引用本文： 任生生, 许亮亮, 张鸣, 徐明清. 体液环状 RNA 用于疾病诊断的研究进展. 中国普外基础与临床杂志, 2019, 26(5): 611-619. doi: 10.7507/1007-9424.201811022 复制
环状 RNA 是一类内源性的、经反向剪接后由 3′端及 5′端共价结合形成的环状 RNA 分子[1]，广泛存在于多种生物体内，具有结构稳定、序列保守、组织细胞特异性等特点。随着高通量测序技术等 RNA 研究技术的飞速发展，环状 RNA 的神秘面纱也在逐渐被人们揭开。环状 RNA 与人类疾病的密切关系正在被人们证实，目前已有研究发现，环状 RNA 与各种肿瘤[2]、心血管疾病[3]、神经系统疾病[4]、骨关节炎[5]、自身免疫性疾病[6-8]等多种疾病相关，环状 RNA 作为生物标志物的潜力也正在被逐步证实。另外，体液检测由于其取材方便、创伤小等特点已被广泛应用于临床。当前已有研究[9]发现，环状 RNA 能经外泌体等途径被分泌到体液中，Memczak 等[10]也报道了在人体血液中检测出了大量环状 RNA，这些都充分说明了体液环状 RNA 作为生物标志物用于疾病诊断等的可能性。当前一些研究成果也证实了这一点。关于体液环状 RNA 检测在疾病诊断、预后等方面应用的研究正在成为环状 RNA 研究领域的新星和热点，笔者现就目前国内外有关体液环状 RNA 在人类疾病诊断方面的研究作一综述。
1 环状 RNA 概述
1.1 环状 RNA 分类
1.1.1 外显子环状 RNA
当前研究发现的大部分环状 RNA 为外显子来源的环状 RNA，即外显子环状 RNA。目前研究发现，外显子环状 RNA 主要通过直接的反式剪接和外显子跳读 2 种机制合成，前者是指外显子下游的 RNA 序列（即 3′ 末端）与上游的 RNA 序列（即 5′ 末端）相结合而形成环状 RNA[11]；后者又称套索驱动环化，是指在转录过程中，不均一核 RNA（hnRNA）部分折叠而拉近非相邻的外显子，从而发生外显子跳读并形成套索结构，套索结构被剪切并发生反向剪接而形成环状 RNA[12]。
1.1.2 内含子环状 RNA
内含子环状 RNA，顾名思义，即来源于内含子的环状 RNA。由于剪接机制不同，内含子可以分为自我剪接内含子、酶促剪接内含子及核 mRNA 内含子，机体内的内含子环状 RNA 则主要来源于自我剪接内含子。相较于外显子环状 RNA，内含子环状 RNA 的数量较少，其保守性亦较低，另外在稳定性、丰度、功能等方面，二者亦不尽相同[12]。
1.1.3 外显子-内含子环状 RNA
外显子-内含子环状 RNA 系指 2 个或 2 个以上外显子环化时，其间的内含子滞留并同时环化而形成的既包含外显子又包含内含子的环状 RNA，主要存在于细胞核中，可调节亲本基因表达[13-14]。
1.2 环状 RNA 的特点
1.2.1 稳定性高
环状 RNA 因其没有 3′ 和 5′ 端结构，且其本身为环状闭合结构，故不易被核酸外切酶作用发生水解[15-16]，所以其在生物体内能稳定存在。研究[12]发现，大多数环状 RNA 的半衰期超过 48 h。
1.2.2 分布广泛
自从 19 世纪 70 年代环状 RNA 在类病毒中被发现，此后的研究分别从真菌、病毒、昆虫、人类细胞等多种生命体中发现了环状 RNA 的存在。已经有大量研究[16-20]证实，环状 RNA 普遍存在于各种原核、真核细胞及病毒中。
1.2.3 具有保守性及组织特异性
已有研究[12, 16]证实，环状 RNA 在不同物种间亦具有保守性。例如，Jeck 等[12]发现，人类成纤维细胞中的 2 121 种环状 RNA 能与小鼠基因组相配，其中 457 个被匹配的小鼠基因组可以产生相同的环状 RNA，这从一个方面体现了环状 RNA 在不同物种间的保守性。而 Memczak 等[16]则发现，小鼠和人体不仅有 82 种相同的环状 RNA，更发现了环状 RNA CDR1as 在脑组织中的表达水平高、而在非神经系统组织中表达水平相对较低的现象，这说明环状 RNA 除了保守性，更存在组织特异性。
1.2.4 高表达
