引用本文： 宋礼坡, 张建, 谷涌泉, 陈兵, 郭连瑞, 王春梅, 吴英锋, 罗涛, 崔世军, 汪忠镐. 低氧培养增强骨髓源内皮祖细胞的增殖、黏附、迁移和生存能力. 中国普外基础与临床杂志, 2018, 25(5): 528-533. doi: 10.7507/1007-9424.201710088 复制
内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）是一类能增殖并分化为成熟的有功能的内皮细胞的前体细胞。1997年，EPC被成功地从外周血分离并证明其能够整合进血管新生的“活跃点”[1]，还能够增强缺血组织的侧支血管生长，所以在细胞移植治疗缺血性血管疾病的过程中EPC是一个非常合适的候选者，其目前已成为心血管缺血性疾病的重要靶点[2]。但是已知的动脉硬化相关危险因素对EPC产生负性影响，比如糖尿病、高血脂、吸烟等均会使EPC功能受抑制[3-6]，如何提高受损EPC的功能是目前研究热点。研究干细胞的微环境为我们提供了一个重要的思路，干细胞生存在一个包含多种细胞和分子成分的三维微环境空间里[7]。氧分子是这个微环境中一个非常重要的因子，不仅直接参加细胞的生理代谢，同时也是重要的信号分子，其已被证实多数干细胞（包括EPC）生存在一个相对低氧的微环境里面[8-9]。但当前国内外关于干细胞（包括EPC）的体外研究多采用21%的自然氧浓度培养环境，所提供的培养环境与生物体内微环境显然不同，必然对干细胞的增殖、分化等产生一定的影响，所以只有提供接近体内生存微环境的培养条件，才能够得出更加准确可靠的实验数据，进而提高干细胞移植的临床疗效。本研究设计体外诱导分化、扩增骨髓来源的EPC，在不同氧浓度下进行培养，观察不同氧浓度对骨髓源EPC增殖、黏附、迁移、生存能力等这些与血管新生相关的生物学特性的影响，为提高干细胞移植治疗缺血性心血管疾病的临床疗效提供一定的研究基础。
1 材料与方法
1.1 骨髓源EPC的获取、体外诱导、培养及扩增
SD大鼠，25只，雄性，体质量 200～250 g，北京维通利华实验动物有限公司提供。骨髓源EPC的获取、体外诱导、培养及扩增具体方法参考文献[10]。于大鼠腹腔内注射10%水合氯醛（0.5 mL/100 g）深度麻醉后断头处死，放入75%乙醇内浸泡15 min后剪取股骨和胫骨；离断两端骨骺，用预冷至4 ℃的 PBS 溶液5～10 mL冲洗骨髓腔直至骨变白及冲洗液清亮。应用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，接种于预先用纤维连接蛋白铺底的 25 cm2培养瓶内，培养瓶内加入EBM-2完全培养基，置于37 ℃细胞培养箱中培养，48 h后轻轻换液，弃去未贴壁细胞，以后每隔2 d更换培养液。每天于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，观察7～8 d。
1.2 骨髓源EPC的鉴定
细胞培养至第7～8天时，采用功能鉴定方法，用乙酰化的低密度脂蛋白（Dil-Ac-LDL）和异硫氰酸荧光素-荆豆凝集素-Ⅰ（FITC-UEA-Ⅰ）进行双阳性鉴定。在荧光显微镜下观察细胞，用510 nm激发光激发Dil，用488 nm激发光激发FITC。荧光染色双阳性细胞被认为是正在分化中的EPC。
1.3 检测不同氧浓度对EPC增殖、黏附、迁移和生存能力的影响
