引用本文： 张恬莹, 兰涛, 魏玲玲, 冯天航, 黄孝伦. 甲基化在肝纤维化过程中的作用及其机制的研究进展. 中国普外基础与临床杂志, 2019, 26(2): 229-235. doi: 10.7507/1007-9424.201808090 复制
肝纤维化是由于肝脏慢性损伤而引起的细胞外基质过度积累和瘢痕形成，其病理表现为再生肝细胞结节形成。肝纤维化会进一步发展为肝硬变，而肝硬变又会进展成肝功能衰竭和肝癌[1]。由于大多数人类疾病是由环境因素和遗传因素相互作用造成的，肝纤维化过程中也同样存在环境因素与遗传因素共同作用，DNA 和组蛋白修饰、非编码 RNA 的表观遗传机制导致基因的遗传沉默等在其发病机制中起关键作用[2]。肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）是造成肝纤维性化的关键细胞，并且其主要由 DNA 和组蛋白甲基化参与调节，在肝纤维化发生过程中的关键事件是 HSCs 被激活后存储维生素 A 的窦周细胞转化为促纤维化的肌成纤维细胞。笔者现就肝纤维化的发病机制以及近些年来肝纤维化相关的重要 DNA 甲基化和组蛋白甲基化改变及其机制的一些研究进展作一简要介绍。
1 肝纤维化的机制
肝纤维化是慢性损伤的过程，主要由慢性肝炎病毒感染、酒精性肝病、自身免疫性肝病、胆汁淤积、代谢性疾病等引起[3-5]。肝纤维化进一步发展成肝硬变，肝硬变是肝癌极其重要的危险因素，20%～30% 的肝硬变患者会进展为肝细胞癌[6-7]。
肝纤维化的发病机制主要依赖于以下 3 方面的因素：① 肝损伤后，释放大量炎性因子如白细胞介素 6、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、结缔组织生长因子、血小板源性生长因子等负责招募炎性细胞。② HSCs、巨噬细胞、门静脉周围及骨髓源性的成纤维细胞和纤维细胞、凋亡的肝细胞、肝内定居的 Kupffer 细胞等分泌细胞外基质如Ⅰ型胶原蛋白、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）并刺激肝细胞再生，以对损伤的肝组织进行修复[8-9]，其中 HSCs 处于中心地位，超过 80% 的分泌细胞外基质的肌成纤维细胞均来源于 HSCs[10-11]。③ HSCs 在产生细胞外基质的同时分泌对细胞外基质进行降解的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）一族如 MMP-13 及 MMP 抑制因子组织金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of MMP，TIMPs），以调控细胞外基质的分泌量，从而维持动态平衡，肝纤维化的形成正是这种动态平衡的失调[12]。
当前普遍认为，肝纤维化是可逆转的，而进展为肝硬化或恶变为肝癌后则不可逆转。
2 DNA 甲基化在肝纤维化中的作用
2.1 DNA 甲基化
DNA 甲基化是研究最早的一种表观遗传学修饰方式，其是在 DNA 复制完成后的一种酶促反应。在 DNA 甲基化的过程中，DNA 通过在 CpG 的 5′位置加入甲基形成 5-甲基胞嘧啶（5-mC），而 TET 蛋白又可以催化 5-mC 转化为 5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）。
催化甲基转移的 DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）分为 DNMT1、DNMT2 和 DNMT3a/3b，其中 DNMT1 是一种维持性甲基化酶，在细胞分裂过程中识别新 DNA 链上的半甲基化位点并再生出甲基化状态；DNMT2 可与 DNA 上特异位点结合，但具体作用尚不清楚；DNMT3a 和 DNMT3b 是重新甲基化酶，它们使去甲基化的 CpG 位点重新甲基化，即参与 DNA 的从头甲基化[13]。而 TET 蛋白主要起去甲基化作用，但对其机制的研究尚不明确[2]。
甲基-CpG 结合蛋白 2（methyl-CpG binding protein 2，MeCP2）在 HSCs 的活化和转化过程中起着重要的作用，其在肝纤维化中过度表达，与甲基化 DNA 特异性结合，抑制其下游靶基因的转录；过氧化物酶体增殖物激活受体 γ（peroxisome proliferator-activated receptor，PPARγ）也受 MeCP2 表达的影响，通过沉默 MeCP2 表达会导致 PPARγ 表达减少[14]。
2.2 DNA 甲基化基因与肝纤维化
2.2.1 同源性磷酸酶张力蛋白基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome，PTEN）
