引用本文： 孙建兵, 吉翔, 汪亚辉, 马凯, 于建平, 李洪涛, 韩晓鹏, 刘宏斌. 循环肿瘤细胞与胃癌患者临床病理特征及预后的关系研究. 中国普外基础与临床杂志, 2019, 26(1): 25-30. doi: 10.7507/1007-9424.201808028 复制
胃癌是全球第 5 大常见的恶性肿瘤，也是全球第 3 大癌症死亡原因[1]；2015 年中国胃癌新发病例约为 67.9 万例，死亡病例约为 49.8 万例[2]。患者被诊断为胃癌时只有 23% 的胃癌患者是局限性的，34% 的病例已经发生转移，32% 的病例已发生淋巴结转移[3]。胃癌发病早期一般多无症状，被确诊时患者多属晚期[4]。早期胃癌患者的 5 年生存率可达 90% 以上，而晚期胃癌患者的 5 年生存率仅为 25%～30%[5-6]。尽管手术、化疗和其他治疗方法在胃癌患者的治疗中不断取得进展，但胃癌患者的预后仍较差，其主要原因是胃癌的复发和转移，故胃癌的早期诊断、早期治疗在提高胃癌患者预后方面起着关键作用。循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是指因自发或诊疗操作过程中由原发灶或转移灶脱落进入外周血液循环系统或者淋巴系统的肿瘤细胞[7-9]。肿瘤的侵袭、转移是在肿瘤微环境中由多种分子参与、通过多种信号通路、涉及肿瘤细胞从原发灶或转移灶脱落、上皮间质转化、细胞外基质降解、浸润穿透基底膜、远处转移等多步骤、多环节的复杂过程。CTCs 的产生在肿瘤的侵袭、转移过程中扮演了重要的角色。CTCs 的检测被美国 FDA 批准用于转移性乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌的临床诊断和疗效评估[10-12]。目前 CTCs 的检测用于胃癌的诊治方面应用较少，本研究旨在通过检测胃癌患者术前清晨空腹外周静脉血中的 CTCs，探讨其与胃癌患者的临床病理特征及预后的关系。
1 资料与方法
1.1 纳入和排除标准
1.1.1 纳入标准
胃癌组：① 符合中华人民共和国卫生部颁布的《中华人民共和国卫生行业标准》（WS316-2010）中的“胃癌诊断标准”[13]的胃癌患者；② 术前未行新辅助化疗及其他任何抗肿瘤治疗；③ 患者不伴有其他器官恶性肿瘤；④ 肿瘤在接受手术时无明确广泛转移且行胃癌 D2 根治手术；⑤ 术后按期进行标准的 FOLFOX6 方案化疗；⑥ 患者病历资料齐全。胃良性病变组：① 同期经病理诊断确诊为胃部良性病变患者（包括溃疡、炎症、出血）；② 既往无恶性肿瘤病史；③ 一般资料如性别和年龄与胃癌组无明显差异的患者。本研究经笔者所在医院伦理委员会批准。
1.1.2 排除标准
① 术后失访的患者；② 术后行放疗、免疫治疗、靶向治疗等可能对研究结果产生影响的情况。
1.2 研究对象
选取就诊于中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院 2015 年 8 月至 2016 年 12 月期间经组织病理学证实为胃癌且行胃癌 D2 根治术的患者 100 例（胃癌组），其中男 67 例，女 33 例；年龄（58±10）岁。选取同时期就诊于笔者所在医院的胃良性病变患者 38 例作为对照（胃良性病变组），其中男 21 例，女 17 例；年龄（59±11）岁。2 组患者在年龄和性别方面比较差异无统计学意义（P>0.050）。所有患者的手术方式、术后病理组织学检查或 TNM 分期均按日本第 15 版《胃癌处理规约》规定施行。
1.3 主要试剂和仪器
试剂：ACD 抗凝采血管购自美国 BD 公司；人外周血白细胞去除试剂盒及人外周血 CTCs 鉴别试剂盒均购自北京莱尔生物医药科技有限公司。仪器：低速大容量离心机购自山海安亭飞鸽公司；原位杂交仪购自赛默飞世尔科技中国有限公司；荧光显微镜购自奥林巴斯中国有限公司；载玻片购自丹麦 DAKO 公司。