将上面鉴定的EPC计数分组并分别置入不同氧浓度（1%、5%及21%）的培养箱中继续培养和观察。于不同氧浓度下培养至第3天和第7天时严格按照细胞增殖实验试剂盒（Molecular Probes Inc.，美国）、细胞黏附实验试剂盒（Molecular Probes Inc.，美国）、细胞迁移实验试剂盒（Platypus Technologies，美国）、细胞凋亡和死亡实验试剂盒（Molecular Probes Inc.，美国）的操作说明对EPC增殖、黏附、迁移和生存（抗凋亡和抗死亡）能力进行测定，结果分别用吸光度值、黏附细胞百分比、迁移细胞数量以及生存细胞百分比表示。① 吸光度值计算：每个氧浓度环境下在培养板上设置 6 个培养孔，每个孔测量 3 次，然后取 6 个培养孔的平均值进行统计分析。② 黏附细胞百分比计算：每个氧浓度环境下，将等量 EPC 置入培养板的培养孔中，立即随机取 10 个高倍镜视野进行计数，取平均值作为分母，然后过 3 h后，PBS液冲洗，再取 10 个高倍镜视野进行黏附的细胞计数，取平均值作为分子，最后计算公式为：黏附细胞百分比=黏附细胞数/总细胞数×100%。③ 迁移细胞数量计算：每个氧浓度环境下在试剂盒提供的培养板上设置 6 个培养孔，每个培养孔计数迁移的细胞数 3 次，然后取 6 个培养孔的平均值进行统计分析。④ 生存细胞百分比计算：每个氧浓度环境下，随机取 10 个视野，生存细胞百分比=生存细胞数/（生存细胞数+死亡细胞数+凋亡细胞数）×100%。
1.4 统计学方法
采用SPSS 16.0统计分析软件对数据进行分析。连续变量统计指标用均数±标准差（
±s）表示，对各组资料进行正态性检验和方差齐性检验，若满足正态分布和方差齐性，则各组之间相互比较采用方差分析方法（LSD 检验）；二分类变量统计指标表达为百分比，统计检验方法采用χ2检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 骨髓源EPC体外诱导、培养及扩增结果
新分离的大鼠骨髓单个核细胞呈圆形，大小不一。细胞培养至第 3 天时，可见细胞开始贴壁，由圆形逐渐伸展开，呈长梭形、三角形、纺锤形或不规则形，并呈集落样生长（图1a），此后细胞进入对数生长期，生长旺盛。培养至第 7～8 天时，细胞逐渐成铺路卵石样单层排列，约80%铺满（图1b）。
图1
示培养至不同时相时细胞生长情况（倒置相差显微镜 ×100）
a：第3天时细胞呈长梭形、三角形（绿箭示细胞集落）；b：第7天时细胞呈铺路卵石样单层排列，约80%铺满
2.2 骨髓源EPC的鉴定结果
细胞在培养至第7～8天时，用Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ双阳性鉴定结果（图2）显示，荧光染色双阳性细胞约占细胞总数的98%以上。
图2
Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ双阳性鉴定EPC结果（荧光显微镜 ×200）
a：Dil-Ac-LDL 摄取实验；b：FITC-UEA-Ⅰ结合实验；c：双荧光染色阳性细胞
2.3 不同氧浓度对EPC增殖能力的影响
EPC在不同氧浓度（1%、5%及21%）的培养箱中培养至第3天时，在1%和5%氧浓度下的吸光度值明显高于在21%氧浓度下的（P<0.001、P<0.001），在5%氧浓度下的吸光度值明显高于在1%氧浓度下的（P<0.001）；培养至第7天时，在1%和5%氧浓度下的吸光度值均明显高于在21%氧浓度下的（P<0.001、P<0.001），在1%和5%氧浓度下的吸光度值比较差异无统计学意义（P=0.174）。见表1。
表1
不同氧浓度对EPC增殖能力（吸光度值）的影响（
）
2.4 不同氧浓度对EPC黏附能力的影响
EPC在不同氧浓度（1%、5%及21%）的培养箱中培养至第3天时，在1%和5%氧浓度下的黏附能力均明显强于在21%氧浓度下的（P<0.001、P<0.001），但在1%和5%氧浓度下的黏附能力比较差异无统计学意义（P=0.655）。培养至第7天时，在1%和5%氧浓度下的黏附能力均明显强于在21%氧浓度下的（P<0.001、P<0.001），在1%氧浓度下的黏附能力明显强于在5%氧浓度下的（P=0.017）。见表2。
表2
不同氧浓度对EPC黏附能力（黏附细胞百分比）的影响（%）
2.5 不同氧浓度对EPC迁移能力的影响