有研究[12, 20-21]发现，部分环状 RNA 相对于其相同来源的线性转录本而言，其表达量高出了十多倍。
1.3 环状 RNA 的作用途径
1.3.1 microRNA 分子的海绵功能
环状 RNA 分子上存在 microRNA 的结合位点，环状 RNA 可以通过与 microRNA 的结合调节下游基因表达，进而发挥相应的生物功能[22]。现有的研究已经发现，多种环状 RNA 具有 microRNA 分子海绵功能，如 CDR1as[23]、circular RNA ITCH[13]等。
1.3.2 调控亲本基因转录
由于环状 RNA 可被视作一种剪接异构体，故其可能通过翻译成功能性蛋白或者减少可被翻译成功能性蛋白的规范化剪接转录本，从而在可变调节水平调节基因转录[24]。
1.3.3 与 RNA 结合蛋白相互作用
环状 RNA 可以与某些功能性蛋白结合，进而发挥生物学功能，例如 RNA 剪切因子 muscleblind-like（MBL）可以促进环状 RNA Mbl（circ Mbl）的环化，而 circ Mbl 也能与 MBL 结合，降低 MBL 的浓度，从而减少 circ Mbl 的合成[25]。
1.3.4 翻译成蛋白质或多肽而发挥作用
目前已有研究[26]发现，环状 RNA 可直接翻译成蛋白质或多肽而发挥其生物学功能。例如，早在 20 世纪 80 年代，Kos 等[26]就发现，丁型肝炎核心的单股负链环状 RNA 可转录翻译成丁型肝炎核心抗原。
2 体液环状 RNA 在疾病诊断中的作用
2.1 外周血环状 RNA 与疾病诊断
外周血血液标本（血浆/血清）采集方便且创伤较小，是目前临床应用得最多的检验标本，血液标本可以提供疾病诊断依据、反映疾病进展过程、辅助判断疾病预后等。目前，通过检测血液标本中的环状 RNA，并判断环状 RNA 与疾病诊断及预后相关性的研究亦不在少数。
2.1.1 外周血环状 RNA 在恶性肿瘤诊断中的作用
2.1.1.1 外周血环状 RNA 与胃肠道恶性肿瘤
Chen 等[27]通过检测 104 例胃癌患者及健康对照者的血清环状 RNA 后发现，胃癌患者血清中 has_circ_0000190 的表达下调，且其表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、TNM 分期及 CA19-9 水平相关，故而推断 has_circ_0000190 可作为胃癌诊断的生物标志物。且在研究中，Chen 等[27]发现，has_circ_0000190 作为胃癌的诊断标志物，其敏感性和特异性均优于 CEA、CA19-9 等常用标志物。此外，Li 等[28]亦发现，胃癌患者术前血清 has_circ_002059 的表达水平低于术后，差异具有统计学意义，且低表达的 has_circ_002059 与胃癌的远处转移及进展分期相关，提示 has_circ_002059 可能为胃癌诊断及预后判断的潜在生物学标志物。Zhao 等[29]也在研究中发现了可以作为胃癌诊断生物标志物的环状 RNA，即 has_circ_0000181。他们在研究中发现，胃癌患者血清中 has_circ_0000181 的表达相较于健康对照明显下降，且低表达的 has_circ_0000181 与肿瘤分化程度及 CEA 水平相关[29]。Huang 等[30]则通过研究发现，相对于健康对照，胃癌患者血浆中的 hsa_circ_0000745 的表达水平明显降低，证明了 hsa_circ_0000745 作为胃癌诊断标志物的可能性。Sun 等[31]则发现，胃癌患者与健康对照相比，其血浆中 hsa_circ_0000520 的表达明显下调，推测其具有作为胃癌诊断非侵入性标志物之潜能。此外，被发现可能具有胃癌非侵入性诊断标志物潜力的环状 RNA 还有 has_circ_00006633，由 Lu 等[32]研究发现。Lu 等[32]发现，胃癌患者血浆中的 has_circ_00006633 的表达水平与正常对照组相比明显下调。目前已有研究[9]发现，结肠癌细胞外泌体中 circRTN4 呈高表达，该结果提示我们，有可能通过检测外周血外泌体中的环状 RNA 来诊断结肠癌。
