引用本文： 许晶晶, 刘峰, 杨廷桐, 陆建福. 乳腺浸润性导管癌微环境中的 CD4+ T 细胞比例、CD8+ T 细胞比例及 p53 基因的表达 . 中国普外基础与临床杂志, 2018, 25(3): 328-333. doi: 10.7507/1007-9424.201709032 复制
乳腺癌的发病率在女性恶性肿瘤中位居第1 位[1-2]。因乳腺癌细胞存在异质性，且乳腺癌呈现出逐年上升与年轻化的趋势[3]，因此如何评估乳腺癌的转移状态与预后就成为临床上防治乳腺癌的焦点所在。有研究[4-5]提示：乳腺癌肿瘤簇内和间质中的肿瘤浸润 T 淋巴细胞（TIL）在肿瘤的浸润、转移及预后中发挥着极其重要的免疫作用，但国内外研究的结果存在较大的分歧。本研究通过对 85 例乳腺浸润性导管癌肿瘤簇内与间质中 CD4+和 CD8+ T 细胞比例及 p53 基因表达的研究，探讨了它们之间的相关性及其在乳腺癌浸润、转移及预后中的作用，旨在为临床防治乳腺癌与评估其预后提供新的视野。
1 资料与方法
1.1 研究对象
本研究的纳入标准：① 女性患者；② 初诊病例，且均经病理学检查确诊为乳腺浸润性导管癌。排除标准：① 男性乳腺癌患者；② 既往有恶性肿瘤病史者。回顾性收集解放军第 371 医院于 2010–2012 年期间行手术切除的 85 例乳腺浸润性导管癌标本，手术方式均为改良乳腺癌根治术和单纯的乳房切除术。85 例患者的年龄为 22～73 岁，中位年龄为 46 岁；临床分期：0～Ⅰ 期 26 例（30.6%），Ⅱ～Ⅲ 期 59 例（69.4%）；肿瘤直径：<2 cm 者 45 例（52.9%），2～5 cm 者 36 例（42.4%），>5 cm 者 4 例（4.7%）。组织学分级：Ⅰ 级 71 例（83.5%），Ⅱ 级 10 例（11.8%），Ⅲ 级 4 例（4.7%）；分子分型：Luminal A 型 19 例（22.4%），Luminal B 型 29 例（34.1%），人类表皮生长因子受体 2（HER-2）型 34 例（40.0%），Basal-like 型 3 例（3.5%）；发生前哨淋巴结转移 32 例（37.6%），无前哨淋巴结转移 53 例（62.4%）。本研究经解放军第 371 医院伦理委员会批准同意。
1.2 免疫组织化学染色方法及结果判定
选取所需的肿瘤组织蜡块，行 4 μm 厚切片，经烤片、脱蜡、水化及高温高压抗原修复后，再采用 EN Vision 二步法进行免疫组织化学染色。首先加入一抗，包括 CD4（抗体克隆号：SP35）、CD8（抗体克隆号：SP16）及 p53（抗体克隆号：DO-7），4 ℃ 冰箱过夜；次日水洗后滴加辣根过氧化物酶标记二抗，恒温孵育；最后行 DAB 显色、苏木精复染、分化及封片，在显微镜下进行观察及结果判断。具体操作同试剂盒说明书。以具有棕褐色颗粒即阳性染色的扁桃体组织作为阳性对照，以 PBS 溶液处理的切片（PBS 溶液代替一抗和二抗）作为阴性对照。
CD4 和 CD8 的阳性染色位于胞质或胞膜，p53 基因的阳性染色位于胞核，阳性染色呈棕黄色或棕褐色[6-8]。在高倍镜（40 倍）下计数（10 个视野）。CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞的比例为阳性炎症细胞占间质/肿瘤细胞簇中所有有核细胞的百分比。p53 基因染色结果的判定依据：阳性细胞所占百分比<5% 计为 0 分，5%～25% 计为 1 分，26%～50% 计为 2 分，51%～75% 计为 3 分，>76% 计为 4 分；再根据染色强度计分：不着色计为 0 分，淡黄色计为 1 分，棕黄色计为 2 分，棕褐色计为 3 分。取两项得分之积作为最终的得分，其中>1 分判定为阳性，表明存在 p53 基因突变，≤1 分判定为阴性（野生型）[8]。
1.3 随访
术后采用电话、家访、患者来院复查等方式就患者的生存状况进行随访。本组患者的随访截止时间为 2016 年 12 月 28 日。患者的生存期定义为手术结束到患者死亡或者随访终止的时间。本组有 79 例患者获访，随访时间 2～84 个月，中位随访时间为 32.2 个月。