1.4 CTCs 的检测方法
抽取患者清晨空腹肘正中静脉血 7 mL，并用 ACD 抗凝剂抗凝，24 h 内采用免疫磁微粒阴性富集法联合免疫荧光原位杂交技术检测 CTCs。
1.4.1 CTCs 的阴性富集
① 取 4 mL 全血标本加入离心管中，用 CS1 缓冲液补充到 45 mL，在室温下离心 5 min（650×g），吸去上清液，留 10 mL 于离心管，轻摇离心管混匀沉淀细胞。② 加 CS2 至 45 mL，将离心管置于室温 8 min，于垂直混匀仪混匀后再离心 5 min（650×g），弃去上清液至 500 μL；轻摇离心管混匀沉淀细胞后补加 CS1 缓冲液至 5 mL。③ 适量的磁微粒（150 μL/人份）混悬液至 2 mL 离心管中，加入 1 mL CS1 缓冲液轻柔吹打混匀，于磁力架上静置 1 min，弃去上清液。重复洗涤 3 次后，用 CS1 重悬磁微粒至 150 μL。将洗涤好的磁微粒保存在试管架上备用。④ 将 ② 中处理好的样本缓慢加入磁微粒，调节摇床摇速至 120 次/分，室温下摇动 20 min。⑤ 先于 5 mL 新的离心管中加入3 mL CS3 缓冲液，将④ 中的所有液体轻轻叠加到 CS3 顶层，离心 5 min（300×g）。⑥ 离心后可见 3 层溶液，轻柔吸取最上面的 2 层溶液，移至 1 个新的 15 mL 离心管中，加入 CS1 缓冲液至 14 mL，轻柔颠倒混匀 3 次后再离心 5 min（950×g），弃上清液至 300 μL，加入 1 mL CS1缓冲液，重悬沉淀细胞。⑦ 将标本转移至新的 2 mL 离心管中，靠于磁力架上 2～3 min，将液体分别转移至新的 15 mL 离心管中，离心 3 min（2 070×g），弃去上清液至 100 μL，加入 100 μL CF1 固定液，充分轻柔吹打混匀 10 次以上，涂片至标本框（免疫组化笔画框）中。
1.4.2 CTCs 的鉴定
免疫荧光原位杂交鉴定：① 预固定：CF2 预固定 8 min；② 老化：37 ℃ 预热的 2×SSC 老化 10 min；③ 脱水：75%、85%、100% 的梯度乙醇脱水，各 2 min；④ 杂交：10 U 探针（CEP17/CEP8），盖片，75 ℃ 变性 5 min，37 ℃ 杂交 1.5 h；⑤ 洗片：43 ℃ 预热的 50% FA 中甩掉盖玻片，并温浴 15 min；⑥ 洗涤：室温 2×SSC 中 5 min，2 次；⑦ 抗体孵育：滴加抗体（CD45），室温孵育 1 h；⑧ 洗片：0.2% 的 BSA 洗标本区 2 次；⑨ 复染：10 μL 0.1% 的 4′6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐（4′6-diamidino-2-phenylindole，dihydrochloride，DAPI），盖片，待荧光显微镜下读片。
1.4.3 CTCs 的阳性结果判定
① DAPI（+）CD45（–）CEP8 多倍体（+）CEP17 二倍体（–）；② DAPI（+）CD45（–）CEP8（–） CEP17（+）；③ DAPI（+）CD45（–）CEP8（+） CEP17（+）。DAPI 标记细胞核呈蓝色，CD45 标记白细胞呈红色，CEP8 标记 8 号染色体着丝粒呈橙色和 CEP17 标记 17 号染色体着丝粒呈绿色，正常细胞均为二倍体。
1.5 肿瘤标志物的检测
胃癌和胃良性病变患者入院后行常规肿瘤标志物 CEA、CA19-9 及 CA125 的检测并收集数据，检测结果以 CEA>6.0 μg/L、CA19-9>27 U/mL、CA125>35 U/mL 判定为高表达。
1.6 随访及预后监测