EPC在不同氧浓度（1%、5%及21%）的培养箱中培养至第3天和第7天时，在1%和5%氧浓度下的迁移能力均明显强于在21%氧浓度下的（第3天：P<0.001、P<0.001；第7天：P<0.001、P<0.001），在1%氧浓度下的迁移能力明显强于在5%氧浓度下的（第3天：P<0.001；第7天：P<0.001）。见表3。
表3
不同氧浓度对EPC迁移能力（细胞数目）的影响（×103，
）
2.6 不同氧浓度对EPC生存能力的影响
EPC在不同氧浓度（1%、5%及21%）的培养箱中培养至第3天和第7天时，在1%和5%氧浓度下的生存能力明显强于21%氧浓度下的（第3天：P<0.001、P=0.010；第7天：P<0.001、P<0.001），且在1%氧浓度下的生存能力均明显强于在5%氧浓度下（第3天：P=0.020；第7天：P=0.002）。见表4。
表4
不同氧浓度对EPC生存能力（生存细胞百分比）的影响（%）
3 讨论
EPC是一类能增殖并分化为成熟的有功能血管内皮细胞的前体细胞，具有向缺血组织归巢的特性，而且本身就能够在缺血组织中发挥促进血管新生的作用。
EPC促血管新生机制与胚胎发育中血管新生相似，通过自身的增殖、分化而形成新生血管，即出生后的血管发生；EPC本身也可在缺血部位分泌血管内皮生长因子、基质细胞衍生因子-1α、胰岛素样生长因子Ⅰ等生长因子，通过旁分泌方式作用于内皮细胞和其他细胞来促进血管生成过程[11]。从1997年Asahara等[1]成功地从外周循环血中分离出EPC并证明其参与血管新生，随后大量的动物试验显示了EPC在再生医学治疗领域中的巨大潜力，如EPC在冠心病和其他缺血性疾病的血管修复过程中扮演着重要的功能[12-17]，并开始将EPC应用于临床治疗下肢缺血、糖尿病足、冠心病等缺血性疾病并取得了一定的初步疗效，且显示了其治疗的有效性和安全性，如Kawamoto等[18]在2009年进行的多中心临床研究中证实，EPCs可用于治疗下肢慢性严重缺血患者，接受治疗的患者下肢血运得到了显著的改善；Tanaka等[19]在2014年用自体外周血EPC治疗难治性糖尿病足和缺血，也显示出良好的治疗效果，接受EPC移植治疗后的患者下肢疼痛得到显著的改善，足部溃疡面积缩小，且无痛行走距离增加，这种良好的疗效可至少保持2年。以上研究结果提示，在应用干细胞移植治疗缺血性心血管疾病领域，EPC是一个非常合适的候选者。
首都医科大学宣武医院在国内较早开展应用骨髓源或者外周血干细胞移植治疗“无治疗选择”的慢性严重下肢缺血患者[20-22]，至今已有10余年的临床经验，累计达350余例患者，结果显示，自体干细胞移植能够在一定程度上改善慢性重度下肢缺血状况，部分患者的肢体溃疡达到愈合或者面积缩小，避免了截肢或者降低了截肢平面。虽然有部分病例显示出良好的短期结果，但远期疗效并不理想，部分患者仍然避免不了截肢的命运。所以，研究各种方法来增强EPC促血管新生功能是提高其临床疗效的有效途径。
研究干细胞的微环境为我们提供了一个重要的思路。已有国外学者[8]证实无论干细胞存储的环境或其增殖分化的外周组织环境中氧浓度均较自然界大气氧浓度（21%）低，在胚胎发育过程中，胚胎干细胞在受精卵着床以及整个胚胎的发育中一直处于低氧环境中；其他研究[9]证实，不同成体干细胞也生存在一个低氧环境，如间充质干细胞生存氧浓度环境为2%～8%，造血干细胞为1%～6%，神经干细胞为1%～8%，所以当前体外研究大多所采用的21%氧浓度（自然界大气氧浓度）培养环境对于长期生存在较低氧浓度微环境的干细胞来说并非最适合环境。因此，在干细胞（包括EPC）移植前，对其培养环境中的氧浓度进行调整或者进行适当的干预，有可能进一步优化它们的治疗潜能。
