 NHE1 表达均下调，其中 75 μmol/L 组 NHE1 表达下调最明显，其差异具有统计学意义（P<0.05），且各浓度组之间比较差异亦有统计学意义（P<0.05）。见图 2～图 3。该结果提示，随着塞来昔布浓度的逐渐增加，其对 SGC-7901细胞 NHE1 表达的抑制作用逐渐增强。
图2
示 Western blot 法检测 SGC-7901 细胞 NHE1 表达电泳图。 1：DMSO 对照组；2：5 μmol/L 组；3：12.5 μmol/L 组；4：25 μmol/L 组；5：50 μmol/L 组；6：75 μmol/L 组
图3
示 Western blot 法检测不同浓度塞来昔布干预 24 h 后 SGC-7901 细胞 NHE1 表达检测结果。 与 DMSO 对照组（0 μmol/L）比较，*P<0.05
2.3 塞来昔布干预前后 SGC-7901 细胞 pHi 的变化
2.3.1 pHi 标准曲线 不同 pH 值缓冲液培育后的 SGC-7901 细胞，通过共聚焦显微镜在激发波长为 488 nm 处检测出的平均荧光强度，与其对应 pH 值缓冲液的 BCECF-AM 荧光强度进行相关性分析，绘制出 SGC-7901 细胞 pHi 的标准曲线见图 4。其结果提示，pHi（X）与细胞荧光强度（Y）之间呈线性相关，其回归方程为 X=（Y+4057.8）/987.5（R2=0.9718）。
图4
示 pHi 的标准曲线图
2.3.2 塞来昔布对 SGC-7901 细胞 pHi 的影响 使用共聚焦荧光显微镜检测各浓度组细胞的 BCECF-AM 荧光强度（图 5），根据标准曲线方程，求得其对应的 pHi 值（图 6）。结果表明，5 μmol/L 浓度组与 DMSO 对照组的 pHi 比较，差异无统计学意义（P>0.05），12.5 μmol/L 组、25 μmol/L 组、50 μmol/L 组及 75 μmol/L 组其 pHi 值逐渐下降，与 DMSO 对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.05），同时各浓度组之间比较，差异亦有统计学意义（P<0.05）。
图5
示不同浓度组细胞的 BCECF-AM 荧光强度。 a：DMSO 对照组；b：5 μmol/L 组；c：12.5 μmol/L 组；d：25 μmol/L 组；e：50 μmol/L 组；f：75 μmol/L 组
图6
示不同浓度塞来昔布干预 24 h 后 SGC-7901 细胞 pHi 检测结果。 与 DMSO 对照组（0 μmol/L）比较，*P<0.05；各浓度组间比较，#P<0.05
3 讨论
pHi 稳态对于维持细胞的正常生理功能至关重要。细胞内酶的活性及细胞生长分化速度都与 pHi 密切相关。人体细胞的 pHi 值受到多种离子转运蛋白的调控，主要包括：Na+-H+ 交换体（NHE）、生电性的 Na+-HCO3– 共同转运通道、Na+ 依赖的与 Na+ 非依赖的 Cl–-HCO3– 交换泵、H+-乳酸通道和 H+-ATP 酶通道，它们彼此之间相互作用，共同维持着 pHi 的平衡状态。在生理情况下，NHE 作用较小，而在缺血缺氧的情况下或肿瘤细胞内，由于细胞内大量 H+ 的潴留，从而导致多种信号通路上调并激活 NHE 系统，将细胞内的H+ 泵出细胞外，使得肿瘤细胞内呈特殊的碱性环境，有利于肿瘤细胞的恶性增殖[4]。
