引用本文： 张琪, 杨光华, 刘少鹏, 张国志, 王长友. ADAM17-shRNA 通过 Akt/GSK3β 信号通路促进 HT29 结肠癌细胞的凋亡. 中国普外基础与临床杂志, 2018, 25(5): 534-539. doi: 10.7507/1007-9424.201710044 复制
结肠癌是一种预后较差且发病率逐年上升的恶性肿瘤，分别位列男性和女性恶性肿瘤的第 3 位和第 2 位[1-2]。沉默解聚素-金属蛋白酶 17（ADAM17）又称肿瘤坏死因子 α 转换酶（TACE）[3]。研究表明，ADAM17 蛋白可以通过发挥水解剪切酶类的作用，在肿瘤的发生和发展方面发挥重要作用[4]，且对肿瘤患者的生存预后有一定的提示作用[5]，但具体机制尚不清楚。肿瘤细胞的无限增殖意味着抗凋亡的发生。因此，本研究通过抑制 HT29 结肠癌细胞中 ADAM17 蛋白的表达，探讨其对肿瘤细胞增殖和凋亡的抑制作用及其可能的机制。
1 材料与方法
1.1 主要材料、试剂和设备
HT29 人结肠癌细胞株购自中国科学院干细胞库，保存于华北理工大学医学研究中心。重组慢病毒 ADAM17-hsa-1658 购于上海吉玛公司。主要试剂：DMEM 培养基、胎牛血清（FBS）及胰酶（美国 Gibco 公司）；TRIzol 试剂盒、Go ScriptTM逆转录试剂盒及实时荧光定量 PCR（real-time PCR）试剂盒（美国 Invitrogen 公司）；ADAM17 蛋白抗体（美国 abcam 公司）；其他蛋白抗体，包括半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase3）、磷酸化蛋白激酶 B（P-Akt）、蛋白激酶 B（Akt）、磷酸化糖原合成酶激酶-3β（P-GSK3β）、糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）和 Annexin-V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒（美国 Sigma 公司）；HR 标记的山羊抗兔 IgG 二抗、β-肌动蛋白（β-actin）抗体、3-（4, 5-二甲基噻唑-2）-2, 5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）试剂盒及 DAB 显影液（上海碧云天生物技术研究所）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒、RIPA 裂解液、苯甲基磺酰氟化物（PMSF）及十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶配制试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）。主要设备：iMark 酶标仪、DYC-Mini1 电泳仪及 DYC-ZY2 湿转系统（上海 BIO-RAD 公司）；FACS Calibuar 流式细胞仪（美国 BD 公司）；QuantStudioTM 12K Flex 实时荧光定量 PCR 仪（美国 Applied BiosystemsTM公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
HT29 人结肠癌细胞用含 10% FBS 的 DMEM 培养基，在 5% CO2、37.0 ℃ 条件下的孵育箱中培养，每 2 天传代 1 次。
1.2.2 重组慢病毒载体的构建
ADAM17 小干扰 RNA（ADAM17-shRNA）和无意义序列小干扰 RNA（即阴性对照 shRNA）由上海吉玛公司合成，ADAM17-shRNA 的序列为 5´-GCATCATGT-ATCTGAACAACG-3´，无意义 shRNA 的序列为 5´-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3´。慢病毒和 shRNA 的连接由上海吉玛公司代为完成。
1.2.3 细胞分组
将细胞分为 3 组：干扰组、阴性对照组和空白对照组。干扰组细胞转染ADAM17 重组慢病毒载体，阴性对照组细胞转染阴性对照重组慢病毒载体，空白对照组加入等量的 PBS 溶液。转染根据试剂盒说明书进行，根据预实验将感染复数（MOI）值设定为 100。转染 48 h 后在荧光显微镜下观察，根据荧光强度和数量判断转染效果。转染成功后 24 h 进行指标检测。