PTEN 是磷酸酶基因，使用磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸酯即磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）的产物作为其生理底物[15]。PI3K/AKT 和 ERK 信号通路是 PTEN 通过其脂质磷酸酶活性作用的途径之一，该信号通路激活会导致 HSCs 活化，在该过程中涉及许多细胞因子和生长因子如 TGF-β1。TGF-β1 被认为是促使 HSCs 向肌成纤维细胞转化、增加 α-SMA 等活化标志物的表达以及上调胶原蛋白表达的最重要的中介物，若将 HSCs 暴露于 TGF-β1 时会激活 PI3K/AKT 和 ERK 途径[16]，通过抑制 PI3K 活性和 ERK 磷酸化将阻断活化的 HSCs 的细胞增殖和Ⅰ型胶原蛋白表达。在某些情况下 PTEN 能够通过其蛋白酪氨酸磷酸酶活性抑制 ERK 信号传导途径，从而负面调节细胞增殖、黏着斑和细胞迁移[17]。PTEN 功能的丧失可能导致磷脂酰肌醇 3，4，5-三磷酸酯的积累，继而增强 AKT 和 ERK 活性，导致细胞凋亡减少和（或）增加有丝分裂原信号传导，而高甲基化是 PTEN 失活的机制之一，已经在许多恶性肿瘤中得到证实，如 Tao 等[18]和 Takashima 等[19]已经证明 DNMTs 抑制剂 5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine，5-azadC）通过抑制 DNMT 和 AKT/ERK 通路的激活，从而抑制 HSCs 活化，使 PTEN 基因启动子甲基化并恢复 PTEN 基因表达；Bian 等[20]证实，在纤维化的肝脏中 PTEN 表达下调，并最终导致 HSCs 中 ERK 与 AKT 细胞通路被激活，TGF-β1 分泌增多，诱导 HSCs 激活、Ⅰ型胶原蛋白和 α-SMA 分泌增多，从而导致肝纤维化的发生。以上研究结果提示，PTEN 基因在肝纤维化过程中高甲基化，PI3K/AKT 和 ERK 信号通路被激化，从而导致 HSCs 进一步活化。
2.2.2 septin 9（SEPT9）
现在人类已经发现了 13 个 septin 家族成员，编码的蛋白质相对分子质量为 40×103～60×103[21-22]，其中的 SEPT9 是高度保守的 septin 蛋白家族的成员之一，属于 GTP 酶超级家族，是 GTP 结合蛋白，这些 GTP 酶蛋白参与细胞质分裂、细胞内物质转运、细胞周期调控以及细胞凋亡。SEPT9 有 219 kb，可被剪切成多种形式而被熟知。在 SEPT9 的 3′和 5′末端可选择性剪接，5′端可产生 6 种不同的信使 RNA 变异剪接体即 SEPT9_v1、SEPT9_v2、SEPT9_v3、SEPT9_v4、SEPT9_v4*和 SEPT9_v5，3′端也可产生 3 种不同的信使 RNA 即 SV1、SV2 和 SV3[23]。目前研究[24]证实，SEPT9_v1 被发现在许多肿瘤中过表达，包括卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌，而其在这些器官的正常组织中几乎检测不到。SEPT9_v4 和 SEPT9_v4*编码相同的多肽片段，但证实只有 SEPT9_v4*多肽链参与肿瘤发生[25-26]。Septin 相关基因对肿瘤的促癌作用存在争议，不同肿瘤细胞中 SEPT9_v3 的表达水平差异较大，随后的研究证明了 SEPT9_v3 表达的多样性是由于其在恶性肿瘤中的不同 DNA 甲基化状态决定的[27]。近年来，一些基础和临床研究已经提供了人类疾病中 SEPT9 超甲基化状态的证据，如恶性胸腔积液[28]、非侵袭性肺癌[29]、食管鳞状细胞癌[30]、胆管癌[31]、糖尿病[32]。现在也开发了 SEPT9 甲基化测定法应用于血浆，外周血中甲基化的 SEPT9 被验证作为结直肠癌的敏感生物标志物[33-34]，目前可用于欧洲结直肠癌的血基筛查试验中的临床诊断[35]。Wu 等[36]证明在 HSCs 中的 SEPT9 在体内和体外都是超甲基化，SEPT9 的甲基化由 DNMT3a 调节，SEPT9 通过降低 TGF-β1 表达，使肌成纤维细胞中标志物 α-SMA 和Ⅰ型胶原蛋白的表达相应减少，SEPT9 的表达增加可以减轻体外肝纤维化。以上研究结果提示，SEPT9 在正常肝组织中表达，在肝纤维化中超甲基化，可通过减少 TGF-β1 使肝纤维化标志物减少。
2.2.3 patched-1（Ptch1）
Ptch1 蛋白是信号通路的一个组成部分，在控制细胞分化和增殖中发挥重要作用[37-38]。hedgehog（Hh）信号通路在细胞生长分化、动物胚胎发育过程中都起关键作用，且与组织内稳态以及成人器官的肿瘤发生、肿瘤细胞的增殖分化、细胞凋亡、侵袭转移关系密切。Hh 信号通路主要由 Hh 配体蛋白 sonic hedgehog（Shh）、indian hedgehog（Ihh）、desert hedgehog（Dhh）、两个跨膜蛋白受体 patched（Ptch）和 Smoothened（Smo）及下游转录因子神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白（glioma-associated oncogene homolog，GLI）组成。Hh 信号通路各组成部分的突变或异常激活会导致发育缺陷或肿瘤[39]。当 Hh 蛋白不存在时，Ptch1 可抑制 Smo 的活性，下游基因的转录表达受到抑制。当 Hh 蛋白与 Ptch1 结合时，Ptch1 对 Smo 的抑制作用被解除，Smo 被激活，进入胞质，将信号下传，激活转录因子（GLI1、GLI2、GLI3），GLI 进入细胞核，直接启动 Ptch、Wnt、表皮生长因子等目的基因的表达[40]。Choi 等[41]报道了 Hh 途径活化会导致 HSCs 激活；Yang 等[42]报道了 Ptch1 在肝纤维化中高甲基化，Pcth1 通过影响 GLI1 和 Smad3 信号机制影响 HSCs 活化。Smad3 和 GLI1 会促进 TGF-β1分泌，Ⅰ型胶原蛋白和 α-SMA 分泌增多。以上研究结果提示，Hh 信号通路与 HSCs 的活化相关，在肝纤维化过程中该通路激化，Ptch1 与 Hh 配体蛋白结合，最终导致 GLI1 进入细胞核，促进 TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白和 α-SMA 分泌增多。