已有研究[5-7]证实，靶向 COX-2 途径在预防和治疗实体肿瘤方面有非常重要的意义。COX-2 抑制剂的抗肿瘤作用可能通过本身环氧合酶的作用实现，并且对其下游效应物也存在着调节作用[8]。癌基因、生长因子、细胞因子、化学治疗、肿瘤诱发因素等均可通过激活蛋白激酶 C（PKC）增加 COX-2 转录。已有研究[9]发现，恶性肿瘤或癌前期病变中的 COX-2 呈高表达现象。COX-2 的高表达预示了在这些组织中转录 mRNA 的稳定增加状态[10-11]。在恶性肿瘤的发生、发展过程中，COX-2 可以促进基质代谢、抑制凋亡、加速细胞增生、促进血管生成，增加其肿瘤侵袭性及抑制机体免疫。塞来昔布作为 COX-2 抑制剂，主要通过抑制 COX-2 的表达和活性达到抗肿瘤的目的。非甾体类抗炎药物（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）抗肿瘤作用的可能机制有：① 抑制 COX-2 活性及前列腺素（PG）的合成，发挥抗肿瘤作用[12]；② 影响细胞的增殖周期、促进肿瘤细胞凋亡[13-14]；③ 通过血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抑制肿瘤血管生成[15-17]；④ 通过调节上皮细胞钙粘蛋白（E-cadherin）抑制肿瘤的侵袭及转移[18-19]。尽管如此，COX-2 抑制剂抑制肿瘤细胞生长的机制仍然没有完全阐明。
本研究发现，塞来昔布干预后，胃癌 SGC-7901 细胞增殖明显被抑制。此外，Western blot 技术检测还发现，塞来昔布干预后 SGC-7901 细胞 NHE1 蛋白表达下调，其作用与药物呈浓度依赖性。使用 BCECF-AM 荧光探针，采用激光共聚焦荧光显微镜测定 pHi，其结果显示，塞来昔布能影响 SGC-7901 细胞的 pHi 水平，说明塞来昔布不仅影响 NHE1 表达，也影响其功能。从而进一步证实，在肿瘤细胞中，对 pHi 调节起到关键作用的为 NHE1。结合文献[20]报道，NHE1 在胃癌细胞生长中发挥调节作用，抑制 NHE1 表达可抑制胃癌细胞生长。塞来昔布作用于结肠癌细胞以及小鼠结肠癌模型后，NHE1 表达明显下降，pHi 亦明显下降，存在肿瘤细胞内酸化现象[21-22]。推测塞来昔布可能通过抑制 Na+-H+ 交换功能，使得肿瘤细胞因糖酵解产生的大量氢离子无法正常排出，本来碱性的细胞内液酸化，从而改变了胃癌细胞内微环境，使大部分胃癌细胞停止增殖。塞来昔布对 SGC-7901 细胞 NHE1 蛋白表达的影响是通过 COX-2 依赖性还是 COX-2 非依赖性途径实现，尚需进一步研究证明。
本实验结果提示，酸化细胞内微环境的药物可能有助于肿瘤治疗。目前，针对调节 pH 的膜转运蛋白的相关药物取得了一些可喜的结果，比如 NHE1 反向交换体，这可能是治疗肿瘤的有力工具[23]。多种药物与细胞的结合是 pH 依赖的，亲脂性的抗癌药物在肿瘤细胞中的分布与累积剂量受到细胞膜内外 pH 梯度的影响。因此，细胞内的 pH 梯度可为化疗药物的选择提供基础[24]，并且和肿瘤选择性化疗相关[25]。这些结果均说明，通过调节肿瘤细胞内的 pH 有助于肿瘤的治疗。随着对肿瘤生物学的深入认识，将化学治疗和分子靶向治疗有机结合，胃癌的治疗前景会更加广阔。
胃癌（gastric carcinoma）为胃上皮细胞来源的恶性肿瘤，是最常见的恶性肿瘤之一，居癌症发病率第 4 位，位居全球癌症死亡原因第 2 位[1]。环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）因为通过促进肿瘤细胞增殖并抑制其凋亡、促进新生血管形成和加速基质降解，在肿瘤的发生、发展及转移方面发挥作用而成为肿瘤研究的热点。现有研究[2-3]已证实，选择性 COX-2 抑制剂可有效抑制胃癌的进展。