定期对 100 例胃癌术后患者进行严密的随访，对出院患者每 3 个月进行 1 次门诊或电话随访。术后无瘤生存期为行手术治疗后至疾病复发或末次随访时间（2017 年 12 月 20 日）。时间以月为单位统计，详细记录胃癌患者的一般资料（如性别、年龄）、术后组织病理学资料（如肿瘤部位、浸润深度、分化程度、TNM 分期、淋巴结转移、脉管癌栓）及随访资料（如无进展生存期）。患者复发的判断标准：病理活检结果证实和（或）明确的影像学检查结果证实。
1.7 统计学方法
采用 SPSS 21.0 统计软件对数据进行分析。采用 χ2 检验或 Fisher 确切概率法分析 CTCs 水平与胃癌患者临床病理特征之间的关系。采用受试者工作特征曲线（receiver operating characterisitic curve，ROC）分析 CTCs 的诊断特异度和敏感度。采用 Kaplan-Meier 法分析比较不同 CTCs 水平患者的无进展生存期，采用 log-rank 法检验。检验水准 α=0.050。
2 结果
2.1 CTCs 的阳性鉴定结果
CTCs 阳性鉴定结果为 DAPI（+）CD45（–）CEP8（+） CEP17（–）、DAPI（+）CD45（–）CEP8（–） CEP17（+）、DAPI（+）CD45（–）CEP8 （+） CEP17（+），见图 1a-1c；阴性结果见图 1d。胃癌组患者外周静脉血中共 94 例检出 CTCs；胃良性病变组患者外周静脉血中共 11 例检出 CTCs。
图1
CTCs 的阳性鉴定结果（荧光显微镜 ×400）
a：DAPI（+）CD45（–）CEP8（+）CEP17（–）；b：DAPI（+）CD45（–）CEP8（–）CEP17（+）；c：DAPI（+）CD45（–）CEP8（+）CEP17（+）；d：DAPI（+）CD45（+）CEP8（–）CEP17（–）
2.2 2 组患者空腹外周静脉血中 CTCs 和肿瘤标志物 CEA、CA19-9、CA125 在诊断胃癌中的 ROC 曲线结果
选取最佳临界值 2 个 CTCs/4 mL 血为阳性，此时 CTCs 诊断胃癌的敏感度为 89.0%，特异度为 89.5%，此时的约登指数最大（0.785）。因此，设定 CTCs 截断值为 2 个 CTCs/4 mL 血，将胃癌患者分为高表达组（CTCs≥2 个 CTCs/4 mL 血）和低表达组（CTCs<2 个 CTCs/4 mL 血），结果显示，外周静脉血 CTCs 阳性率在胃癌组为 89.0%（89/100），在胃良性病变组为 10.5%（4/38），胃癌组外周静脉血 CTCs 阳性率明显高于胃良性病变组，差异有统计学意义（P<0.001）。血清标志物 CEA、CA19-9、CA125 在诊断胃癌时的敏感度分别为 23%、30%、10%，特异度分别为 97.4%、92.1%、94.7%；对相应的ROC曲线下面积分别为 0.711 ［95%CI（0.621，0.801）］、0.666 ［95%CI（0.573，0.759）］及0.551 ［95%CI（0.445，0.657）]，CTCs 的ROC曲线下面积为 0.935 ［95%CI（0.894，0.976）］，其诊断胃癌的价值明显优于 CEA、CA19-9 和 CA125，见图 2a。
图2
示 CTCs 及肿瘤标志物 CEA、CA19-9 和 CA-125 诊断胃癌的 ROC 曲线（a）及胃癌患者术前外周静脉血中 CTCs 水平与患者术后无进展生存期的关系（b）
2.3 胃癌患者外周静脉血中 CTCs 水平与患者临床病理特征的关系
胃癌患者外周静脉血中 CTCs 水平与肿瘤浸润深度（χ2=6.945，P=0.017）、淋巴结转移（χ2=5.274，P=0.038）及 TNM 分期（χ2=6.659，P=0.016）有关，而与患者性别、年龄、肿瘤部位、分化程度及有无脉管癌栓无关（P>0.050），见表 1。