2.2.4 Smad
Smad 蛋白是一类转录协调子，必须与其他 DNA 结合蛋白相互作用才能调节靶基因的转录，其分属于 3 类：第 1 类是膜受体激活的 Smad，有 MARK 磷酸化位点（包括 Smad1、Smad2、Smad3、Smad5 及 Smad8 亚型）；第 2 类是通用的 Smad（目前只有 Smad4）；第 3 类可称为抑制性 Smad（包括 Smad6、Smad7）。它们是 TGF-β 信号传导途径中的抑制因子，C 端功能区缺乏磷酸。HSCs 的活化是一个级联反应过程[43]，体现在两方面：① 在 TGF-β/Smad 通路中，TGF-β 是启动因子。TGF-β/活动素连续激活 TGF-β 超家族受体 Ⅰ、Ⅱ，TGF-β 超家族受体Ⅰ使细胞内质-核信号分子 Smad2/3 磷酸化，导致这些蛋白质活化并转移到细胞核[22]。Smad7 可抑制 Smad2 和 Smad3 受体调节的磷酸化作用，它们主要通过竞争性地与 TGF-β 超家族受体Ⅰ结合而抑制受体激活膜受体激活的 Smad 的磷酸化作用；Smad7 沉默可以来自表观遗传修饰，包括 DNA甲基化、组蛋白修饰或 microRNA[44-45]。② TGF-β 通过诱导 HSCs 合成 TIMPs 而抑制 MMPs 的表达和活性，从而抑制细胞外基质的降解。TGF-β/Smad 通路中为疾病治疗提供了作用点。Yang 等[42]的研究结果揭示了 Ptch1 在肝纤维化中为高表达，其在 Smad3 信号传导中起抑制作用。Latella 等[46]通过使用 Smad3 敲除小鼠进行的研究证明，所述 Smad3 敲除小鼠被保护免受二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化。Bian 等[47]证明通过抑制 DNMT1 抑制了 TGF-β1，从而减少了 Smad2 和 Smad3 的磷酸化，也导致了 Smad7 表达的增加。在肝纤维化中 Smad7 处于高甲基化，TGF-β/Smad 通路中 Smad2 和 Smad3 磷酸化，导致 TGF-β1 表达增加，合成 TIMPs 而抑制 MMPs 的表达和活性。以上研究结果提示，Smad2 和 Smad3 促进肝纤维化，Smad7 可抑制肝纤维化发生，但在肝纤维化过程中 Smad7 处于高甲基化，TGF-β/Smad 通路中 Smad2 和 Smad3 磷酸化，导致 HSCs 的激活。
2.2.5 分泌型焦磷酸蛋白 1（secreted phosphoprotein 1，Spp 1）
Spp1 是一种具有多种功能的分泌型酸性糖蛋白，其可由许多细胞如微血管内皮细胞、成纤维细胞、炎症细胞、肌细胞产生[48]。Spp1 具有多种生物学功能，包括细胞黏附、信号转导等[49]。Spp1 主要参与以下 3 条通路：① Spp1 可通过整合素调节核因子-κB 通路中激酶的磷酸化作用，导致 IκB 的磷酸化[50-51]。② Spp1 与 CD44 结合可以通过 PI3K/AKT 通路的激活促进细胞存活，PI3K/AKT 通路可增加 Spp1 的表达，一项基因谱的研究[52]结果表明，Spp1 是 PI3K/AKT 通路的下游效应器并可被 PTEN 所拮抗。③ 细胞内 Spp1 与髓样分化因子 88 和 Toll 样受体 9 复合体共同位于细胞膜附近，可以激活转录因子干扰素调节因子 7 的核转运进一步诱导干扰素 α 的产生[53]。在早期肝纤维化中，Spp1 增强子低甲基化，Spp1 表达上调。在 Spp1 基因敲除小鼠的研究[54-55]中表明，Spp1 在肝损伤和纤维化的进展中起重要作用。Spp1 是由 Kupffer 细胞产生的关键细胞因子或趋化因子，是肝损伤导致的炎症反应[56]。Komatsu 等[57]对 CCl4 诱导的肝纤维化大鼠肝组织的 DNA 甲基化进行了分析，发现 Spp1 出现了低甲基化的状态，PI3K/AKT 通路激活，TGF-β1 分泌增多，诱导 HSCs 激活，细胞外基质Ⅰ型胶原蛋白和 α-SMA 分泌也增多，导致肝纤维化的发生；Spp1 在肝癌中也表达增多。以上研究结果提示，肝纤维化过程中 PI3K/AKT 通路激活，Spp1 低甲基化且表达增加，使 TGF-β1 分泌增多，HSCs 激活，进一步加重肝纤维化。
2.2.6 Ras 三磷酸鸟苷酶激活样蛋白-1（Ras GTPase activating-like protein 1，RASAL1）
RASAL1 基因是一种 RAS GTPase 活化蛋白，与一类被称为鸟苷酸交换因子的蛋白可共同调节 Ras 通路的“开”与“关”。Ras 蛋白有 Ras-GTP（有活性）与 Ras-GDP（无活性）两种结构形式，RASAL1 基因编码的蛋白在 RAS-GTP 与 RAS-GDP 的结构转换中起着重要的调控作用。RASAL1 基因启动子区域高度甲基化可导致 RASAL1 基因的沉默，从而使 RAS-GTP 活性减弱，继而导致 RASAL1 活性下调，RASAL1 在结直肠癌、肝癌等多种肿瘤中表达下调，被认为是候选抑癌基因。RAS-RAF-MEK-ERK 信号传导通路活性异常与多种肿瘤的发生、发展密切相关，其中 RAS 分子是这条信号通路的关键枢纽分子。有研究[58]提示了 Ras 信号在肝纤维化中的重要作用。Tao 等[18]研究表明，RASAL1 基因在肝纤维化中高甲基化，RAS-RAF-MEK-ERK 通路激活，导致 HSCs 活化，而 MeCP2 基因的沉默可增加 RASAL1 的表达。以上研究结果提示，RASAL1 在肝纤维化处于无活性状态，使 RAS-RAF-MEK-ERK 通路激活，导致 HSCs 活化。