1.4 统计学方法
采用 Graphpad 5.0 统计软件对数据进行统计学分析。CD4+ T 细胞比例、CD8+ T 细胞比例以及 CD4+/CD8+ T 细胞比值均以均数±标准差（
±s）表示，组间均数的比较采用 t 检验（成组或配对）。生存分析采用 log-rank 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 肿瘤簇中和间质内 CD4+ T 细胞比例、CD8+ T 细胞比例及 CD4+/CD8+ T 细胞比值比较
85 例患者中，p53 基因表达阳性 27 例（31.8%），阴性 58 例（68.2%），见图 1–4。不管是在肿瘤簇中还是在间质内，CD8+ T 细胞比例均低于 CD4+ T 细胞比例（P<0.01）。与肿瘤簇中比较，间质内的 CD4+ T 细胞比例和 CD8+ T 细胞比例均较高，而 CD4+/CD8+ T 细胞比值较低，差异均有统计学意义（P<0.05）。具体见表 1。
图1
示存在 p53 基因突变、淋巴结未转移的乳腺浸润性导管癌组织中的 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞（EN Vision 二步法 ×200）
a：CD4+ T 细胞；b：CD8+ T 细胞
图2
示存在 p53 基因突变、淋巴结转移的乳腺浸润性导管癌组织中的 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞（EN Vision 二步法 ×200）
a：CD4+ T 细胞；b：CD8+ T 细胞
图3
示 p53 基因未突变、淋巴结转移的乳腺浸润性导管癌组织中的 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞（EN Vision 二步法 ×200）
a：CD4+ T 细胞；b：CD8+ T 细胞
图4
示 p53 基因未突变、淋巴结未转移的乳腺浸润性导管癌组织中的 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞（EN Vision 二步法 ×200）
a：CD4+ T 细胞；b：CD8+ T 细胞
表1
肿瘤簇中和间质内的 CD4+ T 细胞比例、CD8+ T 细胞比例及 CD4+/CD8+ T 细胞比值（
，n=85）
2.2 前哨淋巴结转移组和前哨淋巴结未转移组患者的 CD4+ T 细胞比例、CD8+ T 细胞比例及 CD4+/CD8+ T 细胞比值比较
在前哨淋巴结转移组和未转移组患者中，与肿瘤簇中比较，间质内的 CD4+和 CD8+ T 细胞比例均较高（P<0.01），而 CD4+/CD8+ T 细胞比值均较低（P<0.05）。在肿瘤簇中，与前哨淋巴结转移组患者比较，前哨淋巴结未转移组患者的 CD4+ T 细胞比例及 CD4+/CD8+ T 细胞比值的差异均无统计学意义（P>0.05），但前哨淋巴结未转移组患者的 CD8+ T 细胞比例较低（P<0.05）。在肿瘤间质中，与前哨淋巴结转移组患者比较，前哨淋巴结未转移组患者的 CD4+ T 细胞比例和 CD8+ T 细胞比例均较低（P<0.05），CD4+/CD8+ T 细胞比值较高（P<0.05）。具体见表 2。
表2
前哨淋巴结转移组和未转移组患者的 CD4+ T 细胞比例、CD8+ T 细胞比例及 CD4+/CD8+ T 细胞比值比较
2.3 p53 基因突变组和未突变组患者的 CD4+ T 细胞比例、CD8+ T 细胞比例及 CD4+/CD8+ T 细胞比值比较
在 p53 基因突变组和未突变组患者中，与肿瘤簇中比较，间质内的 CD4+和 CD8+ T 细胞比例均增高（P<0.05），且 p53 基因未突变组患者间质内的 CD4+/CD8+ T 细胞比值较肿瘤簇低（P<0.05），但 p53 基因突变组肿瘤簇中和间质内的CD4+/CD8+ T 细胞比值比较差异无统计学意义（P>0.05）。不管是在肿瘤簇中还是在间质内，与 p53 基因突变组比较，p53 基因未突变组患者的 CD4+ T 细胞比例及 CD8+ T 细胞比例均较低（P<0.05），而 CD4+/CD8+ T 细胞比值均较高（P<0.05）。具体见表 3。