表1
胃癌患者外周静脉血中 CTCs 水平与患者临床病理特征的关系（例）
2.4 胃癌患者术前外周静脉血中 CTCs 水平与患者术后无进展生存期的关系
100 例胃癌患者中有 21 例术后复发，复发率为 21.0%，术后复发间隔时间 8～22 个月。Kaplan-Meier 生存分析显示，胃癌患者外周静脉血中 CTCs 低表达者术后无进展生存期显著长于 CTCs 高表达者（χ2=5.172，P=0.023），提示术前外周静脉血中 CTCs 的表达水平与胃癌患者术后肿瘤复发相关，见图 2b。
3 讨论
胃癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均处于较高水平。Chen 等[2]通过对中国国家中央癌症登记处提供的数据，分析了来自 72 个人口癌症登记中心（2009–2011 年）的数据，估计了到 2015 年我国胃癌新发病例将达到 429.2 万例，死亡病例将达到 281.4 万例，且农村地区人群的年龄标准化发病率和死亡率均显著高于城市居民。
胃癌早期的症状多可表现为无明显临床症状，因此，当被确诊时通常处于胃癌的中晚期。诊断时最常见的症状是食欲不振、消化不良、体质量减轻和腹痛，胃食管交界处或胃近端的肿瘤患者也可能出现吞咽困难。早期诊断手段主要依靠内镜、CT、PET-CT、上消化道造影等检查[4]。相对来说，早期胃癌患者经手术及辅助化疗后的预后较中晚期患者预后良好。据文献[14]报道，我国的早期胃癌诊断率不到 10%，而且因国民健康理念及医疗卫生条件不同而各地区的差异较大。所以，早期诊断、早期治疗在提高胃癌患者的预后方面至关重要。
CTCs 的发现及应用为肿瘤的诊断和预后判断提供了一种新的临床依据成为可能。CellSearch 检测系统检测 CTCs 在胃癌患者中的阳性率为 69%[15]；微流控技术检测胃癌患者 CTCs 阳性率为 75%[16]；本研究采用免疫磁微粒阴性富集并免疫荧光原位杂交鉴定 CTCs，避免了肿瘤细胞因发生上皮间质转化导致上皮性的黏蛋白表达缺失而漏检的问题，本研究中胃癌患者外周静脉血中 CTCs 的阳性率为 89.0%，特异度为 89.5%，说明免疫磁微粒阴性富集联合免疫荧光原位杂交技术检测 CTCs，在胃癌的诊断中有较高的敏感度，相对于胃癌患者血清肿瘤标志物 CEA、CA19-9、CA125，CTCs 对胃癌的诊断预测价值更优，但其特异度较血清肿瘤标志物低，因此，在临床中若能将 CTCs 检测联合血清肿瘤标志物检测可能有助于提高胃癌诊断的敏感度和特异度。
有关 CTCs 与胃癌患者临床病理特征关系的研究结论存在争议。有研究[17-18]认为，CTCs 水平与肿瘤组织学分型和远处转移有关，而与 TNM 分期、淋巴结转移等无关；也有研究[19-20]显示，CTCs 水平与胃癌 TNM 分期、淋巴结转移、远处转移均无关。本研究中 CTCs 水平与胃癌患者的肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM 分期有关。分析其原因可能是由于检测技术的差异导致敏感度不同，产生信息偏倚。此外，本研究纳入了 100 例胃癌患者作为研究对象，进行长达 30 个月的专人随访，样本量大，患者信息齐全，随访数据可靠。
有学者[15, 21]认为，CTCs 是判断进展期胃癌无瘤生存期的独立预测指标；本研究中胃癌患者 CTCs 低表达者的无进展生存期显著高于高表达者，提示术前 CTCs 的检测可以预测胃癌患者术后肿瘤复发的风险及预后。
本研究的不足之处在于本研究是一项回顾性研究且样本量较少，可能存在选择偏倚和混杂偏倚；此外，缺少术后及化疗前后患者血清 CTCs 的变化情况，可能导致混杂偏倚。