2.1.1.2 外周血环状 RNA 与肝细胞肝癌（HCC）
Zhang 等[33]发现，HCC 患者血浆中 has_circ_0001445 的转录水平低于肝硬变患者、乙肝患者及健康对照，而且受试者操作特征曲线（ROC）结果亦提示，血浆 has_circ_0001445 可作为一种比较准确的标志物，用以区分 HCC 病例与健康人群、肝硬变或乙肝患者。
2.1.1.3 外周血环状 RNA 与胰腺癌
Li 等[34]发现，转移性胰腺癌患者的血浆外泌体中 circ-IARS 的表达明显上调，且 circ-IARS 高表达与肿瘤血管浸润、肝转移及 TNM 分期相关；生存分析结果则表明，circ-IARS 表达与胰腺癌患者的生存时间呈负相关。这提示，血浆外泌体中的 circ-IARS 可能为胰腺癌早期诊断及预后判断方面的非侵入性生物标志物。此外，Yang 等[35]在其研究中也发现，相对于健康对照来说，胰腺癌患者血浆中 circ-LDLRAD3 的表达显著上调，且与血管、淋巴浸润及转移相关，因而推测 circ-LDLRAD3 可以作为胰腺癌的诊断标志物。Shao 等[36]则发现，对吉西他滨治疗无应答的胰腺导管腺癌患者，其血浆 chr14：101402109-101464448+和 chr14：52729603-52780244+相较于应答患者明显升高；在细胞实验中，他们亦发现，沉默上述 2 种环状 RNA 表达的、对吉西他滨耐药的癌细胞可恢复对吉西他滨的耐药性，而过度表达则会增加对吉西他滨的耐药性。这提示血浆 chr14：101402109-101464448+和 chr14：52729603-52780244+可能作为非侵入性生物标志物，在判断胰腺导管腺癌对吉西他滨耐药方面具有重要应用价值，也提示了此 2 种环状 RNA 作为对吉西他滨耐药的胰腺导管腺癌患者的潜在治疗靶点的可能性。
2.1.1.4 外周血环状 RNA 与乳腺癌
Yin 等[37]通过环状 RNA 的微阵列分析发现，乳腺癌患者相较于健康对照者其血浆环状 RNA 有 19 种表达上调，22 种表达下调；经 RT-PCR 验证发现，has_circ_0001785、has_circ_0108942 和 has_circ_0068033 的表达下调具有统计学意义，其中 has_circ_0001785 的诊断价值优于其他 2 种环状 RNA，且其表达与肿瘤病理分级、TNM 分期及远处转移相关。同时他们[37]发现，has_circ_0001785 的诊断准确性要高于 CEA 和 CA153，且乳腺癌患者术后血清中 has_circ_0001785 的表达水平明显低于术前，这提示 has_circ_0001785 具有乳腺癌诊断标志物的重要作用。
2.1.1.5 外周血环状 RNA 与肺癌
Zhu 等[38]发现，肺腺癌患者血浆中 hsa_circ_0013958 的表达水平明显下调，且与 TNM 分期和淋巴结转移相关，细胞实验亦证实了 hsa_circ_0013958 具有促进肺腺癌细胞增殖浸润和侵袭的作用，并有抑制细胞凋亡的作用。此外，他们的研究[38]还发现，hsa_circ_0013958 是通过作为 mircoRNA-134 海绵并抑制其功能来发挥作用的，而 microRNA-134 则是通过下调细胞周期蛋白 D1（CCND1）来发挥对非小细胞肺癌的抑癌作用，因而，Zhu 等[38]推测，mircoRNA-134 可能是通过 microRNA-134-CCND1 通路来发挥作用的。他们的研究结果显示了 has_circ_0013958 作为肺腺癌早期诊断及筛查的重要非侵入性生物标志物的可能性。另外，Hang 等[39]研究发现，非小细胞肺癌患者血清中 circFARSA 的表达上调，通过细胞实验他们还证实了 circFARSA 对细胞侵袭及迁移的促进作用。他们的研究[39]同时也表明，circFARSA 可能通过作为 microRNA-330-5P 和 microRNA-326 海绵，通过减轻二者对癌基因脂肪酸合成酶的抑制作用而发挥作用。这为血浆 circFARSA 作为非小细胞肺癌非侵入性生物标志物提供了证据。