1.2.4 Anneixin-V-FITC/PI 染色法检测细胞凋亡率
取对数生长期细胞，制备成单细胞悬液，按每孔约 1×105个细胞接种于 6 孔板中，加入 2 mL 含 10% FBS 的 DMEM 培养基，在 37 ℃、5% CO2 条件下培养 48 h 后，以胰酶消化，离心 5 min（1 000 r/min，r=9.5 cm），弃上清。以 PBS 液重悬细胞，离心 5 min（1 000 r/min，r=9.5 cm），弃上清。加入 185 μL Annexin V-FITC 结合液重悬细胞后，再加入 5 μL Annexin V-FITC 和 10 μL PI 染色液混匀。室温避光孵育 10 min，1 h 内进行流式细胞仪检测分析，以右象限凋亡细胞的含量合计为凋亡细胞数。实验重复 3 次，取均值。
1.2.5 MTT 法检测细胞增殖
取对数生长期的 HT29 细胞制备成单细胞悬液，接种于 96 孔板上（每孔接种量为 1×103个细胞），每个时点均设 8 个复孔。分别于培养 24、48 及 72 h 时，每孔加入 MTT 20 μL，于 37 ℃ 培养箱中培养 4 h 后，在避光的情况下用 200 μL 二甲基亚砜（DMSO）替换掉原培养液，再在 37 ℃ 培养箱中反应 15 min 后，使用酶标仪在 570 nm 波长条件下检测各孔的吸光度值（A值）。因 A 值与孔内存活细胞数呈正比，故用 A 值表示细胞的增殖能力。实验独立重复 3 次，取均值。
1.2.6 实时荧光定量 PCR 法检测 ADAM17 mRNA 的表达
取对数生长期细胞，制备成单细胞悬液，按每孔约 1×106个细胞接种于 6 孔板中。转染成功后 48 h，以 TRIzol 法提取细胞 RNA。通过 Go ScriptTM逆转录试剂盒将 RNA 反转录为 cDNA，然后进行 qRT-PCR。引物序列由 Invitrogen 生物公司合成，设计如下。ADAM17 基因：5´-ATCAAACC- TTTCCTGCG-3´（正义链），5´-CAAACCCAT- CCTCGTCCA-3´（反义链），扩增产物长度为 154 bp；内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）：5´-GAAG- GTGAAGGTCGGAGTC-3´（正义链），5´-GAAGA- TGGTGATGGGATTTC-3´（反义链），扩增产物长度为 154 bp。PCR 条件：95 ℃ 变性 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；总共 40 个循环。PCR 反应体系为 20 μL 体系，具体见试剂盒说明书。采用 2-△△CT法计算 ADAM17 mRNA 的表达水平。实验重复 3 次，取均值。
1.2.7 Western blot 法检测相关蛋白的表达
取对数生长期细胞，制备成单细胞悬液，按每孔约 1×106个细胞接种于 6 孔板中，取 3 组转染后 48 h 的细胞以 RIPA 裂解液裂解，4 ℃ 离心（12 000 r/min，r=8 cm）15 min 以收集蛋白。以 BCA 法定量总蛋白，加入等体积的 2×蛋白上样缓冲液后 100℃ 变性5 min，–80 ℃ 保存备用。进行 SDS-PAGE 蛋白电泳，再分别进行转膜（90 V、90 min）、10% 脱脂奶封闭、一抗孵育过夜（1∶1 000）、二抗（1∶100）37 ℃ 孵育 2 h 及荧光显色。以 Image J 软件分析各条带的灰度值，相关蛋白的表达水平=（所测蛋白条带的灰度值/内参条带的灰度值）×100%。实验重复 3 次，取均值。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 19.0 统计软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（
±s）表示，统计方法采用单因素方差分析。首先进行方差齐性的检验，若方差齐，采用 LSD 法；若方差不齐，则采用近似方差分析的 Brown-Forsythe 法进行校正。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 转染效果