表3
p53 基因突变组和未突变组患者的 CD4+ T 细胞比例、CD8+ T 细胞比例及 CD4+/CD8+ T 细胞比值比较
2.4 乳腺浸润性导管癌的预后与 CD8+ T 细胞浸润程度和 p53 基因表达的关系
根据文献[5]，本研究选择了间质内的 CD8+ T 细胞比例和 p53 基因的表达两项指标，探索其与患者预后的关系。根据间质内 CD8+ T 细胞比例的均值[5]，将患者分为 CD8+ T 细胞高浸润组（35 例）与低浸润组（50 例）。Graphpad 生存分析结果显示，间质内 CD8+ T 细胞浸润程度和 p53 基因表达均与患者的预后相关：高浸润者与低浸润者的 5 年生存率分别为 78.3% 和 85.9%，生存情况比较差异有统计学意义（P<0.05）；p53 基因突变组与未突变组患者的 5 年生存率分别为 67.2% 和 89.5%，生存情况比较差异有统计学意义（P<0.05）。p53 基因突变和 CD8+ T 细胞高浸润提示患者的预后不良，见图 5 和图 6。
图5
示 CD8+ T 细胞高浸润和低浸润患者的生存曲线
图6
示 p53 基因突变和未突变患者的生存曲线
3 讨论
乳腺癌已位居女性恶性肿瘤发病的首位，由于乳腺癌患者存在个体生物学特征的极大不同，故对于临床的肿瘤转移、预后以及治疗的预测存在不确定性，如何对乳腺癌患者进行精准化的个体化治疗，这是临床医师和患者的需求，因此加大对肿瘤与机体免疫功能之间的研究势在必行。研究[9]发现，肿瘤微环境中的组织成分在肿瘤的浸润、转移、破坏正常组织等过程中起着重要的作用。肿瘤的发生到转移是肿瘤微环境的实质和间质之间相互作用的结果，肿瘤微环境中的免疫状态，尤其是细胞介导的免疫反应能直接反映机体局部对肿瘤的反应情况[10]。TIL 是新近发现的与肿瘤免疫相关的重要成分，CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞便是 TIL 中的一员，在肿瘤微环境内对于肿瘤的发展、转移、预后等发挥非常重要的作用[11]。以往的研究多为血液中淋巴亚群的分析[12-13]，不能完全反映肿瘤微环境中的情况，且对于肿瘤微环境的研究甚少。本研究重点在于直接研究肿瘤微环境中的 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞，以直接反映机体肿瘤微环境中的免疫状态，并探讨其与乳腺癌转移及预后的关系。
TIL 主要由 CD4+ T 细胞（辅助性 T 淋巴细胞）和 CD8+ T 细胞（细胞毒性 T 淋巴细胞）组成，是机体免疫系统对肿瘤细胞的特异性免疫表达[14]。两者与肿瘤细胞的演进密切相关：CD4+ T 细胞提呈抗原，通过直接或间接作用于 B 细胞产生抗体，也可以作用于 CD8+ T 细胞，使其激活[15]；CD8+ T 细胞激活后分泌的细胞因子能直接杀伤肿瘤细胞[16]。CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞两者相辅相成，调节、平衡机体正常的免疫应答反应[17]。乳腺浸润性导管癌患者的肿瘤组织中存在 T 细胞亚群的浸润[18]。CD8+ T 细胞比例的变化影响免疫功能，其比例越高，免疫抑制作用越强，且影响 CD4+/CD8+ T 细胞比值，该比值下降被认为是免疫抑制的表现，最终免疫状态失衡，进而促使肿瘤细胞在体内迅速发展[19-20]，因此研究肿瘤微环境中 TIL 的改变能直接反映机体抗肿瘤反应的状况。目前，国内对 CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞以及 CD4+/CD8+ T 细胞比值与 p53 基因突变之间关系的研究鲜有报道，因此本研究通过检测乳腺浸润性导管癌微环境中的 CD4+ T 细胞比例和 CD8+ T 细胞比例，以及 p53 基因在乳腺浸润性导管癌组织中的表达，探讨三者与乳腺浸润性导管癌转移及预后的关系。