钠氢交换体（Na+-H+exchanger，NHE）是存在于所有脊椎动物细胞的跨膜蛋白，主要作用为调节细胞内 pH 值（pHi）、稳定细胞容量及影响细胞离子转运，NHE1 为目前研究最为透彻的一个亚型。生理情况下，NHE 发挥的作用很小，但是在缺血缺氧情况下或在肿瘤细胞内，因细胞内大量 H+ 潴留导致多种信号通路上调而激活 NHE 系统。所以，尽管肿瘤细胞本身存在糖酵解优势，导致肿瘤细胞内产生大量乳酸和 H+，但是核磁共振波谱技术证明肿瘤细胞的 pHi 为中性或偏碱性。本研究旨在观察塞来昔布对细胞增殖的影响，并测定不同浓度的塞来昔布干预后 NHE1 表达和 pHi 改变情况，以明确塞来昔布是否通过影响 pHi 水平而抑制胃癌细胞的生长。
1 材料与方法
1.1 实验细胞株
人胃腺癌细胞株 SGC-7901 由四川大学华西医院多肽实验室惠赠。
1.2 主要材料及设备
主要材料包括 BCECF-AM 及 MTT（碧云天公司），塞来昔布及尼日利亚菌素（Sigma 公司），0.25% 胰酶、双抗（青霉素+链霉素）及 RPMI 1640 培养基（Hyclone 公司），DMSO（Amresco 公司），兔抗人 NHE1 抗体（Abcam 公司），β-actin 抗体（北京博奥森公司），山羊抗兔抗体及 ECL 化学发光试剂盒（中山金桥公司），标准胎牛血清（FBS，上海复蒙公司）。主要仪器包括台式离心机（Heraeus 公司），CO2 培养箱（SANYO 公司），酶标仪（BIO-RAD 公司），倒置显微镜、普通光学显微镜及共聚焦荧光显微镜（Olympus 公司），Western blot 成像系统（BIO-RAD 公司）。
1.3 实验分组及方案设计
1.3.1 塞来昔布对人胃癌细胞 SGC-7901 生长的影响 SGC-7901 细胞用 RPMI 1640 完全培养基，在含 5% CO2、37 ℃ 孵箱中培养至 80% 以上融合，胰酶消化、完全培养基制成细胞悬液后接种于 96 孔板中，每孔（2～3）×103 个细胞。接种好的 96 孔板放于孵箱中继续培养 24 h 后，使用无血清 RPMI 1640 培养基饥饿 24 h 后，换用事先配置的含不同浓度（5、12.5、25、50、75 及 100 μmol/L）塞来昔布的培养基继续培养，每浓度设 5 个复孔，分别培养 24 h、48 h 和 72 h 后使用 MTT 法测定塞来昔布对 SGC-7901 细胞增殖的影响。实验同时设置无水 DMSO 对照组（1 μL/100 μL）和 5 个空白孔。每组进行 MTT 测定前均于倒置显微镜下观察细胞形态并摄片。
1.3.2 NHE1 蛋白表达及 pHi 变化干预分组设计 用不同浓度（5、12.5、25、50 及 75 μmol/L）的塞来昔布干预 SGC-7901 细胞 24 h，每组 3 个独立样本。
1.4 检测指标及方法
1.4.1 MTT 法测定 SGC-7901 细胞活力 向 96 孔板中相应孔内加入 MTT 溶液（5 mg/mL） 10 μL/孔，在 5% CO2、37 ℃ 孵箱孵育 4 h 后，每孔加入 100 μL Formazan 溶解液（Formazan dissolving solution）。孵箱中继续孵育 4 h 后，上酶标仪检测，选择 570 nm 波长读取吸光度值（A 值），计算细胞抑制率。细胞抑制率（%）=（1–实验组A 值/对照组A 值）×100%。每组实验重复 3 次，取均值。