3 组蛋白甲基化在肝纤维化中的作用
3.1 组蛋白甲基化
组蛋白八聚体由 H2A、H2B 与 H3、H4 各两分子组成，147 bp 的 DNA 围绕组蛋白八聚体外形成核小体。核小体是最基本的染色体结构。组蛋白甲基化修饰（一种翻译后修饰）通常发生在核小体中 H3 和 H4 组蛋白 N 端的赖氨酸或精氨酸残基上，组蛋白甲基转移酶能够在其残基上添加 1、2 或 3 个甲基，根据残基上甲基化基团的数量分为单甲基化、二甲基化或三甲基化。赖氨酸甲基化通常发生在 H3 赖氨酸 4（H3K4）、9（H3K9）、27（H3K27）、36（H3K36）、79（H3K79）和 H4 赖氨酸 20（H4K20）中，精氨酸甲基化通常发生在 H3 精氨酸 2（H3R2）、8（H3R8）、17（H3R17）、26（H3R26）和 H4 精氨酸 3（H4R3）中[59]。对基因转录的影响取决于共价修饰的特定位点，如 H3K4 三甲基化导致基因转录活化，而 H3K9 或 H3K27 导致基因转录沉默[60-62]。在 HSCs 的激活过程中伴随着涉及甲基转移至 H3K27 和 H3K4，甲基转移酶 EZH2 调节 H3K27 甲基化使其沉默，而甲基转移酶 ASH1 调节 H3K4 甲基化使其活化。EZH2 是通过靶向 PPARγ 介导 H3K27 甲基化的，而 ASH1 直接绑定于活化 HSCs 中的α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白、TIMP-1、TGF-β1 所在区域。ASH1 消失会极大地抑制纤维化基因的表达，MeCP2 可正调控 ASH1 表达，提出 MeCP2 作为表观遗传学调控通路中的一个关键的转录活性成分共同调节多个纤维化相关基因的表达[63]。有研究[64]发现，组蛋白甲基转移酶抑制剂 3-deazaneplano-A（DZNep）可抑制多种组蛋白甲基化修饰，从而抑制肝纤维化的进展。近几年也有不少与组蛋白甲基化修饰相关的基因的研究。
3.2 组蛋白甲基化相关因子与肝纤维化
3.2.1 缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）
HIF-1 是由氧敏感性 α 亚基（HIF-1α）和组成性 β 亚基（HIF-1β）组成的异二聚体转录因子，通过在缺氧条件下调节必需基因的表达来促进细胞存活[65]。HIF-1 通过调节自噬以激活 HSCs[66-67]。缺氧可抑制细胞中 H3K4 三甲基化组蛋白甲基化修饰[68]。Deng 等[67]在缺氧诱导的 LX-2 细胞中研究发现，HIF-1α 分子的核运输、自噬和 HSCs 活化明显受到抑制，是由于缺氧条件下 H3K4 三甲基化组蛋白甲基化被 DZNep 抑制，结果提示，组蛋白甲基化修饰在 HIF-1 信号级联中起重要作用以调节细胞活性。Hong 等[69]研究组蛋白 H3K4 甲基化修饰在 HSCs 活化中起关键作用，抑制组蛋白 H3K4 三甲基化修饰影响 HIF-1 核运输，最终影响自噬和 HSCs 的激活。以上研究结果提示，H3K4 的三甲基化会影响 HIF-1 核运输和自噬，进而影响 HSCs 的活化。
3.2.2 Dickkopf-1（Dkk-1）
Dickkopf 家族（Dkk）由 4 个成员（Dkk-1－Dkk-4）组成，充当 Wnt 信号通路的抑制剂，其中 Dkk-1（Wnt/β-catenin 信号传导的抑制剂）过表达能够抑制原代培养的 HSCs[70]。研究[71]表明，在肝纤维化进展过程中，HSCs 中 Wnt 信号通路被激活且诱导此通路的一些下游元件。Hussain 等[72]和 Yang 等[73]均报道，EZH2 通过 H3K27 的三甲基化抑制 Dkk-1 表达，从而激活 Wnt/β-catenin 途径使 HSCs 活化。以上研究结果提示，H3K27 的三甲基化会抑制 Dkk-1 的表达，使 Wnt/β-catenin 信号通路激活，从而使 HSCs 活化。
3.2.3 心肌素相关转录因子-A（myocardin related transcription factor-A，MRTF-A）
MRTF-A 是转录调控激活辅助因子，其通过与组蛋白甲基转移酶复合物 SET1/COMPASS 相互作用而增强 HSCs 活化[74]。SET1/COMPASS 复合物是一个由 8 个蛋白亚基组成的相对分子质量为 380×103的甲基转移酶复合物，它能够催化组蛋白 H3K4 位点发生单甲基化、二甲基化及三甲基化[75]。Tian 等[76]研究发现，MRTF-A 减少会影响 SET1/COMPASS 复合物亚基与组蛋白甲基转移酶的结合，从而减轻 TGF-β 诱导的促纤维化转录。以上研究结果提示，MRTF-A 是通过表观遗传学中组蛋白甲基化转移酶与 SET1/COMPASS 的作用调节 HSCs 中 TGF-β 信号通路来调节肝纤维化的。
4 小结与展望
甲基化通过改变基因的表观遗传学从而影响基因的表达，引起肝纤维化中不同途径的级联反应，由此我们可以通过对甲基化在肝脏疾病中的作用及机制进行系统而深入的研究，为肝脏疾病的治疗提供新的方向。从目前的研究看，DNMTs 抑制剂（5-azadC）可以通过抑制 DNA 甲基化而抑制 HSCs 的持续活化，其正在进行Ⅱ期测试试验中；DZNep 也在用于抑制肝纤维化的进展；另有研究也在用甲基化级联反应的某个位点作为潜在的靶点来治疗肝纤维化。