本研究发现，不管是在肿瘤簇中还是在间质内，CD8+ T 细胞比例均低于 CD4+ T 细胞比例（P<0.01）；与肿瘤簇中比较，间质内的 CD4+ T 细胞比例和 CD8+ T 细胞比例均较高，而 CD4+/CD8+ T 细胞比值较低，说明 TIL 在肿瘤中的分布存在不同。笔者推测：这种现象或许是乳腺癌发生、发展与浸润的一个重要的机制。在前哨淋巴结转移方面，前哨淋巴结转移组患者间质内的 CD4+ T 细胞比例高于前哨淋巴结未转移组，提示 CD4+ T 细胞的浸润和淋巴结转移之间的关系密切，这与 Macchetti 等[21]的研究结论基本一致。其机制可能是，机体肿瘤细胞刺激了 CD4+ T 细胞反应性增加，CD4+ T 细胞同时又促进了乳腺癌的转移，这可能是乳腺癌浸润和转移的原因之一。这也充分说明了乳腺癌患者体内存在不同程度的细胞免疫状态紊乱[22]。本研究还发现，不管是在肿瘤簇中还是在间质内，前哨淋巴结转移组患者的 CD8+ T 细胞比例均较前哨淋巴结未转移组高，且生存分析发现，CD8+ T 细胞高浸润者的生存情况较低浸润者差。这与文献[5]报道的一致。
本研究也发现：肿瘤间质内 CD4+/CD8+ T 细胞比值较肿瘤簇中低，前哨淋巴结转移组患者间质内 CD4+/CD8+ T 细胞的比值也较前哨淋巴结未转移组低，这一结果与文献[21, 23]结果一致，也与何伟华等[24]的研究结果相符。CD4+/CD8+ T 细胞比值下降甚至倒置被认为是细胞免疫耐受、受抑制的表现。其具体机制为，肿瘤细胞释放大量的免疫抑制因子使 CD4+ T 细胞的功能下降，CD8+ T 细胞的数量或活性增高，从而表现为比值下降。同时 CD8+ T 细胞又对 CD4+ T 细胞进行调节，阻止其形成和成熟，这种现象有利于肿瘤的生长[25]。本研究还发现，在肿瘤簇中，前哨淋巴结转移组的 CD4+/CD8+ T 细胞比值与前哨淋巴结未转移组的差异无统计学意义，该结果与文献[21, 23]不一致。考虑因素为：本研究例数较少，需要再进一步收集病例，完善数据；此外也有可能是存在其他免疫机制。有研究[26]表明，在恶性肿瘤细胞的演进过程中，肿瘤细胞会产生白介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）等免疫抑制因子，抑制淋巴细胞的增殖和分化。另外，CD4+ T 细胞有较强的分泌功能，能分泌 IL-2、IL-3、干扰素 γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等，参与机体免疫反应的调节，可通过促进 CD4+ T 细胞的增殖、分化和激活而间接影响靶细胞的杀伤[27]。CD4+CD25+Treg（调节性 T 细胞）对机体的耐受作用影响免疫系统对肿瘤细胞的清除，CD4+CD25+Treg 可能通过对机体的免疫抑制而促进肿瘤的生长，是肿瘤免疫逃逸的重要机制之一[28]。由于机体内是一个复杂的网络调控体系，且影响肿瘤预后与淋巴结转移的因素太多，因此可能会导致研究间结果的不同，有待未来更深入的研究进行验证。
p53 是抑癌基因，在很多肿瘤组织中发生突变，参与多种肿瘤的发生和发展[8, 29]。本研究发现，在乳腺癌组织中 p53 基因突变率为 31.8%（27/85）。进一步研究发现，在 p53 基因突变组患者的肿瘤簇中和间质内，其 CD4+ T 细胞比例和 CD8+ T 细胞比例均较 p53 基因未突变组高，而 CD4+/CD8+ T 细胞比值较 p53 基因未突变组低。笔者推测：p53 基因的突变可能是导致 TIL（CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞）分布和比例不同的重要因素。然而 p53 基因突变如何影响免疫细胞的比例和分布？为何又在患者预后方面存在明显的不同？为何又能影响患者的生存？其在肿瘤细胞免疫方面的机制如何？这些尚不清楚，需要进一步研究。