1.4.2 Western blot 法测定 SGC-7901 细胞的 NHE1 表达 采用 BCA 试剂盒提取总蛋白并测定蛋白质浓度，取 30 μg/孔蛋白质上样，在 100 V 电压下电泳至溴酚蓝迁移到分离胶底部；清水洗涤之后进行转膜；转膜结束后，用含 5% 脱脂奶粉的 TBST（Tris Buffered Saline and Tween 20）溶液封闭 2 h 后，将聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜置于 TBST 溶液中洗涤，然后分别放入 1∶200 稀释的兔抗人 NHE1 抗体和 1∶2 000 稀释的 β-actin 抗体 4 ℃ 过夜；将 PVDF 膜用 TBST 洗涤 3 次，然后同 1∶5 000 稀释的山羊抗兔二抗共同孵育 2 h；将 PVDF 膜用 TBST 洗涤 4 次后进行显色；采用凝胶分析软件 Quantity One 进行结果分析。
1.4.3 pHi 测定 将细胞悬液接种在 24 孔板〔（0.5～1.0）×104 个细胞/孔〕及 6 孔板〔（2～4） ×104 个细胞/孔〕中培养过夜（弃去外周一圈不用）；实验前用羟乙基哌嗪乙硫磺酸〔2-[4-（2-Hydroxyethyl）-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid，HEPES〕缓冲液（NaCl 142 mmol/L；KCl 3 mmol/L；MgSO4 1 mmol/L；HEPES 20 mmol/L；葡萄糖 10 mmol/L；0.2% 白蛋白，调节 pH 至 7.4）漂洗 2 次；用 HEPES 缓冲液配制浓度为 2 mmol/L 的 BCECF-AM 荧光染料，加入 24 孔板内，在 5% CO2、37 ℃ 孵箱内孵育 30 min；吸出 HEPES 缓冲液，使用 3-吗啉基丙磺酸〔3-（morpho-lino）propanesulfonic acid，MOPS〕缓冲液（KCl 130 mmol/L；NaCl 10 mmol/L；MgSO4 1 mmol/L；MOPS 10 mmol/L）漂洗 2 次；加入含有尼日利亚菌素但 pH 值不同的 MOPS 缓冲液，在 5% CO2、37 ℃ 孵箱内孵育 5 min；在共聚焦荧光显微镜下选择细胞分布和荧光染料均匀的视野，以 488 nm 为激发波长，发射波长为 530 nm，每孔拍摄 5 个视野，每个视野内以 3 个较独立细胞为一组，每个视野计算 3 组，计算其平均荧光强度；将检测出的荧光强度与相应缓冲液的 pH 值进行相关性分析，制定出标准曲线，测得不同 pH 值对应的细胞内荧光强度。
对照组及塞来昔布干预组细胞的准备同标准曲线制备，仅将含尼日利亚菌素的 MOPS 缓冲液换为 HEPES 缓冲液，上机检测。根据测得的荧光强度在标准曲线上计算出相应的 pH 值。重复 3 次实验。
1.5 统计学方法
采用 SPSS 17.0 软件进行统计分析。计量资料采用均数+标准差（ ）表示，对各组数据先进行正态性检验与方差齐性检验，采用单因素方差分析的方法，两两比较采用q 检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 MTT 法测定塞来昔布对 SGC-7901 细胞增殖的抑制作用
低浓度塞来昔布（5 μmol/L）对 SGC-7901 细胞增殖无明显抑制作用（P>0.05），塞来昔布浓度越高（12.5～100 μmol/L），其对 SGC-7901 细胞增殖的抑制作用越明显（P<0.05），且各浓度组之间差异具有统计学意义（P<0.05）。干预 24 h、48 h 及 72 h 后，同一药物浓度其增殖抑制作用逐渐增强（图 1）。100 μmol/L 塞来昔布干预 72 h 后 SGS-7901 细胞增殖抑制率达 97%（图 1）。
图1