肝纤维化是由于肝脏慢性损伤而引起的细胞外基质过度积累和瘢痕形成，其病理表现为再生肝细胞结节形成。肝纤维化会进一步发展为肝硬变，而肝硬变又会进展成肝功能衰竭和肝癌[1]。由于大多数人类疾病是由环境因素和遗传因素相互作用造成的，肝纤维化过程中也同样存在环境因素与遗传因素共同作用，DNA 和组蛋白修饰、非编码 RNA 的表观遗传机制导致基因的遗传沉默等在其发病机制中起关键作用[2]。肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）是造成肝纤维性化的关键细胞，并且其主要由 DNA 和组蛋白甲基化参与调节，在肝纤维化发生过程中的关键事件是 HSCs 被激活后存储维生素 A 的窦周细胞转化为促纤维化的肌成纤维细胞。笔者现就肝纤维化的发病机制以及近些年来肝纤维化相关的重要 DNA 甲基化和组蛋白甲基化改变及其机制的一些研究进展作一简要介绍。
1 肝纤维化的机制
肝纤维化是慢性损伤的过程，主要由慢性肝炎病毒感染、酒精性肝病、自身免疫性肝病、胆汁淤积、代谢性疾病等引起[3-5]。肝纤维化进一步发展成肝硬变，肝硬变是肝癌极其重要的危险因素，20%～30% 的肝硬变患者会进展为肝细胞癌[6-7]。
肝纤维化的发病机制主要依赖于以下 3 方面的因素：① 肝损伤后，释放大量炎性因子如白细胞介素 6、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、结缔组织生长因子、血小板源性生长因子等负责招募炎性细胞。② HSCs、巨噬细胞、门静脉周围及骨髓源性的成纤维细胞和纤维细胞、凋亡的肝细胞、肝内定居的 Kupffer 细胞等分泌细胞外基质如Ⅰ型胶原蛋白、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）并刺激肝细胞再生，以对损伤的肝组织进行修复[8-9]，其中 HSCs 处于中心地位，超过 80% 的分泌细胞外基质的肌成纤维细胞均来源于 HSCs[10-11]。③ HSCs 在产生细胞外基质的同时分泌对细胞外基质进行降解的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）一族如 MMP-13 及 MMP 抑制因子组织金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of MMP，TIMPs），以调控细胞外基质的分泌量，从而维持动态平衡，肝纤维化的形成正是这种动态平衡的失调[12]。
当前普遍认为，肝纤维化是可逆转的，而进展为肝硬化或恶变为肝癌后则不可逆转。
2 DNA 甲基化在肝纤维化中的作用
2.1 DNA 甲基化
DNA 甲基化是研究最早的一种表观遗传学修饰方式，其是在 DNA 复制完成后的一种酶促反应。在 DNA 甲基化的过程中，DNA 通过在 CpG 的 5′位置加入甲基形成 5-甲基胞嘧啶（5-mC），而 TET 蛋白又可以催化 5-mC 转化为 5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）。
催化甲基转移的 DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）分为 DNMT1、DNMT2 和 DNMT3a/3b，其中 DNMT1 是一种维持性甲基化酶，在细胞分裂过程中识别新 DNA 链上的半甲基化位点并再生出甲基化状态；DNMT2 可与 DNA 上特异位点结合，但具体作用尚不清楚；DNMT3a 和 DNMT3b 是重新甲基化酶，它们使去甲基化的 CpG 位点重新甲基化，即参与 DNA 的从头甲基化[13]。而 TET 蛋白主要起去甲基化作用，但对其机制的研究尚不明确[2]。
甲基-CpG 结合蛋白 2（methyl-CpG binding protein 2，MeCP2）在 HSCs 的活化和转化过程中起着重要的作用，其在肝纤维化中过度表达，与甲基化 DNA 特异性结合，抑制其下游靶基因的转录；过氧化物酶体增殖物激活受体 γ（peroxisome proliferator-activated receptor，PPARγ）也受 MeCP2 表达的影响，通过沉默 MeCP2 表达会导致 PPARγ 表达减少[14]。
2.2 DNA 甲基化基因与肝纤维化
2.2.1 同源性磷酸酶张力蛋白基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome，PTEN）
PTEN 是磷酸酶基因，使用磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸酯即磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）的产物作为其生理底物[15]。PI3K/AKT 和 ERK 信号通路是 PTEN 通过其脂质磷酸酶活性作用的途径之一，该信号通路激活会导致 HSCs 活化，在该过程中涉及许多细胞因子和生长因子如 TGF-β1。TGF-β1 被认为是促使 HSCs 向肌成纤维细胞转化、增加 α-SMA 等活化标志物的表达以及上调胶原蛋白表达的最重要的中介物，若将 HSCs 暴露于 TGF-β1 时会激活 PI3K/AKT 和 ERK 途径[16]，通过抑制 PI3K 活性和 ERK 磷酸化将阻断活化的 HSCs 的细胞增殖和Ⅰ型胶原蛋白表达。