Hou等[23]报道低氧可以增强心脏组织干细胞的生存和向心肌组织分化能力；Yu等[24]也报道低氧可以刺激间充质干细胞的迁移能力。在本研究中发现，与21%正常氧浓度相比，低氧浓度培养（1%和5%）能够增强EPC的增殖、黏附、迁移和生存（抗凋亡和死亡）功能，而这些功能是EPC在血管新生过程中几个非常重要的步骤。作为对组织缺血损伤的反应，干细胞（包括EPCs）会从骨髓向外周循环动员和缺血组织归巢，进而发挥其促进血管新生的作用，这一过程包括增殖分化、黏附、迁移等一系列步骤[25]，本研究也为进行更加贴近干细胞生存微环境的血管组织工程研究提供了一定的参考，即我们不仅要构造更加适合干细胞生长的三维微环境[7]，也要重视其氧浓度的调整，因为氧浓度的调整可以改变其增殖、黏附、迁移和生存能力，构造更加适合人体应用的血管组织工程并提高其未来的临床疗效。
本研究结果提示，在应用干细胞（包括EPC）移植治疗缺血性血管疾病时，移植前进行适当的低氧培养（如置入1%到5%氧浓度环境），可以增强其与促进血管新生相关的增殖、黏附、迁移和生存（抗凋亡和死亡）能力。但是不同的低氧浓度和培养时间对增殖、黏附、迁移以及生存能力的影响仍有差别，比如同样是低氧浓度，培养至第3天时，EPC在5%氧浓度的增殖能力明显高于1%氧浓度的增殖能力，而在第7天，两者的增殖能力却无明显差别；对于黏附能力，EPC在1%和5%氧浓度的黏附能力无明显差别，却在培养至第7天时，1%氧浓度时的黏附能力明显强于5%氧浓度；对于迁移和生存能力，不论在第3天还是第7天，EPC在低氧浓度时均比21%正常氧浓度能力强，且氧浓度越低，迁移和生存能力越强（1%氧浓度优于5%氧浓度），这说明氧浓度的变化对干细胞在生长的不同阶段以及生物学特性方面产生复杂的影响，在应用低氧培养研究干细胞时应该结合研究的实际需要从氧浓度和培养时间两个方面进行选择，优化干细胞研究环境，得出更加有临床转化价值的研究结果。
本研究不足之处：由于研究经费所限，我们只设置了1%和5%两个相对低氧浓度环境，之所以选择这两个氧浓度是因为它们更加接近干细胞的生存环境[8-9]，其他氧浓度对EPC功能的影响仍需要进一步的研究来证实；另外，本研究体外低氧培养时间只有1周，更长时间的低氧培养对EPC功能的影响也需要进一步的研究明确，因而最佳的氧浓度和最佳的低氧培养时间仍需要进一步的研究来获得，从而优化当前临床应用干细胞（包括EPC）移植的临床疗效。
内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）是一类能增殖并分化为成熟的有功能的内皮细胞的前体细胞。1997年，EPC被成功地从外周血分离并证明其能够整合进血管新生的“活跃点”[1]，还能够增强缺血组织的侧支血管生长，所以在细胞移植治疗缺血性血管疾病的过程中EPC是一个非常合适的候选者，其目前已成为心血管缺血性疾病的重要靶点[2]。但是已知的动脉硬化相关危险因素对EPC产生负性影响，比如糖尿病、高血脂、吸烟等均会使EPC功能受抑制[3-6]，如何提高受损EPC的功能是目前研究热点。研究干细胞的微环境为我们提供了一个重要的思路，干细胞生存在一个包含多种细胞和分子成分的三维微环境空间里[7]。氧分子是这个微环境中一个非常重要的因子，不仅直接参加细胞的生理代谢，同时也是重要的信号分子，其已被证实多数干细胞（包括EPC）生存在一个相对低氧的微环境里面[8-9]。但当前国内外关于干细胞（包括EPC）的体外研究多采用21%的自然氧浓度培养环境，所提供的培养环境与生物体内微环境显然不同，必然对干细胞的增殖、分化等产生一定的影响，所以只有提供接近体内生存微环境的培养条件，才能够得出更加准确可靠的实验数据，进而提高干细胞移植的临床疗效。本研究设计体外诱导分化、扩增骨髓来源的EPC，在不同氧浓度下进行培养，观察不同氧浓度对骨髓源EPC增殖、黏附、迁移、生存能力等这些与血管新生相关的生物学特性的影响，为提高干细胞移植治疗缺血性心血管疾病的临床疗效提供一定的研究基础。
1 材料与方法
1.1 骨髓源EPC的获取、体外诱导、培养及扩增