干扰组转染 48 h 后在荧光显微镜下观察，可见荧光率达到 90% 以上（图 1）。
图1
示干扰组 HT29 细胞转染 48 h 后的转染效果（×200）
a：透光显微镜图片；b：荧光显微镜图片；c：合成图片
2.2 3 组细胞的凋亡率比较
通过 Anneixin-V-FITC/PI 试剂盒检测细胞凋亡率，结果显示，沉默 ADAM17 基因后，与干扰组比较，空白对照组和阴性对照组细胞的凋亡率均较低（P<0.05），但空白对照组和阴性对照组的凋亡率比较差异无统计学意义（P>0.05）。具体见图 2和图 3。
图4
示 3 组细胞的 A 值变化
同时点干扰组与空白对照组和阴性对照组比较，差异均有统计学意义（
图5
示 3 组细胞中 ADAM17 mRNA 及其蛋白的表达
a：ADAM17 mRNA 的相对表达水平；b：ADAM17 蛋白表达的电泳图；c：ADAM17 蛋白的相对表达水平；与空白对照组比较，*
2.3 3 组细胞的细胞增殖能力比较
MTT 结果显示，在培养 72 h 期间，3 组细胞的 A 值均有所增加。与干扰组比较，空白对照组和阴性对照组的 A 值增加得较快，但空白对照组和阴性对照组的 A 值增长曲线几乎重叠、差距很小。在 24、48 及 72 h 时，同时点与干扰组比较，空白对照组和阴性对照组细胞的 A 值均较高（P<0.05），但同时点空白对照组和阴性对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。具体见表 1 和图 4。
表1
3 组细胞不同时点的 A 值（
）
图3
示 3 组细胞的凋亡率比较
与空白对照组比较，*
2.4 3 组细胞中 ADAM17 mRNA 及其蛋白的表达
与干扰组比较，阴性对照组和空白对照组细胞中 ADAM17 mRNA 及其蛋白的表达水平均较高（P<0.01），但阴性对照组和空白对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。具体见图 5。
图2
示 3 组细胞凋亡率检测的流式细胞图
a：空白对照组；b：阴性对照组；c：干扰组
2.5 3 组细胞中凋亡蛋白 caspase3 蛋白的表达
Western blot 结果显示，与干扰组比较，空白对照组和阴性对照组细胞中 caspase3 蛋白的表达水平均较低（P<0.01），但空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。具体见图 6。
图6
示 3 组细胞中 caspase3 蛋白的表达
a：蛋白表达的电泳图；b：蛋白的相对表达水平；与空白对照组比较，*
2.6 3 组细胞中 Akt/GSK3β 通路蛋白的表达
在验证了细胞发生凋亡以后，笔者继续检测了 Akt/GSK3β 通路蛋白的表达，结果显示，与干扰组比较，空白对照组和阴性对照组中 P-Akt 蛋白和P-GSK3β 蛋白的表达水平均较高（P<0.01），但空白对照组和阴性对照组的 P-Akt 蛋白和 P-GSK3β 蛋白的表达水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）；3 组细胞中 Akt 蛋白和 GSK3β 蛋白的表达水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。具体见图 7。
图7
示 3 组细胞中 Akt/GSK3β 通路蛋白的表达
a：各蛋白表达的电泳图；b：各蛋白的相对表达水平；与空白对照组比较，*
3 讨论
结肠癌是由遗传、环境、饮食、习惯、暴露等多种因素协同作用的结果[6]。近年来随着我国饮食结构的改变，结肠癌在我国的发病率逐年上升[1]。除了传统的手术切除及同步放化疗治疗以外，人们现在的目光越来越集中在基于特定基因或功能蛋白的靶向治疗上[7]。