在某些情况下 PTEN 能够通过其蛋白酪氨酸磷酸酶活性抑制 ERK 信号传导途径，从而负面调节细胞增殖、黏着斑和细胞迁移[17]。PTEN 功能的丧失可能导致磷脂酰肌醇 3，4，5-三磷酸酯的积累，继而增强 AKT 和 ERK 活性，导致细胞凋亡减少和（或）增加有丝分裂原信号传导，而高甲基化是 PTEN 失活的机制之一，已经在许多恶性肿瘤中得到证实，如 Tao 等[18]和 Takashima 等[19]已经证明 DNMTs 抑制剂 5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine，5-azadC）通过抑制 DNMT 和 AKT/ERK 通路的激活，从而抑制 HSCs 活化，使 PTEN 基因启动子甲基化并恢复 PTEN 基因表达；Bian 等[20]证实，在纤维化的肝脏中 PTEN 表达下调，并最终导致 HSCs 中 ERK 与 AKT 细胞通路被激活，TGF-β1 分泌增多，诱导 HSCs 激活、Ⅰ型胶原蛋白和 α-SMA 分泌增多，从而导致肝纤维化的发生。以上研究结果提示，PTEN 基因在肝纤维化过程中高甲基化，PI3K/AKT 和 ERK 信号通路被激化，从而导致 HSCs 进一步活化。
2.2.2 septin 9（SEPT9）
现在人类已经发现了 13 个 septin 家族成员，编码的蛋白质相对分子质量为 40×103～60×103[21-22]，其中的 SEPT9 是高度保守的 septin 蛋白家族的成员之一，属于 GTP 酶超级家族，是 GTP 结合蛋白，这些 GTP 酶蛋白参与细胞质分裂、细胞内物质转运、细胞周期调控以及细胞凋亡。SEPT9 有 219 kb，可被剪切成多种形式而被熟知。在 SEPT9 的 3′和 5′末端可选择性剪接，5′端可产生 6 种不同的信使 RNA 变异剪接体即 SEPT9_v1、SEPT9_v2、SEPT9_v3、SEPT9_v4、SEPT9_v4*和 SEPT9_v5，3′端也可产生 3 种不同的信使 RNA 即 SV1、SV2 和 SV3[23]。目前研究[24]证实，SEPT9_v1 被发现在许多肿瘤中过表达，包括卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌，而其在这些器官的正常组织中几乎检测不到。SEPT9_v4 和 SEPT9_v4*编码相同的多肽片段，但证实只有 SEPT9_v4*多肽链参与肿瘤发生[25-26]。Septin 相关基因对肿瘤的促癌作用存在争议，不同肿瘤细胞中 SEPT9_v3 的表达水平差异较大，随后的研究证明了 SEPT9_v3 表达的多样性是由于其在恶性肿瘤中的不同 DNA 甲基化状态决定的[27]。近年来，一些基础和临床研究已经提供了人类疾病中 SEPT9 超甲基化状态的证据，如恶性胸腔积液[28]、非侵袭性肺癌[29]、食管鳞状细胞癌[30]、胆管癌[31]、糖尿病[32]。现在也开发了 SEPT9 甲基化测定法应用于血浆，外周血中甲基化的 SEPT9 被验证作为结直肠癌的敏感生物标志物[33-34]，目前可用于欧洲结直肠癌的血基筛查试验中的临床诊断[35]。Wu 等[36]证明在 HSCs 中的 SEPT9 在体内和体外都是超甲基化，SEPT9 的甲基化由 DNMT3a 调节，SEPT9 通过降低 TGF-β1 表达，使肌成纤维细胞中标志物 α-SMA 和Ⅰ型胶原蛋白的表达相应减少，SEPT9 的表达增加可以减轻体外肝纤维化。以上研究结果提示，SEPT9 在正常肝组织中表达，在肝纤维化中超甲基化，可通过减少 TGF-β1 使肝纤维化标志物减少。
2.2.3 patched-1（Ptch1）
Ptch1 蛋白是信号通路的一个组成部分，在控制细胞分化和增殖中发挥重要作用[37-38]。hedgehog（Hh）信号通路在细胞生长分化、动物胚胎发育过程中都起关键作用，且与组织内稳态以及成人器官的肿瘤发生、肿瘤细胞的增殖分化、细胞凋亡、侵袭转移关系密切。Hh 信号通路主要由 Hh 配体蛋白 sonic hedgehog（Shh）、indian hedgehog（Ihh）、desert hedgehog（Dhh）、两个跨膜蛋白受体 patched（Ptch）和 Smoothened（Smo）及下游转录因子神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白（glioma-associated oncogene homolog，GLI）组成。Hh 信号通路各组成部分的突变或异常激活会导致发育缺陷或肿瘤[39]。当 Hh 蛋白不存在时，Ptch1 可抑制 Smo 的活性，下游基因的转录表达受到抑制。当 Hh 蛋白与 Ptch1 结合时，Ptch1 对 Smo 的抑制作用被解除，Smo 被激活，进入胞质，将信号下传，激活转录因子（GLI1、GLI2、GLI3），GLI 进入细胞核，直接启动 Ptch、Wnt、表皮生长因子等目的基因的表达[40]。Choi 等[41]报道了 Hh 途径活化会导致 HSCs 激活；Yang 等[42]报道了 Ptch1 在肝纤维化中高甲基化，Pcth1 通过影响 GLI1 和 Smad3 信号机制影响 HSCs 活化。Smad3 和 GLI1 会促进 TGF-β1分泌，Ⅰ型胶原蛋白和 α-SMA 分泌增多。以上研究结果提示，Hh 信号通路与 HSCs 的活化相关，在肝纤维化过程中该通路激化，Ptch1 与 Hh 配体蛋白结合，最终导致 GLI1 进入细胞核，促进 TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白和 α-SMA 分泌增多。