综上所述，本研究结果提示，CD4+/CD8+ T 细胞比值降低使机体处于免疫抑制状态，易导致肿瘤转移；p53 基因突变组患者的肿瘤微环境呈现较强的免疫抑制状态，但其调控机制还有待进一步研究证实。此外，它们之间相互作用的机制以及如何优化免疫表型设计和个体化联合免疫治疗，也需要进一步的深入研究。
乳腺癌的发病率在女性恶性肿瘤中位居第1 位[1-2]。因乳腺癌细胞存在异质性，且乳腺癌呈现出逐年上升与年轻化的趋势[3]，因此如何评估乳腺癌的转移状态与预后就成为临床上防治乳腺癌的焦点所在。有研究[4-5]提示：乳腺癌肿瘤簇内和间质中的肿瘤浸润 T 淋巴细胞（TIL）在肿瘤的浸润、转移及预后中发挥着极其重要的免疫作用，但国内外研究的结果存在较大的分歧。本研究通过对 85 例乳腺浸润性导管癌肿瘤簇内与间质中 CD4+和 CD8+ T 细胞比例及 p53 基因表达的研究，探讨了它们之间的相关性及其在乳腺癌浸润、转移及预后中的作用，旨在为临床防治乳腺癌与评估其预后提供新的视野。
1 资料与方法
1.1 研究对象
本研究的纳入标准：① 女性患者；② 初诊病例，且均经病理学检查确诊为乳腺浸润性导管癌。排除标准：① 男性乳腺癌患者；② 既往有恶性肿瘤病史者。回顾性收集解放军第 371 医院于 2010–2012 年期间行手术切除的 85 例乳腺浸润性导管癌标本，手术方式均为改良乳腺癌根治术和单纯的乳房切除术。85 例患者的年龄为 22～73 岁，中位年龄为 46 岁；临床分期：0～Ⅰ 期 26 例（30.6%），Ⅱ～Ⅲ 期 59 例（69.4%）；肿瘤直径：<2 cm 者 45 例（52.9%），2～5 cm 者 36 例（42.4%），>5 cm 者 4 例（4.7%）。组织学分级：Ⅰ 级 71 例（83.5%），Ⅱ 级 10 例（11.8%），Ⅲ 级 4 例（4.7%）；分子分型：Luminal A 型 19 例（22.4%），Luminal B 型 29 例（34.1%），人类表皮生长因子受体 2（HER-2）型 34 例（40.0%），Basal-like 型 3 例（3.5%）；发生前哨淋巴结转移 32 例（37.6%），无前哨淋巴结转移 53 例（62.4%）。本研究经解放军第 371 医院伦理委员会批准同意。
1.2 免疫组织化学染色方法及结果判定
选取所需的肿瘤组织蜡块，行 4 μm 厚切片，经烤片、脱蜡、水化及高温高压抗原修复后，再采用 EN Vision 二步法进行免疫组织化学染色。首先加入一抗，包括 CD4（抗体克隆号：SP35）、CD8（抗体克隆号：SP16）及 p53（抗体克隆号：DO-7），4 ℃ 冰箱过夜；次日水洗后滴加辣根过氧化物酶标记二抗，恒温孵育；最后行 DAB 显色、苏木精复染、分化及封片，在显微镜下进行观察及结果判断。具体操作同试剂盒说明书。以具有棕褐色颗粒即阳性染色的扁桃体组织作为阳性对照，以 PBS 溶液处理的切片（PBS 溶液代替一抗和二抗）作为阴性对照。
CD4 和 CD8 的阳性染色位于胞质或胞膜，p53 基因的阳性染色位于胞核，阳性染色呈棕黄色或棕褐色[6-8]。在高倍镜（40 倍）下计数（10 个视野）。CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞的比例为阳性炎症细胞占间质/肿瘤细胞簇中所有有核细胞的百分比。p53 基因染色结果的判定依据：阳性细胞所占百分比<5% 计为 0 分，5%～25% 计为 1 分，26%～50% 计为 2 分，51%～75% 计为 3 分，>76% 计为 4 分；再根据染色强度计分：不着色计为 0 分，淡黄色计为 1 分，棕黄色计为 2 分，棕褐色计为 3 分。取两项得分之积作为最终的得分，其中>1 分判定为阳性，表明存在 p53 基因突变，≤1 分判定为阴性（野生型）[8]。
1.3 随访
术后采用电话、家访、患者来院复查等方式就患者的生存状况进行随访。本组患者的随访截止时间为 2016 年 12 月 28 日。患者的生存期定义为手术结束到患者死亡或者随访终止的时间。本组有 79 例患者获访，随访时间 2～84 个月，中位随访时间为 32.2 个月。
1.4 统计学方法
采用 Graphpad 5.0 统计软件对数据进行统计学分析。CD4+ T 细胞比例、CD8+ T 细胞比例以及 CD4+/CD8+ T 细胞比值均以均数±标准差（