综上，胃癌患者术前利用免疫磁微粒阴性富集法联合免疫荧光原位杂交技术行 CTCs 检测的敏感度较高，若结合肿瘤血清学标志物检测可能会提高诊断特异度，可作为肿瘤临床分期及患者术后肿瘤复发风险评估的一项预测指标，对临床工作具有一定的指导意义。
胃癌是全球第 5 大常见的恶性肿瘤，也是全球第 3 大癌症死亡原因[1]；2015 年中国胃癌新发病例约为 67.9 万例，死亡病例约为 49.8 万例[2]。患者被诊断为胃癌时只有 23% 的胃癌患者是局限性的，34% 的病例已经发生转移，32% 的病例已发生淋巴结转移[3]。胃癌发病早期一般多无症状，被确诊时患者多属晚期[4]。早期胃癌患者的 5 年生存率可达 90% 以上，而晚期胃癌患者的 5 年生存率仅为 25%～30%[5-6]。尽管手术、化疗和其他治疗方法在胃癌患者的治疗中不断取得进展，但胃癌患者的预后仍较差，其主要原因是胃癌的复发和转移，故胃癌的早期诊断、早期治疗在提高胃癌患者预后方面起着关键作用。循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是指因自发或诊疗操作过程中由原发灶或转移灶脱落进入外周血液循环系统或者淋巴系统的肿瘤细胞[7-9]。肿瘤的侵袭、转移是在肿瘤微环境中由多种分子参与、通过多种信号通路、涉及肿瘤细胞从原发灶或转移灶脱落、上皮间质转化、细胞外基质降解、浸润穿透基底膜、远处转移等多步骤、多环节的复杂过程。CTCs 的产生在肿瘤的侵袭、转移过程中扮演了重要的角色。CTCs 的检测被美国 FDA 批准用于转移性乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌的临床诊断和疗效评估[10-12]。目前 CTCs 的检测用于胃癌的诊治方面应用较少，本研究旨在通过检测胃癌患者术前清晨空腹外周静脉血中的 CTCs，探讨其与胃癌患者的临床病理特征及预后的关系。
1 资料与方法
1.1 纳入和排除标准
1.1.1 纳入标准
胃癌组：① 符合中华人民共和国卫生部颁布的《中华人民共和国卫生行业标准》（WS316-2010）中的“胃癌诊断标准”[13]的胃癌患者；② 术前未行新辅助化疗及其他任何抗肿瘤治疗；③ 患者不伴有其他器官恶性肿瘤；④ 肿瘤在接受手术时无明确广泛转移且行胃癌 D2 根治手术；⑤ 术后按期进行标准的 FOLFOX6 方案化疗；⑥ 患者病历资料齐全。胃良性病变组：① 同期经病理诊断确诊为胃部良性病变患者（包括溃疡、炎症、出血）；② 既往无恶性肿瘤病史；③ 一般资料如性别和年龄与胃癌组无明显差异的患者。本研究经笔者所在医院伦理委员会批准。
1.1.2 排除标准
① 术后失访的患者；② 术后行放疗、免疫治疗、靶向治疗等可能对研究结果产生影响的情况。
1.2 研究对象
选取就诊于中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院 2015 年 8 月至 2016 年 12 月期间经组织病理学证实为胃癌且行胃癌 D2 根治术的患者 100 例（胃癌组），其中男 67 例，女 33 例；年龄（58±10）岁。选取同时期就诊于笔者所在医院的胃良性病变患者 38 例作为对照（胃良性病变组），其中男 21 例，女 17 例；年龄（59±11）岁。2 组患者在年龄和性别方面比较差异无统计学意义（P>0.050）。所有患者的手术方式、术后病理组织学检查或 TNM 分期均按日本第 15 版《胃癌处理规约》规定施行。
1.3 主要试剂和仪器
试剂：ACD 抗凝采血管购自美国 BD 公司；人外周血白细胞去除试剂盒及人外周血 CTCs 鉴别试剂盒均购自北京莱尔生物医药科技有限公司。仪器：低速大容量离心机购自山海安亭飞鸽公司；原位杂交仪购自赛默飞世尔科技中国有限公司；荧光显微镜购自奥林巴斯中国有限公司；载玻片购自丹麦 DAKO 公司。
1.4 CTCs 的检测方法