2.2.4 Smad
Smad 蛋白是一类转录协调子，必须与其他 DNA 结合蛋白相互作用才能调节靶基因的转录，其分属于 3 类：第 1 类是膜受体激活的 Smad，有 MARK 磷酸化位点（包括 Smad1、Smad2、Smad3、Smad5 及 Smad8 亚型）；第 2 类是通用的 Smad（目前只有 Smad4）；第 3 类可称为抑制性 Smad（包括 Smad6、Smad7）。它们是 TGF-β 信号传导途径中的抑制因子，C 端功能区缺乏磷酸。HSCs 的活化是一个级联反应过程[43]，体现在两方面：① 在 TGF-β/Smad 通路中，TGF-β 是启动因子。TGF-β/活动素连续激活 TGF-β 超家族受体 Ⅰ、Ⅱ，TGF-β 超家族受体Ⅰ使细胞内质-核信号分子 Smad2/3 磷酸化，导致这些蛋白质活化并转移到细胞核[22]。Smad7 可抑制 Smad2 和 Smad3 受体调节的磷酸化作用，它们主要通过竞争性地与 TGF-β 超家族受体Ⅰ结合而抑制受体激活膜受体激活的 Smad 的磷酸化作用；Smad7 沉默可以来自表观遗传修饰，包括 DNA甲基化、组蛋白修饰或 microRNA[44-45]。② TGF-β 通过诱导 HSCs 合成 TIMPs 而抑制 MMPs 的表达和活性，从而抑制细胞外基质的降解。TGF-β/Smad 通路中为疾病治疗提供了作用点。Yang 等[42]的研究结果揭示了 Ptch1 在肝纤维化中为高表达，其在 Smad3 信号传导中起抑制作用。Latella 等[46]通过使用 Smad3 敲除小鼠进行的研究证明，所述 Smad3 敲除小鼠被保护免受二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化。Bian 等[47]证明通过抑制 DNMT1 抑制了 TGF-β1，从而减少了 Smad2 和 Smad3 的磷酸化，也导致了 Smad7 表达的增加。在肝纤维化中 Smad7 处于高甲基化，TGF-β/Smad 通路中 Smad2 和 Smad3 磷酸化，导致 TGF-β1 表达增加，合成 TIMPs 而抑制 MMPs 的表达和活性。以上研究结果提示，Smad2 和 Smad3 促进肝纤维化，Smad7 可抑制肝纤维化发生，但在肝纤维化过程中 Smad7 处于高甲基化，TGF-β/Smad 通路中 Smad2 和 Smad3 磷酸化，导致 HSCs 的激活。
2.2.5 分泌型焦磷酸蛋白 1（secreted phosphoprotein 1，Spp 1）
Spp1 是一种具有多种功能的分泌型酸性糖蛋白，其可由许多细胞如微血管内皮细胞、成纤维细胞、炎症细胞、肌细胞产生[48]。Spp1 具有多种生物学功能，包括细胞黏附、信号转导等[49]。Spp1 主要参与以下 3 条通路：① Spp1 可通过整合素调节核因子-κB 通路中激酶的磷酸化作用，导致 IκB 的磷酸化[50-51]。② Spp1 与 CD44 结合可以通过 PI3K/AKT 通路的激活促进细胞存活，PI3K/AKT 通路可增加 Spp1 的表达，一项基因谱的研究[52]结果表明，Spp1 是 PI3K/AKT 通路的下游效应器并可被 PTEN 所拮抗。③ 细胞内 Spp1 与髓样分化因子 88 和 Toll 样受体 9 复合体共同位于细胞膜附近，可以激活转录因子干扰素调节因子 7 的核转运进一步诱导干扰素 α 的产生[53]。在早期肝纤维化中，Spp1 增强子低甲基化，Spp1 表达上调。在 Spp1 基因敲除小鼠的研究[54-55]中表明，Spp1 在肝损伤和纤维化的进展中起重要作用。Spp1 是由 Kupffer 细胞产生的关键细胞因子或趋化因子，是肝损伤导致的炎症反应[56]。Komatsu 等[57]对 CCl4 诱导的肝纤维化大鼠肝组织的 DNA 甲基化进行了分析，发现 Spp1 出现了低甲基化的状态，PI3K/AKT 通路激活，TGF-β1 分泌增多，诱导 HSCs 激活，细胞外基质Ⅰ型胶原蛋白和 α-SMA 分泌也增多，导致肝纤维化的发生；Spp1 在肝癌中也表达增多。以上研究结果提示，肝纤维化过程中 PI3K/AKT 通路激活，Spp1 低甲基化且表达增加，使 TGF-β1 分泌增多，HSCs 激活，进一步加重肝纤维化。
2.2.6 Ras 三磷酸鸟苷酶激活样蛋白-1（Ras GTPase activating-like protein 1，RASAL1）
RASAL1 基因是一种 RAS GTPase 活化蛋白，与一类被称为鸟苷酸交换因子的蛋白可共同调节 Ras 通路的“开”与“关”。Ras 蛋白有 Ras-GTP（有活性）与 Ras-GDP（无活性）两种结构形式，RASAL1 基因编码的蛋白在 RAS-GTP 与 RAS-GDP 的结构转换中起着重要的调控作用。RASAL1 基因启动子区域高度甲基化可导致 RASAL1 基因的沉默，从而使 RAS-GTP 活性减弱，继而导致 RASAL1 活性下调，RASAL1 在结直肠癌、肝癌等多种肿瘤中表达下调，被认为是候选抑癌基因。RAS-RAF-MEK-ERK 信号传导通路活性异常与多种肿瘤的发生、发展密切相关，其中 RAS 分子是这条信号通路的关键枢纽分子。有研究[58]提示了 Ras 信号在肝纤维化中的重要作用。Tao 等[18]研究表明，RASAL1 基因在肝纤维化中高甲基化，RAS-RAF-MEK-ERK 通路激活，导致 HSCs 活化，而 MeCP2 基因的沉默可增加 RASAL1 的表达。以上研究结果提示，RASAL1 在肝纤维化处于无活性状态，使 RAS-RAF-MEK-ERK 通路激活，导致 HSCs 活化。