±s）表示，组间均数的比较采用 t 检验（成组或配对）。生存分析采用 log-rank 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 肿瘤簇中和间质内 CD4+ T 细胞比例、CD8+ T 细胞比例及 CD4+/CD8+ T 细胞比值比较
85 例患者中，p53 基因表达阳性 27 例（31.8%），阴性 58 例（68.2%），见图 1–4。不管是在肿瘤簇中还是在间质内，CD8+ T 细胞比例均低于 CD4+ T 细胞比例（P<0.01）。与肿瘤簇中比较，间质内的 CD4+ T 细胞比例和 CD8+ T 细胞比例均较高，而 CD4+/CD8+ T 细胞比值较低，差异均有统计学意义（P<0.05）。具体见表 1。
图1
示存在 p53 基因突变、淋巴结未转移的乳腺浸润性导管癌组织中的 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞（EN Vision 二步法 ×200）
a：CD4+ T 细胞；b：CD8+ T 细胞
图2
示存在 p53 基因突变、淋巴结转移的乳腺浸润性导管癌组织中的 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞（EN Vision 二步法 ×200）
a：CD4+ T 细胞；b：CD8+ T 细胞
图3
示 p53 基因未突变、淋巴结转移的乳腺浸润性导管癌组织中的 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞（EN Vision 二步法 ×200）
a：CD4+ T 细胞；b：CD8+ T 细胞
图4
示 p53 基因未突变、淋巴结未转移的乳腺浸润性导管癌组织中的 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞（EN Vision 二步法 ×200）
a：CD4+ T 细胞；b：CD8+ T 细胞
表1
肿瘤簇中和间质内的 CD4+ T 细胞比例、CD8+ T 细胞比例及 CD4+/CD8+ T 细胞比值（
，n=85）
2.2 前哨淋巴结转移组和前哨淋巴结未转移组患者的 CD4+ T 细胞比例、CD8+ T 细胞比例及 CD4+/CD8+ T 细胞比值比较
在前哨淋巴结转移组和未转移组患者中，与肿瘤簇中比较，间质内的 CD4+和 CD8+ T 细胞比例均较高（P<0.01），而 CD4+/CD8+ T 细胞比值均较低（P<0.05）。在肿瘤簇中，与前哨淋巴结转移组患者比较，前哨淋巴结未转移组患者的 CD4+ T 细胞比例及 CD4+/CD8+ T 细胞比值的差异均无统计学意义（P>0.05），但前哨淋巴结未转移组患者的 CD8+ T 细胞比例较低（P<0.05）。在肿瘤间质中，与前哨淋巴结转移组患者比较，前哨淋巴结未转移组患者的 CD4+ T 细胞比例和 CD8+ T 细胞比例均较低（P<0.05），CD4+/CD8+ T 细胞比值较高（P<0.05）。具体见表 2。
表2
前哨淋巴结转移组和未转移组患者的 CD4+ T 细胞比例、CD8+ T 细胞比例及 CD4+/CD8+ T 细胞比值比较
2.3 p53 基因突变组和未突变组患者的 CD4+ T 细胞比例、CD8+ T 细胞比例及 CD4+/CD8+ T 细胞比值比较
在 p53 基因突变组和未突变组患者中，与肿瘤簇中比较，间质内的 CD4+和 CD8+ T 细胞比例均增高（P<0.05），且 p53 基因未突变组患者间质内的 CD4+/CD8+ T 细胞比值较肿瘤簇低（P<0.05），但 p53 基因突变组肿瘤簇中和间质内的CD4+/CD8+ T 细胞比值比较差异无统计学意义（P>0.05）。不管是在肿瘤簇中还是在间质内，与 p53 基因突变组比较，p53 基因未突变组患者的 CD4+ T 细胞比例及 CD8+ T 细胞比例均较低（P<0.05），而 CD4+/CD8+ T 细胞比值均较高（P<0.05）。具体见表 3。