既往报道[5, 8-9]指出，ADAM17 蛋白具有水解蛋白、活化配体及释放生物活性因子的功能，在胃癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中异常高表达。已有文献报道[10-11]指出，ADAM17 蛋白在结肠癌组织中呈明显异常高表达状态，并与结肠癌的转移、预后等密切相关。有研究[12-14]报道，ADAM17 蛋白可以通过 Notch、磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）/Akt 等多条信号通路调控肿瘤细胞的生物学行为。因此，ADAM17 分子在结肠癌的靶向治疗上极有潜力。
肿瘤的无限增殖和凋亡激活受阻是肿瘤恶性生物学行为的根本所在，因此诱导细胞凋亡现已成为大多数化疗药物的主要研究靶点。caspase3 是效应凋亡蛋白酶（effector caspases）家族中的最重要的凋亡执行者之一，在细胞凋亡途径中居中心地位[15]。caspase3 蛋白一旦被激活，通过下游级联反应，破坏细胞结构和关键蛋白质，使细胞凋亡进入不可逆阶段[16-17]。在本次实验中，在沉默了 ADAM17 基因后 caspase3 蛋白的表达被明显激活，说明沉默 ADAM17 基因能够激活细胞的凋亡系统。
Akt 信号转导通路是一个重要的生命信号通路，在细胞的增殖中发挥重要作用，Akt 的持续活化与肿瘤的发生发展密切相关[18-19]。在前期研究[20]中，笔者发现，沉默 ADAM17 基因可以通过表皮生长因子受体（EGFR）/PI3K/Akt 通路影响乳腺癌细胞的生物学行为。Akt/GSK3β 作为下游信号通路，与肿瘤细胞的生长和增殖密切相关[21-22]，P-Akt 减少可以使 GSK3β 磷酸化水平下降，导致 GSK3β 失活减少[23-24]，而 Akt/GSK3β 信号通路一旦受到抑制，便有可能发挥抗肿瘤效应[25]。因此笔者推测，ADAM17 基因可能会通过 Akt/GSK3β 通路发挥作用。在沉默 ADAM17 基因后，笔者发现，GSK3β和Akt 的活化产物——P-GSK3β及P-Akt 的表达水平均明显降低，因此推测沉默 ADAM17 基因可能通过抑制 Akt/GSK3β 通路的激活，来抑制细胞增殖，调控细胞凋亡。
本次实验结果表明，沉默 ADAM17 基因能够通过 Akt/GSK3β 信号转导通路调控 GSK3β 蛋白的活化，进而诱导细胞凋亡，实现对 HT29 结肠癌细胞增殖的调控作用，但 Akt/GSK3β 信号转导通路可能不是其诱导凋亡、抑制肿瘤细胞生长的唯一信号通路，其对凋亡的影响和具体作用机制需后续实验进一步探究。
结肠癌是一种预后较差且发病率逐年上升的恶性肿瘤，分别位列男性和女性恶性肿瘤的第 3 位和第 2 位[1-2]。沉默解聚素-金属蛋白酶 17（ADAM17）又称肿瘤坏死因子 α 转换酶（TACE）[3]。研究表明，ADAM17 蛋白可以通过发挥水解剪切酶类的作用，在肿瘤的发生和发展方面发挥重要作用[4]，且对肿瘤患者的生存预后有一定的提示作用[5]，但具体机制尚不清楚。肿瘤细胞的无限增殖意味着抗凋亡的发生。因此，本研究通过抑制 HT29 结肠癌细胞中 ADAM17 蛋白的表达，探讨其对肿瘤细胞增殖和凋亡的抑制作用及其可能的机制。
1 材料与方法
1.1 主要材料、试剂和设备
HT29 人结肠癌细胞株购自中国科学院干细胞库，保存于华北理工大学医学研究中心。重组慢病毒 ADAM17-hsa-1658 购于上海吉玛公司。主要试剂：DMEM 培养基、胎牛血清（FBS）及胰酶（美国 Gibco 公司）；TRIzol 试剂盒、Go ScriptTM逆转录试剂盒及实时荧光定量 PCR（real-time PCR）试剂盒（美国 Invitrogen 公司）；ADAM17 蛋白抗体（美国 abcam 公司）；其他蛋白抗体，包括半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase3）、磷酸化蛋白激酶 B（P-Akt）、蛋白激酶 B（Akt）、磷酸化糖原合成酶激酶-3β（P-GSK3β）、糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）和 Annexin-V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒（美国 Sigma 公司）；HR 标记的山羊抗兔 IgG 二抗、β-肌动蛋白（β-actin）抗体、3-（4, 5-二甲基噻唑-2）-2, 5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）试剂盒及 DAB 显影液（上海碧云天生物技术研究所）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒、RIPA 裂解液、苯甲基磺酰氟化物（PMSF）及十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶配制试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）。