示不同浓度的塞来昔布干预 24 h、48 h 及 72 h 后 SGC-7901 细胞增殖抑制率检测结果
2.2 塞来昔布对 SGC-7901 细胞 NHE1 表达的影响
5 μmol/L 组塞来昔布干预 SGC-7901 细胞 24 h 后，其 NHE1 表达与 DMSO 对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）；12.5、25、50 及 75 μmol/L 塞来昔布干预 SGC-7901 细胞 24 h 后与 DMSO 对照组比较，其 NHE1 表达均下调，其中 75 μmol/L 组 NHE1 表达下调最明显，其差异具有统计学意义（P<0.05），且各浓度组之间比较差异亦有统计学意义（P<0.05）。见图 2～图 3。该结果提示，随着塞来昔布浓度的逐渐增加，其对 SGC-7901细胞 NHE1 表达的抑制作用逐渐增强。
图2
示 Western blot 法检测 SGC-7901 细胞 NHE1 表达电泳图。 1：DMSO 对照组；2：5 μmol/L 组；3：12.5 μmol/L 组；4：25 μmol/L 组；5：50 μmol/L 组；6：75 μmol/L 组
图3
示 Western blot 法检测不同浓度塞来昔布干预 24 h 后 SGC-7901 细胞 NHE1 表达检测结果。 与 DMSO 对照组（0 μmol/L）比较，*P<0.05
2.3 塞来昔布干预前后 SGC-7901 细胞 pHi 的变化
2.3.1 pHi 标准曲线 不同 pH 值缓冲液培育后的 SGC-7901 细胞，通过共聚焦显微镜在激发波长为 488 nm 处检测出的平均荧光强度，与其对应 pH 值缓冲液的 BCECF-AM 荧光强度进行相关性分析，绘制出 SGC-7901 细胞 pHi 的标准曲线见图 4。其结果提示，pHi（X）与细胞荧光强度（Y）之间呈线性相关，其回归方程为 X=（Y+4057.8）/987.5（R2=0.9718）。
图4
示 pHi 的标准曲线图
2.3.2 塞来昔布对 SGC-7901 细胞 pHi 的影响 使用共聚焦荧光显微镜检测各浓度组细胞的 BCECF-AM 荧光强度（图 5），根据标准曲线方程，求得其对应的 pHi 值（图 6）。结果表明，5 μmol/L 浓度组与 DMSO 对照组的 pHi 比较，差异无统计学意义（P>0.05），12.5 μmol/L 组、25 μmol/L 组、50 μmol/L 组及 75 μmol/L 组其 pHi 值逐渐下降，与 DMSO 对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.05），同时各浓度组之间比较，差异亦有统计学意义（P<0.05）。
图5
示不同浓度组细胞的 BCECF-AM 荧光强度。 a：DMSO 对照组；b：5 μmol/L 组；c：12.5 μmol/L 组；d：25 μmol/L 组；e：50 μmol/L 组；f：75 μmol/L 组
图6
示不同浓度塞来昔布干预 24 h 后 SGC-7901 细胞 pHi 检测结果。 与 DMSO 对照组（0 μmol/L）比较，*P<0.05；各浓度组间比较，#P<0.05
3 讨论
pHi 稳态对于维持细胞的正常生理功能至关重要。细胞内酶的活性及细胞生长分化速度都与 pHi 密切相关。人体细胞的 pHi 值受到多种离子转运蛋白的调控，主要包括：Na+-H+ 交换体（NHE）、生电性的 Na+-HCO3– 共同转运通道、Na+ 依赖的与 Na+ 非依赖的 Cl–-HCO3– 交换泵、H+-乳酸通道和 H+-ATP 酶通道，它们彼此之间相互作用，共同维持着 pHi 的平衡状态。在生理情况下，NHE 作用较小，而在缺血缺氧的情况下或肿瘤细胞内，由于细胞内大量 H+ 的潴留，从而导致多种信号通路上调并激活 NHE 系统，将细胞内的H+ 泵出细胞外，使得肿瘤细胞内呈特殊的碱性环境，有利于肿瘤细胞的恶性增殖[4]。