3 组蛋白甲基化在肝纤维化中的作用
3.1 组蛋白甲基化
组蛋白八聚体由 H2A、H2B 与 H3、H4 各两分子组成，147 bp 的 DNA 围绕组蛋白八聚体外形成核小体。核小体是最基本的染色体结构。组蛋白甲基化修饰（一种翻译后修饰）通常发生在核小体中 H3 和 H4 组蛋白 N 端的赖氨酸或精氨酸残基上，组蛋白甲基转移酶能够在其残基上添加 1、2 或 3 个甲基，根据残基上甲基化基团的数量分为单甲基化、二甲基化或三甲基化。赖氨酸甲基化通常发生在 H3 赖氨酸 4（H3K4）、9（H3K9）、27（H3K27）、36（H3K36）、79（H3K79）和 H4 赖氨酸 20（H4K20）中，精氨酸甲基化通常发生在 H3 精氨酸 2（H3R2）、8（H3R8）、17（H3R17）、26（H3R26）和 H4 精氨酸 3（H4R3）中[59]。对基因转录的影响取决于共价修饰的特定位点，如 H3K4 三甲基化导致基因转录活化，而 H3K9 或 H3K27 导致基因转录沉默[60-62]。在 HSCs 的激活过程中伴随着涉及甲基转移至 H3K27 和 H3K4，甲基转移酶 EZH2 调节 H3K27 甲基化使其沉默，而甲基转移酶 ASH1 调节 H3K4 甲基化使其活化。EZH2 是通过靶向 PPARγ 介导 H3K27 甲基化的，而 ASH1 直接绑定于活化 HSCs 中的α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白、TIMP-1、TGF-β1 所在区域。ASH1 消失会极大地抑制纤维化基因的表达，MeCP2 可正调控 ASH1 表达，提出 MeCP2 作为表观遗传学调控通路中的一个关键的转录活性成分共同调节多个纤维化相关基因的表达[63]。有研究[64]发现，组蛋白甲基转移酶抑制剂 3-deazaneplano-A（DZNep）可抑制多种组蛋白甲基化修饰，从而抑制肝纤维化的进展。近几年也有不少与组蛋白甲基化修饰相关的基因的研究。
3.2 组蛋白甲基化相关因子与肝纤维化
3.2.1 缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）
HIF-1 是由氧敏感性 α 亚基（HIF-1α）和组成性 β 亚基（HIF-1β）组成的异二聚体转录因子，通过在缺氧条件下调节必需基因的表达来促进细胞存活[65]。HIF-1 通过调节自噬以激活 HSCs[66-67]。缺氧可抑制细胞中 H3K4 三甲基化组蛋白甲基化修饰[68]。Deng 等[67]在缺氧诱导的 LX-2 细胞中研究发现，HIF-1α 分子的核运输、自噬和 HSCs 活化明显受到抑制，是由于缺氧条件下 H3K4 三甲基化组蛋白甲基化被 DZNep 抑制，结果提示，组蛋白甲基化修饰在 HIF-1 信号级联中起重要作用以调节细胞活性。Hong 等[69]研究组蛋白 H3K4 甲基化修饰在 HSCs 活化中起关键作用，抑制组蛋白 H3K4 三甲基化修饰影响 HIF-1 核运输，最终影响自噬和 HSCs 的激活。以上研究结果提示，H3K4 的三甲基化会影响 HIF-1 核运输和自噬，进而影响 HSCs 的活化。
3.2.2 Dickkopf-1（Dkk-1）
Dickkopf 家族（Dkk）由 4 个成员（Dkk-1－Dkk-4）组成，充当 Wnt 信号通路的抑制剂，其中 Dkk-1（Wnt/β-catenin 信号传导的抑制剂）过表达能够抑制原代培养的 HSCs[70]。研究[71]表明，在肝纤维化进展过程中，HSCs 中 Wnt 信号通路被激活且诱导此通路的一些下游元件。Hussain 等[72]和 Yang 等[73]均报道，EZH2 通过 H3K27 的三甲基化抑制 Dkk-1 表达，从而激活 Wnt/β-catenin 途径使 HSCs 活化。以上研究结果提示，H3K27 的三甲基化会抑制 Dkk-1 的表达，使 Wnt/β-catenin 信号通路激活，从而使 HSCs 活化。
3.2.3 心肌素相关转录因子-A（myocardin related transcription factor-A，MRTF-A）
MRTF-A 是转录调控激活辅助因子，其通过与组蛋白甲基转移酶复合物 SET1/COMPASS 相互作用而增强 HSCs 活化[74]。SET1/COMPASS 复合物是一个由 8 个蛋白亚基组成的相对分子质量为 380×103的甲基转移酶复合物，它能够催化组蛋白 H3K4 位点发生单甲基化、二甲基化及三甲基化[75]。Tian 等[76]研究发现，MRTF-A 减少会影响 SET1/COMPASS 复合物亚基与组蛋白甲基转移酶的结合，从而减轻 TGF-β 诱导的促纤维化转录。以上研究结果提示，MRTF-A 是通过表观遗传学中组蛋白甲基化转移酶与 SET1/COMPASS 的作用调节 HSCs 中 TGF-β 信号通路来调节肝纤维化的。
4 小结与展望
甲基化通过改变基因的表观遗传学从而影响基因的表达，引起肝纤维化中不同途径的级联反应，由此我们可以通过对甲基化在肝脏疾病中的作用及机制进行系统而深入的研究，为肝脏疾病的治疗提供新的方向。从目前的研究看，DNMTs 抑制剂（5-azadC）可以通过抑制 DNA 甲基化而抑制 HSCs 的持续活化，其正在进行Ⅱ期测试试验中；DZNep 也在用于抑制肝纤维化的进展；另有研究也在用甲基化级联反应的某个位点作为潜在的靶点来治疗肝纤维化。