主要设备：iMark 酶标仪、DYC-Mini1 电泳仪及 DYC-ZY2 湿转系统（上海 BIO-RAD 公司）；FACS Calibuar 流式细胞仪（美国 BD 公司）；QuantStudioTM 12K Flex 实时荧光定量 PCR 仪（美国 Applied BiosystemsTM公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
HT29 人结肠癌细胞用含 10% FBS 的 DMEM 培养基，在 5% CO2、37.0 ℃ 条件下的孵育箱中培养，每 2 天传代 1 次。
1.2.2 重组慢病毒载体的构建
ADAM17 小干扰 RNA（ADAM17-shRNA）和无意义序列小干扰 RNA（即阴性对照 shRNA）由上海吉玛公司合成，ADAM17-shRNA 的序列为 5´-GCATCATGT-ATCTGAACAACG-3´，无意义 shRNA 的序列为 5´-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3´。慢病毒和 shRNA 的连接由上海吉玛公司代为完成。
1.2.3 细胞分组
将细胞分为 3 组：干扰组、阴性对照组和空白对照组。干扰组细胞转染ADAM17 重组慢病毒载体，阴性对照组细胞转染阴性对照重组慢病毒载体，空白对照组加入等量的 PBS 溶液。转染根据试剂盒说明书进行，根据预实验将感染复数（MOI）值设定为 100。转染 48 h 后在荧光显微镜下观察，根据荧光强度和数量判断转染效果。转染成功后 24 h 进行指标检测。
1.2.4 Anneixin-V-FITC/PI 染色法检测细胞凋亡率
取对数生长期细胞，制备成单细胞悬液，按每孔约 1×105个细胞接种于 6 孔板中，加入 2 mL 含 10% FBS 的 DMEM 培养基，在 37 ℃、5% CO2 条件下培养 48 h 后，以胰酶消化，离心 5 min（1 000 r/min，r=9.5 cm），弃上清。以 PBS 液重悬细胞，离心 5 min（1 000 r/min，r=9.5 cm），弃上清。加入 185 μL Annexin V-FITC 结合液重悬细胞后，再加入 5 μL Annexin V-FITC 和 10 μL PI 染色液混匀。室温避光孵育 10 min，1 h 内进行流式细胞仪检测分析，以右象限凋亡细胞的含量合计为凋亡细胞数。实验重复 3 次，取均值。
1.2.5 MTT 法检测细胞增殖
取对数生长期的 HT29 细胞制备成单细胞悬液，接种于 96 孔板上（每孔接种量为 1×103个细胞），每个时点均设 8 个复孔。分别于培养 24、48 及 72 h 时，每孔加入 MTT 20 μL，于 37 ℃ 培养箱中培养 4 h 后，在避光的情况下用 200 μL 二甲基亚砜（DMSO）替换掉原培养液，再在 37 ℃ 培养箱中反应 15 min 后，使用酶标仪在 570 nm 波长条件下检测各孔的吸光度值（A值）。因 A 值与孔内存活细胞数呈正比，故用 A 值表示细胞的增殖能力。实验独立重复 3 次，取均值。
1.2.6 实时荧光定量 PCR 法检测 ADAM17 mRNA 的表达