抽取患者清晨空腹肘正中静脉血 7 mL，并用 ACD 抗凝剂抗凝，24 h 内采用免疫磁微粒阴性富集法联合免疫荧光原位杂交技术检测 CTCs。
1.4.1 CTCs 的阴性富集
① 取 4 mL 全血标本加入离心管中，用 CS1 缓冲液补充到 45 mL，在室温下离心 5 min（650×g），吸去上清液，留 10 mL 于离心管，轻摇离心管混匀沉淀细胞。② 加 CS2 至 45 mL，将离心管置于室温 8 min，于垂直混匀仪混匀后再离心 5 min（650×g），弃去上清液至 500 μL；轻摇离心管混匀沉淀细胞后补加 CS1 缓冲液至 5 mL。③ 适量的磁微粒（150 μL/人份）混悬液至 2 mL 离心管中，加入 1 mL CS1 缓冲液轻柔吹打混匀，于磁力架上静置 1 min，弃去上清液。重复洗涤 3 次后，用 CS1 重悬磁微粒至 150 μL。将洗涤好的磁微粒保存在试管架上备用。④ 将 ② 中处理好的样本缓慢加入磁微粒，调节摇床摇速至 120 次/分，室温下摇动 20 min。⑤ 先于 5 mL 新的离心管中加入3 mL CS3 缓冲液，将④ 中的所有液体轻轻叠加到 CS3 顶层，离心 5 min（300×g）。⑥ 离心后可见 3 层溶液，轻柔吸取最上面的 2 层溶液，移至 1 个新的 15 mL 离心管中，加入 CS1 缓冲液至 14 mL，轻柔颠倒混匀 3 次后再离心 5 min（950×g），弃上清液至 300 μL，加入 1 mL CS1缓冲液，重悬沉淀细胞。⑦ 将标本转移至新的 2 mL 离心管中，靠于磁力架上 2～3 min，将液体分别转移至新的 15 mL 离心管中，离心 3 min（2 070×g），弃去上清液至 100 μL，加入 100 μL CF1 固定液，充分轻柔吹打混匀 10 次以上，涂片至标本框（免疫组化笔画框）中。
1.4.2 CTCs 的鉴定
免疫荧光原位杂交鉴定：① 预固定：CF2 预固定 8 min；② 老化：37 ℃ 预热的 2×SSC 老化 10 min；③ 脱水：75%、85%、100% 的梯度乙醇脱水，各 2 min；④ 杂交：10 U 探针（CEP17/CEP8），盖片，75 ℃ 变性 5 min，37 ℃ 杂交 1.5 h；⑤ 洗片：43 ℃ 预热的 50% FA 中甩掉盖玻片，并温浴 15 min；⑥ 洗涤：室温 2×SSC 中 5 min，2 次；⑦ 抗体孵育：滴加抗体（CD45），室温孵育 1 h；⑧ 洗片：0.2% 的 BSA 洗标本区 2 次；⑨ 复染：10 μL 0.1% 的 4′6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐（4′6-diamidino-2-phenylindole，dihydrochloride，DAPI），盖片，待荧光显微镜下读片。
1.4.3 CTCs 的阳性结果判定
① DAPI（+）CD45（–）CEP8 多倍体（+）CEP17 二倍体（–）；② DAPI（+）CD45（–）CEP8（–） CEP17（+）；③ DAPI（+）CD45（–）CEP8（+） CEP17（+）。DAPI 标记细胞核呈蓝色，CD45 标记白细胞呈红色，CEP8 标记 8 号染色体着丝粒呈橙色和 CEP17 标记 17 号染色体着丝粒呈绿色，正常细胞均为二倍体。
1.5 肿瘤标志物的检测
胃癌和胃良性病变患者入院后行常规肿瘤标志物 CEA、CA19-9 及 CA125 的检测并收集数据，检测结果以 CEA>6.0 μg/L、CA19-9>27 U/mL、CA125>35 U/mL 判定为高表达。
1.6 随访及预后监测