已有研究[5-7]证实，靶向 COX-2 途径在预防和治疗实体肿瘤方面有非常重要的意义。COX-2 抑制剂的抗肿瘤作用可能通过本身环氧合酶的作用实现，并且对其下游效应物也存在着调节作用[8]。癌基因、生长因子、细胞因子、化学治疗、肿瘤诱发因素等均可通过激活蛋白激酶 C（PKC）增加 COX-2 转录。已有研究[9]发现，恶性肿瘤或癌前期病变中的 COX-2 呈高表达现象。COX-2 的高表达预示了在这些组织中转录 mRNA 的稳定增加状态[10-11]。在恶性肿瘤的发生、发展过程中，COX-2 可以促进基质代谢、抑制凋亡、加速细胞增生、促进血管生成，增加其肿瘤侵袭性及抑制机体免疫。塞来昔布作为 COX-2 抑制剂，主要通过抑制 COX-2 的表达和活性达到抗肿瘤的目的。非甾体类抗炎药物（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）抗肿瘤作用的可能机制有：① 抑制 COX-2 活性及前列腺素（PG）的合成，发挥抗肿瘤作用[12]；② 影响细胞的增殖周期、促进肿瘤细胞凋亡[13-14]；③ 通过血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抑制肿瘤血管生成[15-17]；④ 通过调节上皮细胞钙粘蛋白（E-cadherin）抑制肿瘤的侵袭及转移[18-19]。尽管如此，COX-2 抑制剂抑制肿瘤细胞生长的机制仍然没有完全阐明。
本研究发现，塞来昔布干预后，胃癌 SGC-7901 细胞增殖明显被抑制。此外，Western blot 技术检测还发现，塞来昔布干预后 SGC-7901 细胞 NHE1 蛋白表达下调，其作用与药物呈浓度依赖性。使用 BCECF-AM 荧光探针，采用激光共聚焦荧光显微镜测定 pHi，其结果显示，塞来昔布能影响 SGC-7901 细胞的 pHi 水平，说明塞来昔布不仅影响 NHE1 表达，也影响其功能。从而进一步证实，在肿瘤细胞中，对 pHi 调节起到关键作用的为 NHE1。结合文献[20]报道，NHE1 在胃癌细胞生长中发挥调节作用，抑制 NHE1 表达可抑制胃癌细胞生长。塞来昔布作用于结肠癌细胞以及小鼠结肠癌模型后，NHE1 表达明显下降，pHi 亦明显下降，存在肿瘤细胞内酸化现象[21-22]。推测塞来昔布可能通过抑制 Na+-H+ 交换功能，使得肿瘤细胞因糖酵解产生的大量氢离子无法正常排出，本来碱性的细胞内液酸化，从而改变了胃癌细胞内微环境，使大部分胃癌细胞停止增殖。塞来昔布对 SGC-7901 细胞 NHE1 蛋白表达的影响是通过 COX-2 依赖性还是 COX-2 非依赖性途径实现，尚需进一步研究证明。
本实验结果提示，酸化细胞内微环境的药物可能有助于肿瘤治疗。目前，针对调节 pH 的膜转运蛋白的相关药物取得了一些可喜的结果，比如 NHE1 反向交换体，这可能是治疗肿瘤的有力工具[23]。多种药物与细胞的结合是 pH 依赖的，亲脂性的抗癌药物在肿瘤细胞中的分布与累积剂量受到细胞膜内外 pH 梯度的影响。因此，细胞内的 pH 梯度可为化疗药物的选择提供基础[24]，并且和肿瘤选择性化疗相关[25]。这些结果均说明，通过调节肿瘤细胞内的 pH 有助于肿瘤的治疗。随着对肿瘤生物学的深入认识，将化学治疗和分子靶向治疗有机结合，胃癌的治疗前景会更加广阔。