SD大鼠，25只，雄性，体质量 200～250 g，北京维通利华实验动物有限公司提供。骨髓源EPC的获取、体外诱导、培养及扩增具体方法参考文献[10]。于大鼠腹腔内注射10%水合氯醛（0.5 mL/100 g）深度麻醉后断头处死，放入75%乙醇内浸泡15 min后剪取股骨和胫骨；离断两端骨骺，用预冷至4 ℃的 PBS 溶液5～10 mL冲洗骨髓腔直至骨变白及冲洗液清亮。应用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，接种于预先用纤维连接蛋白铺底的 25 cm2培养瓶内，培养瓶内加入EBM-2完全培养基，置于37 ℃细胞培养箱中培养，48 h后轻轻换液，弃去未贴壁细胞，以后每隔2 d更换培养液。每天于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，观察7～8 d。
1.2 骨髓源EPC的鉴定
细胞培养至第7～8天时，采用功能鉴定方法，用乙酰化的低密度脂蛋白（Dil-Ac-LDL）和异硫氰酸荧光素-荆豆凝集素-Ⅰ（FITC-UEA-Ⅰ）进行双阳性鉴定。在荧光显微镜下观察细胞，用510 nm激发光激发Dil，用488 nm激发光激发FITC。荧光染色双阳性细胞被认为是正在分化中的EPC。
1.3 检测不同氧浓度对EPC增殖、黏附、迁移和生存能力的影响
将上面鉴定的EPC计数分组并分别置入不同氧浓度（1%、5%及21%）的培养箱中继续培养和观察。于不同氧浓度下培养至第3天和第7天时严格按照细胞增殖实验试剂盒（Molecular Probes Inc.，美国）、细胞黏附实验试剂盒（Molecular Probes Inc.，美国）、细胞迁移实验试剂盒（Platypus Technologies，美国）、细胞凋亡和死亡实验试剂盒（Molecular Probes Inc.，美国）的操作说明对EPC增殖、黏附、迁移和生存（抗凋亡和抗死亡）能力进行测定，结果分别用吸光度值、黏附细胞百分比、迁移细胞数量以及生存细胞百分比表示。① 吸光度值计算：每个氧浓度环境下在培养板上设置 6 个培养孔，每个孔测量 3 次，然后取 6 个培养孔的平均值进行统计分析。② 黏附细胞百分比计算：每个氧浓度环境下，将等量 EPC 置入培养板的培养孔中，立即随机取 10 个高倍镜视野进行计数，取平均值作为分母，然后过 3 h后，PBS液冲洗，再取 10 个高倍镜视野进行黏附的细胞计数，取平均值作为分子，最后计算公式为：黏附细胞百分比=黏附细胞数/总细胞数×100%。③ 迁移细胞数量计算：每个氧浓度环境下在试剂盒提供的培养板上设置 6 个培养孔，每个培养孔计数迁移的细胞数 3 次，然后取 6 个培养孔的平均值进行统计分析。④ 生存细胞百分比计算：每个氧浓度环境下，随机取 10 个视野，生存细胞百分比=生存细胞数/（生存细胞数+死亡细胞数+凋亡细胞数）×100%。
1.4 统计学方法
采用SPSS 16.0统计分析软件对数据进行分析。连续变量统计指标用均数±标准差（
±s）表示，对各组资料进行正态性检验和方差齐性检验，若满足正态分布和方差齐性，则各组之间相互比较采用方差分析方法（LSD 检验）；二分类变量统计指标表达为百分比，统计检验方法采用χ2检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 骨髓源EPC体外诱导、培养及扩增结果
新分离的大鼠骨髓单个核细胞呈圆形，大小不一。细胞培养至第 3 天时，可见细胞开始贴壁，由圆形逐渐伸展开，呈长梭形、三角形、纺锤形或不规则形，并呈集落样生长（图1a），此后细胞进入对数生长期，生长旺盛。培养至第 7～8 天时，细胞逐渐成铺路卵石样单层排列，约80%铺满（图1b）。
图1
示培养至不同时相时细胞生长情况（倒置相差显微镜 ×100）
a：第3天时细胞呈长梭形、三角形（绿箭示细胞集落）；b：第7天时细胞呈铺路卵石样单层排列，约80%铺满
2.2 骨髓源EPC的鉴定结果