取对数生长期细胞，制备成单细胞悬液，按每孔约 1×106个细胞接种于 6 孔板中。转染成功后 48 h，以 TRIzol 法提取细胞 RNA。通过 Go ScriptTM逆转录试剂盒将 RNA 反转录为 cDNA，然后进行 qRT-PCR。引物序列由 Invitrogen 生物公司合成，设计如下。ADAM17 基因：5´-ATCAAACC- TTTCCTGCG-3´（正义链），5´-CAAACCCAT- CCTCGTCCA-3´（反义链），扩增产物长度为 154 bp；内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）：5´-GAAG- GTGAAGGTCGGAGTC-3´（正义链），5´-GAAGA- TGGTGATGGGATTTC-3´（反义链），扩增产物长度为 154 bp。PCR 条件：95 ℃ 变性 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；总共 40 个循环。PCR 反应体系为 20 μL 体系，具体见试剂盒说明书。采用 2-△△CT法计算 ADAM17 mRNA 的表达水平。实验重复 3 次，取均值。
1.2.7 Western blot 法检测相关蛋白的表达
取对数生长期细胞，制备成单细胞悬液，按每孔约 1×106个细胞接种于 6 孔板中，取 3 组转染后 48 h 的细胞以 RIPA 裂解液裂解，4 ℃ 离心（12 000 r/min，r=8 cm）15 min 以收集蛋白。以 BCA 法定量总蛋白，加入等体积的 2×蛋白上样缓冲液后 100℃ 变性5 min，–80 ℃ 保存备用。进行 SDS-PAGE 蛋白电泳，再分别进行转膜（90 V、90 min）、10% 脱脂奶封闭、一抗孵育过夜（1∶1 000）、二抗（1∶100）37 ℃ 孵育 2 h 及荧光显色。以 Image J 软件分析各条带的灰度值，相关蛋白的表达水平=（所测蛋白条带的灰度值/内参条带的灰度值）×100%。实验重复 3 次，取均值。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 19.0 统计软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（
±s）表示，统计方法采用单因素方差分析。首先进行方差齐性的检验，若方差齐，采用 LSD 法；若方差不齐，则采用近似方差分析的 Brown-Forsythe 法进行校正。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 转染效果
干扰组转染 48 h 后在荧光显微镜下观察，可见荧光率达到 90% 以上（图 1）。
图1
示干扰组 HT29 细胞转染 48 h 后的转染效果（×200）
a：透光显微镜图片；b：荧光显微镜图片；c：合成图片
2.2 3 组细胞的凋亡率比较
通过 Anneixin-V-FITC/PI 试剂盒检测细胞凋亡率，结果显示，沉默 ADAM17 基因后，与干扰组比较，空白对照组和阴性对照组细胞的凋亡率均较低（P<0.05），但空白对照组和阴性对照组的凋亡率比较差异无统计学意义（P>0.05）。具体见图 2和图 3。
图4
示 3 组细胞的 A 值变化
同时点干扰组与空白对照组和阴性对照组比较，差异均有统计学意义（
图5
示 3 组细胞中 ADAM17 mRNA 及其蛋白的表达
a：ADAM17 mRNA 的相对表达水平；b：ADAM17 蛋白表达的电泳图；c：ADAM17 蛋白的相对表达水平；与空白对照组比较，*
2.3 3 组细胞的细胞增殖能力比较
MTT 结果显示，在培养 72 h 期间，3 组细胞的 A 值均有所增加。与干扰组比较，空白对照组和阴性对照组的 A 值增加得较快，但空白对照组和阴性对照组的 A 值增长曲线几乎重叠、差距很小。在 24、48 及 72 h 时，同时点与干扰组比较，空白对照组和阴性对照组细胞的 A 值均较高（P<0.05），但同时点空白对照组和阴性对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。具体见表 1 和图 4。
表1
3 组细胞不同时点的 A 值（
）
图3
示 3 组细胞的凋亡率比较
与空白对照组比较，*
2.4 3 组细胞中 ADAM17 mRNA 及其蛋白的表达
与干扰组比较，阴性对照组和空白对照组细胞中 ADAM17 mRNA 及其蛋白的表达水平均较高（P<0.01），但阴性对照组和空白对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。具体见图 5。
图2
示 3 组细胞凋亡率检测的流式细胞图
a：空白对照组；b：阴性对照组；c：干扰组
2.5 3 组细胞中凋亡蛋白 caspase3 蛋白的表达