定期对 100 例胃癌术后患者进行严密的随访，对出院患者每 3 个月进行 1 次门诊或电话随访。术后无瘤生存期为行手术治疗后至疾病复发或末次随访时间（2017 年 12 月 20 日）。时间以月为单位统计，详细记录胃癌患者的一般资料（如性别、年龄）、术后组织病理学资料（如肿瘤部位、浸润深度、分化程度、TNM 分期、淋巴结转移、脉管癌栓）及随访资料（如无进展生存期）。患者复发的判断标准：病理活检结果证实和（或）明确的影像学检查结果证实。
1.7 统计学方法
采用 SPSS 21.0 统计软件对数据进行分析。采用 χ2 检验或 Fisher 确切概率法分析 CTCs 水平与胃癌患者临床病理特征之间的关系。采用受试者工作特征曲线（receiver operating characterisitic curve，ROC）分析 CTCs 的诊断特异度和敏感度。采用 Kaplan-Meier 法分析比较不同 CTCs 水平患者的无进展生存期，采用 log-rank 法检验。检验水准 α=0.050。
2 结果
2.1 CTCs 的阳性鉴定结果
CTCs 阳性鉴定结果为 DAPI（+）CD45（–）CEP8（+） CEP17（–）、DAPI（+）CD45（–）CEP8（–） CEP17（+）、DAPI（+）CD45（–）CEP8 （+） CEP17（+），见图 1a-1c；阴性结果见图 1d。胃癌组患者外周静脉血中共 94 例检出 CTCs；胃良性病变组患者外周静脉血中共 11 例检出 CTCs。
图1
CTCs 的阳性鉴定结果（荧光显微镜 ×400）
a：DAPI（+）CD45（–）CEP8（+）CEP17（–）；b：DAPI（+）CD45（–）CEP8（–）CEP17（+）；c：DAPI（+）CD45（–）CEP8（+）CEP17（+）；d：DAPI（+）CD45（+）CEP8（–）CEP17（–）
2.2 2 组患者空腹外周静脉血中 CTCs 和肿瘤标志物 CEA、CA19-9、CA125 在诊断胃癌中的 ROC 曲线结果
选取最佳临界值 2 个 CTCs/4 mL 血为阳性，此时 CTCs 诊断胃癌的敏感度为 89.0%，特异度为 89.5%，此时的约登指数最大（0.785）。因此，设定 CTCs 截断值为 2 个 CTCs/4 mL 血，将胃癌患者分为高表达组（CTCs≥2 个 CTCs/4 mL 血）和低表达组（CTCs<2 个 CTCs/4 mL 血），结果显示，外周静脉血 CTCs 阳性率在胃癌组为 89.0%（89/100），在胃良性病变组为 10.5%（4/38），胃癌组外周静脉血 CTCs 阳性率明显高于胃良性病变组，差异有统计学意义（P<0.001）。血清标志物 CEA、CA19-9、CA125 在诊断胃癌时的敏感度分别为 23%、30%、10%，特异度分别为 97.4%、92.1%、94.7%；对相应的ROC曲线下面积分别为 0.711 ［95%CI（0.621，0.801）］、0.666 ［95%CI（0.573，0.759）］及0.551 ［95%CI（0.445，0.657）]，CTCs 的ROC曲线下面积为 0.935 ［95%CI（0.894，0.976）］，其诊断胃癌的价值明显优于 CEA、CA19-9 和 CA125，见图 2a。
图2
示 CTCs 及肿瘤标志物 CEA、CA19-9 和 CA-125 诊断胃癌的 ROC 曲线（a）及胃癌患者术前外周静脉血中 CTCs 水平与患者术后无进展生存期的关系（b）
2.3 胃癌患者外周静脉血中 CTCs 水平与患者临床病理特征的关系
胃癌患者外周静脉血中 CTCs 水平与肿瘤浸润深度（χ2=6.945，P=0.017）、淋巴结转移（χ2=5.274，P=0.038）及 TNM 分期（χ2=6.659，P=0.016）有关，而与患者性别、年龄、肿瘤部位、分化程度及有无脉管癌栓无关（P>0.050），见表 1。
表1
胃癌患者外周静脉血中 CTCs 水平与患者临床病理特征的关系（例）
2.4 胃癌患者术前外周静脉血中 CTCs 水平与患者术后无进展生存期的关系