细胞在培养至第7～8天时，用Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ双阳性鉴定结果（图2）显示，荧光染色双阳性细胞约占细胞总数的98%以上。
图2
Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ双阳性鉴定EPC结果（荧光显微镜 ×200）
a：Dil-Ac-LDL 摄取实验；b：FITC-UEA-Ⅰ结合实验；c：双荧光染色阳性细胞
2.3 不同氧浓度对EPC增殖能力的影响
EPC在不同氧浓度（1%、5%及21%）的培养箱中培养至第3天时，在1%和5%氧浓度下的吸光度值明显高于在21%氧浓度下的（P<0.001、P<0.001），在5%氧浓度下的吸光度值明显高于在1%氧浓度下的（P<0.001）；培养至第7天时，在1%和5%氧浓度下的吸光度值均明显高于在21%氧浓度下的（P<0.001、P<0.001），在1%和5%氧浓度下的吸光度值比较差异无统计学意义（P=0.174）。见表1。
表1
不同氧浓度对EPC增殖能力（吸光度值）的影响（
）
2.4 不同氧浓度对EPC黏附能力的影响
EPC在不同氧浓度（1%、5%及21%）的培养箱中培养至第3天时，在1%和5%氧浓度下的黏附能力均明显强于在21%氧浓度下的（P<0.001、P<0.001），但在1%和5%氧浓度下的黏附能力比较差异无统计学意义（P=0.655）。培养至第7天时，在1%和5%氧浓度下的黏附能力均明显强于在21%氧浓度下的（P<0.001、P<0.001），在1%氧浓度下的黏附能力明显强于在5%氧浓度下的（P=0.017）。见表2。
表2
不同氧浓度对EPC黏附能力（黏附细胞百分比）的影响（%）
2.5 不同氧浓度对EPC迁移能力的影响
EPC在不同氧浓度（1%、5%及21%）的培养箱中培养至第3天和第7天时，在1%和5%氧浓度下的迁移能力均明显强于在21%氧浓度下的（第3天：P<0.001、P<0.001；第7天：P<0.001、P<0.001），在1%氧浓度下的迁移能力明显强于在5%氧浓度下的（第3天：P<0.001；第7天：P<0.001）。见表3。
表3
不同氧浓度对EPC迁移能力（细胞数目）的影响（×103，
）
2.6 不同氧浓度对EPC生存能力的影响
EPC在不同氧浓度（1%、5%及21%）的培养箱中培养至第3天和第7天时，在1%和5%氧浓度下的生存能力明显强于21%氧浓度下的（第3天：P<0.001、P=0.010；第7天：P<0.001、P<0.001），且在1%氧浓度下的生存能力均明显强于在5%氧浓度下（第3天：P=0.020；第7天：P=0.002）。见表4。
表4
不同氧浓度对EPC生存能力（生存细胞百分比）的影响（%）
3 讨论
EPC是一类能增殖并分化为成熟的有功能血管内皮细胞的前体细胞，具有向缺血组织归巢的特性，而且本身就能够在缺血组织中发挥促进血管新生的作用。
EPC促血管新生机制与胚胎发育中血管新生相似，通过自身的增殖、分化而形成新生血管，即出生后的血管发生；EPC本身也可在缺血部位分泌血管内皮生长因子、基质细胞衍生因子-1α、胰岛素样生长因子Ⅰ等生长因子，通过旁分泌方式作用于内皮细胞和其他细胞来促进血管生成过程[11]。从1997年Asahara等[1]成功地从外周循环血中分离出EPC并证明其参与血管新生，随后大量的动物试验显示了EPC在再生医学治疗领域中的巨大潜力，如EPC在冠心病和其他缺血性疾病的血管修复过程中扮演着重要的功能[12-17]，并开始将EPC应用于临床治疗下肢缺血、糖尿病足、冠心病等缺血性疾病并取得了一定的初步疗效，且显示了其治疗的有效性和安全性，如Kawamoto等[18]在2009年进行的多中心临床研究中证实，EPCs可用于治疗下肢慢性严重缺血患者，接受治疗的患者下肢血运得到了显著的改善；Tanaka等[19]在2014年用自体外周血EPC治疗难治性糖尿病足和缺血，也显示出良好的治疗效果，接受EPC移植治疗后的患者下肢疼痛得到显著的改善，足部溃疡面积缩小，且无痛行走距离增加，这种良好的疗效可至少保持2年。以上研究结果提示，在应用干细胞移植治疗缺血性心血管疾病领域，EPC是一个非常合适的候选者。