表3
p53 基因突变组和未突变组患者的 CD4+ T 细胞比例、CD8+ T 细胞比例及 CD4+/CD8+ T 细胞比值比较
2.4 乳腺浸润性导管癌的预后与 CD8+ T 细胞浸润程度和 p53 基因表达的关系
根据文献[5]，本研究选择了间质内的 CD8+ T 细胞比例和 p53 基因的表达两项指标，探索其与患者预后的关系。根据间质内 CD8+ T 细胞比例的均值[5]，将患者分为 CD8+ T 细胞高浸润组（35 例）与低浸润组（50 例）。Graphpad 生存分析结果显示，间质内 CD8+ T 细胞浸润程度和 p53 基因表达均与患者的预后相关：高浸润者与低浸润者的 5 年生存率分别为 78.3% 和 85.9%，生存情况比较差异有统计学意义（P<0.05）；p53 基因突变组与未突变组患者的 5 年生存率分别为 67.2% 和 89.5%，生存情况比较差异有统计学意义（P<0.05）。p53 基因突变和 CD8+ T 细胞高浸润提示患者的预后不良，见图 5 和图 6。
图5
示 CD8+ T 细胞高浸润和低浸润患者的生存曲线
图6
示 p53 基因突变和未突变患者的生存曲线
3 讨论
乳腺癌已位居女性恶性肿瘤发病的首位，由于乳腺癌患者存在个体生物学特征的极大不同，故对于临床的肿瘤转移、预后以及治疗的预测存在不确定性，如何对乳腺癌患者进行精准化的个体化治疗，这是临床医师和患者的需求，因此加大对肿瘤与机体免疫功能之间的研究势在必行。研究[9]发现，肿瘤微环境中的组织成分在肿瘤的浸润、转移、破坏正常组织等过程中起着重要的作用。肿瘤的发生到转移是肿瘤微环境的实质和间质之间相互作用的结果，肿瘤微环境中的免疫状态，尤其是细胞介导的免疫反应能直接反映机体局部对肿瘤的反应情况[10]。TIL 是新近发现的与肿瘤免疫相关的重要成分，CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞便是 TIL 中的一员，在肿瘤微环境内对于肿瘤的发展、转移、预后等发挥非常重要的作用[11]。以往的研究多为血液中淋巴亚群的分析[12-13]，不能完全反映肿瘤微环境中的情况，且对于肿瘤微环境的研究甚少。本研究重点在于直接研究肿瘤微环境中的 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞，以直接反映机体肿瘤微环境中的免疫状态，并探讨其与乳腺癌转移及预后的关系。
TIL 主要由 CD4+ T 细胞（辅助性 T 淋巴细胞）和 CD8+ T 细胞（细胞毒性 T 淋巴细胞）组成，是机体免疫系统对肿瘤细胞的特异性免疫表达[14]。两者与肿瘤细胞的演进密切相关：CD4+ T 细胞提呈抗原，通过直接或间接作用于 B 细胞产生抗体，也可以作用于 CD8+ T 细胞，使其激活[15]；CD8+ T 细胞激活后分泌的细胞因子能直接杀伤肿瘤细胞[16]。CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞两者相辅相成，调节、平衡机体正常的免疫应答反应[17]。乳腺浸润性导管癌患者的肿瘤组织中存在 T 细胞亚群的浸润[18]。CD8+ T 细胞比例的变化影响免疫功能，其比例越高，免疫抑制作用越强，且影响 CD4+/CD8+ T 细胞比值，该比值下降被认为是免疫抑制的表现，最终免疫状态失衡，进而促使肿瘤细胞在体内迅速发展[19-20]，因此研究肿瘤微环境中 TIL 的改变能直接反映机体抗肿瘤反应的状况。目前，国内对 CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞以及 CD4+/CD8+ T 细胞比值与 p53 基因突变之间关系的研究鲜有报道，因此本研究通过检测乳腺浸润性导管癌微环境中的 CD4+ T 细胞比例和 CD8+ T 细胞比例，以及 p53 基因在乳腺浸润性导管癌组织中的表达，探讨三者与乳腺浸润性导管癌转移及预后的关系。