100 例胃癌患者中有 21 例术后复发，复发率为 21.0%，术后复发间隔时间 8～22 个月。Kaplan-Meier 生存分析显示，胃癌患者外周静脉血中 CTCs 低表达者术后无进展生存期显著长于 CTCs 高表达者（χ2=5.172，P=0.023），提示术前外周静脉血中 CTCs 的表达水平与胃癌患者术后肿瘤复发相关，见图 2b。
3 讨论
胃癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均处于较高水平。Chen 等[2]通过对中国国家中央癌症登记处提供的数据，分析了来自 72 个人口癌症登记中心（2009–2011 年）的数据，估计了到 2015 年我国胃癌新发病例将达到 429.2 万例，死亡病例将达到 281.4 万例，且农村地区人群的年龄标准化发病率和死亡率均显著高于城市居民。
胃癌早期的症状多可表现为无明显临床症状，因此，当被确诊时通常处于胃癌的中晚期。诊断时最常见的症状是食欲不振、消化不良、体质量减轻和腹痛，胃食管交界处或胃近端的肿瘤患者也可能出现吞咽困难。早期诊断手段主要依靠内镜、CT、PET-CT、上消化道造影等检查[4]。相对来说，早期胃癌患者经手术及辅助化疗后的预后较中晚期患者预后良好。据文献[14]报道，我国的早期胃癌诊断率不到 10%，而且因国民健康理念及医疗卫生条件不同而各地区的差异较大。所以，早期诊断、早期治疗在提高胃癌患者的预后方面至关重要。
CTCs 的发现及应用为肿瘤的诊断和预后判断提供了一种新的临床依据成为可能。CellSearch 检测系统检测 CTCs 在胃癌患者中的阳性率为 69%[15]；微流控技术检测胃癌患者 CTCs 阳性率为 75%[16]；本研究采用免疫磁微粒阴性富集并免疫荧光原位杂交鉴定 CTCs，避免了肿瘤细胞因发生上皮间质转化导致上皮性的黏蛋白表达缺失而漏检的问题，本研究中胃癌患者外周静脉血中 CTCs 的阳性率为 89.0%，特异度为 89.5%，说明免疫磁微粒阴性富集联合免疫荧光原位杂交技术检测 CTCs，在胃癌的诊断中有较高的敏感度，相对于胃癌患者血清肿瘤标志物 CEA、CA19-9、CA125，CTCs 对胃癌的诊断预测价值更优，但其特异度较血清肿瘤标志物低，因此，在临床中若能将 CTCs 检测联合血清肿瘤标志物检测可能有助于提高胃癌诊断的敏感度和特异度。
有关 CTCs 与胃癌患者临床病理特征关系的研究结论存在争议。有研究[17-18]认为，CTCs 水平与肿瘤组织学分型和远处转移有关，而与 TNM 分期、淋巴结转移等无关；也有研究[19-20]显示，CTCs 水平与胃癌 TNM 分期、淋巴结转移、远处转移均无关。本研究中 CTCs 水平与胃癌患者的肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM 分期有关。分析其原因可能是由于检测技术的差异导致敏感度不同，产生信息偏倚。此外，本研究纳入了 100 例胃癌患者作为研究对象，进行长达 30 个月的专人随访，样本量大，患者信息齐全，随访数据可靠。
有学者[15, 21]认为，CTCs 是判断进展期胃癌无瘤生存期的独立预测指标；本研究中胃癌患者 CTCs 低表达者的无进展生存期显著高于高表达者，提示术前 CTCs 的检测可以预测胃癌患者术后肿瘤复发的风险及预后。
本研究的不足之处在于本研究是一项回顾性研究且样本量较少，可能存在选择偏倚和混杂偏倚；此外，缺少术后及化疗前后患者血清 CTCs 的变化情况，可能导致混杂偏倚。
综上，胃癌患者术前利用免疫磁微粒阴性富集法联合免疫荧光原位杂交技术行 CTCs 检测的敏感度较高，若结合肿瘤血清学标志物检测可能会提高诊断特异度，可作为肿瘤临床分期及患者术后肿瘤复发风险评估的一项预测指标，对临床工作具有一定的指导意义。