Western blot 结果显示，与干扰组比较，空白对照组和阴性对照组细胞中 caspase3 蛋白的表达水平均较低（P<0.01），但空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。具体见图 6。
图6
示 3 组细胞中 caspase3 蛋白的表达
a：蛋白表达的电泳图；b：蛋白的相对表达水平；与空白对照组比较，*
2.6 3 组细胞中 Akt/GSK3β 通路蛋白的表达
在验证了细胞发生凋亡以后，笔者继续检测了 Akt/GSK3β 通路蛋白的表达，结果显示，与干扰组比较，空白对照组和阴性对照组中 P-Akt 蛋白和P-GSK3β 蛋白的表达水平均较高（P<0.01），但空白对照组和阴性对照组的 P-Akt 蛋白和 P-GSK3β 蛋白的表达水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）；3 组细胞中 Akt 蛋白和 GSK3β 蛋白的表达水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。具体见图 7。
图7
示 3 组细胞中 Akt/GSK3β 通路蛋白的表达
a：各蛋白表达的电泳图；b：各蛋白的相对表达水平；与空白对照组比较，*
3 讨论
结肠癌是由遗传、环境、饮食、习惯、暴露等多种因素协同作用的结果[6]。近年来随着我国饮食结构的改变，结肠癌在我国的发病率逐年上升[1]。除了传统的手术切除及同步放化疗治疗以外，人们现在的目光越来越集中在基于特定基因或功能蛋白的靶向治疗上[7]。
既往报道[5, 8-9]指出，ADAM17 蛋白具有水解蛋白、活化配体及释放生物活性因子的功能，在胃癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中异常高表达。已有文献报道[10-11]指出，ADAM17 蛋白在结肠癌组织中呈明显异常高表达状态，并与结肠癌的转移、预后等密切相关。有研究[12-14]报道，ADAM17 蛋白可以通过 Notch、磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）/Akt 等多条信号通路调控肿瘤细胞的生物学行为。因此，ADAM17 分子在结肠癌的靶向治疗上极有潜力。
肿瘤的无限增殖和凋亡激活受阻是肿瘤恶性生物学行为的根本所在，因此诱导细胞凋亡现已成为大多数化疗药物的主要研究靶点。caspase3 是效应凋亡蛋白酶（effector caspases）家族中的最重要的凋亡执行者之一，在细胞凋亡途径中居中心地位[15]。caspase3 蛋白一旦被激活，通过下游级联反应，破坏细胞结构和关键蛋白质，使细胞凋亡进入不可逆阶段[16-17]。在本次实验中，在沉默了 ADAM17 基因后 caspase3 蛋白的表达被明显激活，说明沉默 ADAM17 基因能够激活细胞的凋亡系统。
Akt 信号转导通路是一个重要的生命信号通路，在细胞的增殖中发挥重要作用，Akt 的持续活化与肿瘤的发生发展密切相关[18-19]。在前期研究[20]中，笔者发现，沉默 ADAM17 基因可以通过表皮生长因子受体（EGFR）/PI3K/Akt 通路影响乳腺癌细胞的生物学行为。Akt/GSK3β 作为下游信号通路，与肿瘤细胞的生长和增殖密切相关[21-22]，P-Akt 减少可以使 GSK3β 磷酸化水平下降，导致 GSK3β 失活减少[23-24]，而 Akt/GSK3β 信号通路一旦受到抑制，便有可能发挥抗肿瘤效应[25]。因此笔者推测，ADAM17 基因可能会通过 Akt/GSK3β 通路发挥作用。在沉默 ADAM17 基因后，笔者发现，GSK3β和Akt 的活化产物——P-GSK3β及P-Akt 的表达水平均明显降低，因此推测沉默 ADAM17 基因可能通过抑制 Akt/GSK3β 通路的激活，来抑制细胞增殖，调控细胞凋亡。
本次实验结果表明，沉默 ADAM17 基因能够通过 Akt/GSK3β 信号转导通路调控 GSK3β 蛋白的活化，进而诱导细胞凋亡，实现对 HT29 结肠癌细胞增殖的调控作用，但 Akt/GSK3β 信号转导通路可能不是其诱导凋亡、抑制肿瘤细胞生长的唯一信号通路，其对凋亡的影响和具体作用机制需后续实验进一步探究。