本研究发现，不管是在肿瘤簇中还是在间质内，CD8+ T 细胞比例均低于 CD4+ T 细胞比例（P<0.01）；与肿瘤簇中比较，间质内的 CD4+ T 细胞比例和 CD8+ T 细胞比例均较高，而 CD4+/CD8+ T 细胞比值较低，说明 TIL 在肿瘤中的分布存在不同。笔者推测：这种现象或许是乳腺癌发生、发展与浸润的一个重要的机制。在前哨淋巴结转移方面，前哨淋巴结转移组患者间质内的 CD4+ T 细胞比例高于前哨淋巴结未转移组，提示 CD4+ T 细胞的浸润和淋巴结转移之间的关系密切，这与 Macchetti 等[21]的研究结论基本一致。其机制可能是，机体肿瘤细胞刺激了 CD4+ T 细胞反应性增加，CD4+ T 细胞同时又促进了乳腺癌的转移，这可能是乳腺癌浸润和转移的原因之一。这也充分说明了乳腺癌患者体内存在不同程度的细胞免疫状态紊乱[22]。本研究还发现，不管是在肿瘤簇中还是在间质内，前哨淋巴结转移组患者的 CD8+ T 细胞比例均较前哨淋巴结未转移组高，且生存分析发现，CD8+ T 细胞高浸润者的生存情况较低浸润者差。这与文献[5]报道的一致。
本研究也发现：肿瘤间质内 CD4+/CD8+ T 细胞比值较肿瘤簇中低，前哨淋巴结转移组患者间质内 CD4+/CD8+ T 细胞的比值也较前哨淋巴结未转移组低，这一结果与文献[21, 23]结果一致，也与何伟华等[24]的研究结果相符。CD4+/CD8+ T 细胞比值下降甚至倒置被认为是细胞免疫耐受、受抑制的表现。其具体机制为，肿瘤细胞释放大量的免疫抑制因子使 CD4+ T 细胞的功能下降，CD8+ T 细胞的数量或活性增高，从而表现为比值下降。同时 CD8+ T 细胞又对 CD4+ T 细胞进行调节，阻止其形成和成熟，这种现象有利于肿瘤的生长[25]。本研究还发现，在肿瘤簇中，前哨淋巴结转移组的 CD4+/CD8+ T 细胞比值与前哨淋巴结未转移组的差异无统计学意义，该结果与文献[21, 23]不一致。考虑因素为：本研究例数较少，需要再进一步收集病例，完善数据；此外也有可能是存在其他免疫机制。有研究[26]表明，在恶性肿瘤细胞的演进过程中，肿瘤细胞会产生白介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）等免疫抑制因子，抑制淋巴细胞的增殖和分化。另外，CD4+ T 细胞有较强的分泌功能，能分泌 IL-2、IL-3、干扰素 γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等，参与机体免疫反应的调节，可通过促进 CD4+ T 细胞的增殖、分化和激活而间接影响靶细胞的杀伤[27]。CD4+CD25+Treg（调节性 T 细胞）对机体的耐受作用影响免疫系统对肿瘤细胞的清除，CD4+CD25+Treg 可能通过对机体的免疫抑制而促进肿瘤的生长，是肿瘤免疫逃逸的重要机制之一[28]。由于机体内是一个复杂的网络调控体系，且影响肿瘤预后与淋巴结转移的因素太多，因此可能会导致研究间结果的不同，有待未来更深入的研究进行验证。
p53 是抑癌基因，在很多肿瘤组织中发生突变，参与多种肿瘤的发生和发展[8, 29]。本研究发现，在乳腺癌组织中 p53 基因突变率为 31.8%（27/85）。进一步研究发现，在 p53 基因突变组患者的肿瘤簇中和间质内，其 CD4+ T 细胞比例和 CD8+ T 细胞比例均较 p53 基因未突变组高，而 CD4+/CD8+ T 细胞比值较 p53 基因未突变组低。笔者推测：p53 基因的突变可能是导致 TIL（CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞）分布和比例不同的重要因素。然而 p53 基因突变如何影响免疫细胞的比例和分布？为何又在患者预后方面存在明显的不同？为何又能影响患者的生存？其在肿瘤细胞免疫方面的机制如何？这些尚不清楚，需要进一步研究。
综上所述，本研究结果提示，CD4+/CD8+ T 细胞比值降低使机体处于免疫抑制状态，易导致肿瘤转移；p53 基因突变组患者的肿瘤微环境呈现较强的免疫抑制状态，但其调控机制还有待进一步研究证实。此外，它们之间相互作用的机制以及如何优化免疫表型设计和个体化联合免疫治疗，也需要进一步的深入研究。