首都医科大学宣武医院在国内较早开展应用骨髓源或者外周血干细胞移植治疗“无治疗选择”的慢性严重下肢缺血患者[20-22]，至今已有10余年的临床经验，累计达350余例患者，结果显示，自体干细胞移植能够在一定程度上改善慢性重度下肢缺血状况，部分患者的肢体溃疡达到愈合或者面积缩小，避免了截肢或者降低了截肢平面。虽然有部分病例显示出良好的短期结果，但远期疗效并不理想，部分患者仍然避免不了截肢的命运。所以，研究各种方法来增强EPC促血管新生功能是提高其临床疗效的有效途径。
研究干细胞的微环境为我们提供了一个重要的思路。已有国外学者[8]证实无论干细胞存储的环境或其增殖分化的外周组织环境中氧浓度均较自然界大气氧浓度（21%）低，在胚胎发育过程中，胚胎干细胞在受精卵着床以及整个胚胎的发育中一直处于低氧环境中；其他研究[9]证实，不同成体干细胞也生存在一个低氧环境，如间充质干细胞生存氧浓度环境为2%～8%，造血干细胞为1%～6%，神经干细胞为1%～8%，所以当前体外研究大多所采用的21%氧浓度（自然界大气氧浓度）培养环境对于长期生存在较低氧浓度微环境的干细胞来说并非最适合环境。因此，在干细胞（包括EPC）移植前，对其培养环境中的氧浓度进行调整或者进行适当的干预，有可能进一步优化它们的治疗潜能。
Hou等[23]报道低氧可以增强心脏组织干细胞的生存和向心肌组织分化能力；Yu等[24]也报道低氧可以刺激间充质干细胞的迁移能力。在本研究中发现，与21%正常氧浓度相比，低氧浓度培养（1%和5%）能够增强EPC的增殖、黏附、迁移和生存（抗凋亡和死亡）功能，而这些功能是EPC在血管新生过程中几个非常重要的步骤。作为对组织缺血损伤的反应，干细胞（包括EPCs）会从骨髓向外周循环动员和缺血组织归巢，进而发挥其促进血管新生的作用，这一过程包括增殖分化、黏附、迁移等一系列步骤[25]，本研究也为进行更加贴近干细胞生存微环境的血管组织工程研究提供了一定的参考，即我们不仅要构造更加适合干细胞生长的三维微环境[7]，也要重视其氧浓度的调整，因为氧浓度的调整可以改变其增殖、黏附、迁移和生存能力，构造更加适合人体应用的血管组织工程并提高其未来的临床疗效。
本研究结果提示，在应用干细胞（包括EPC）移植治疗缺血性血管疾病时，移植前进行适当的低氧培养（如置入1%到5%氧浓度环境），可以增强其与促进血管新生相关的增殖、黏附、迁移和生存（抗凋亡和死亡）能力。但是不同的低氧浓度和培养时间对增殖、黏附、迁移以及生存能力的影响仍有差别，比如同样是低氧浓度，培养至第3天时，EPC在5%氧浓度的增殖能力明显高于1%氧浓度的增殖能力，而在第7天，两者的增殖能力却无明显差别；对于黏附能力，EPC在1%和5%氧浓度的黏附能力无明显差别，却在培养至第7天时，1%氧浓度时的黏附能力明显强于5%氧浓度；对于迁移和生存能力，不论在第3天还是第7天，EPC在低氧浓度时均比21%正常氧浓度能力强，且氧浓度越低，迁移和生存能力越强（1%氧浓度优于5%氧浓度），这说明氧浓度的变化对干细胞在生长的不同阶段以及生物学特性方面产生复杂的影响，在应用低氧培养研究干细胞时应该结合研究的实际需要从氧浓度和培养时间两个方面进行选择，优化干细胞研究环境，得出更加有临床转化价值的研究结果。
本研究不足之处：由于研究经费所限，我们只设置了1%和5%两个相对低氧浓度环境，之所以选择这两个氧浓度是因为它们更加接近干细胞的生存环境[8-9]，其他氧浓度对EPC功能的影响仍需要进一步的研究来证实；另外，本研究体外低氧培养时间只有1周，更长时间的低氧培养对EPC功能的影响也需要进一步的研究明确，因而最佳的氧浓度和最佳的低氧培养时间仍需要进一步的研究来获得，从而优化当前临床应用干细胞（包括EPC）移植的临床疗效。