2.1.1.6 外周血环状 RNA 与子宫内膜癌
Xu 等[40]检测了 10 例 Ⅲ 期子宫内膜癌患者血浆外泌体中的环状 RNA，并与健康者对照，发现共有 275 种环状 RNA 的差异存在统计学意义，其中 209 种表达上调，66 种表达下调。经进一步筛选及验证发现，hsa_circ_ 0109046 和 hsa_circ_0002577 这 2 种环状 RNA 的表达水平在子宫内膜癌患者的血清外泌体中显著上升，提示其作为子宫内膜癌的血液诊断标志物之可能。
2.1.2 外周血环状 RNA 在心血管疾病诊断中的作用
2.1.2.1 外周血环状 RNA 与冠心病及心肌梗塞
Zhao 等[41]通过对冠心病患者和健康对照患者血清中的环状 RNA 进行 RNA 微阵列分析发现，冠心病患者的血清环状 RNA 相较于健康对照有 12 种上调，10 种下调，随后经过进一步筛选并扩大样本量验证后发现，冠心病患者血清中明显上调的 hsa_circ_0124644 具有最高的灵敏度和特异度，且其联合同样在冠心病患者血清中表达上调的 hsa_circ_0098964 后，对冠心病具有更高的诊断价值。Deng 等[42]通过环状 RNA 微阵列分析比较了急性心肌梗塞患者与健康对照者的血浆环状 RNA 谱，共有 7 326 种环状 RNA 被检测到，有 160 种环状 RNA 在急性心肌梗塞患者组与健康对照组之间的差异存在统计学意义，其中 73 种表达上调，87 种表达下调；经过进一步筛选发现，circRNA-081881 在急性心肌梗塞患者血浆标本中的表达水平相较于健康对照组明显降低了 12.5 倍，提示 circRNA-081881 具有作为急性心肌梗塞诊断标志物的潜力。Salgado-Somoza 等[43]检测了 472 例急性心肌梗塞患者在心肌再灌注时环状 RNA MICRA 的表达水平，并用心脏彩超评估了 4 个月后患者的左室射血分数（EF）值，依据欧洲心脏病学会（ESC）心力衰竭指南将患者分为 EF 降低组（rEF 组）、中值 EF 组（mrEF 组）及保留 EF 组（pEF 组），经过分析比较发现，rEF 组患者全血标本中环状 RNA MICRA 的表达水平较 mrEF 组及 pEF 组明显降低，而 mrEF 组与 pEF 组之间比较差异无统计学意义。这提示了环状 RNA MICRA 作为心肌梗塞患者预后生物标志物的重要潜力。
2.1.2.2 外周血环状 RNA 与心力衰竭
除了前文提及的全血标本环状 RNA MICRA 可能在预测急性心肌梗塞患者 EF 值降低方面具有重要潜力外，目前尚无其他确切环状 RNA 在外周血中被发现可作为心力衰竭诊断的标志物，但环状 RNA 研究整体尚处于初始阶段。由于环状 RNA 的性质稳定等特点，外周血环状 RNA 作为心力衰竭诊断标志物的研究前景仍光明。
2.1.2.3 外周血环状 RNA 与高血压
Bao 等[44]通过微阵列分析比较了原发性高血压患者与健康对照组全血标本中环状 RNA 的表达水平，通过验证筛选并进一步分析发现，在原发性高血压患者全血标本中 has_circ_0037911 的表达明显上调，且与血肌酐水平相关，推测 has_circ_0037911 可能在原发性高血压的发病中起重要作用，且是高血压临床预测和诊断的潜在生物标志物。另外，Wu 等[45]通过环状 RNA 微阵列分析比较了高血压患者和健康对照者血浆中环状 RNA 的表达差异，发现高血压患者血浆中的环状 RNA 相对于健康对照有 13 种表达下调，46 种表达上调，其中 has_circ_0000437、has_circ_0008139、has_circ_0005870 和 has_circ_0040809 的表达水平在 2 组间的差异有统计学意义；经过进一步验证发现，has_circ_0005870 在高血压患者血浆中的表达明显下调，提示其可能是诊断高血压的一种新型生物标志物。
2.1.3 外周血环状 RNA 在神经系统疾病诊断中的作用
Zhao 等[46]使用微阵列分析比较了烟雾病和健康对照者血液标本的环状 RNA，发现 2 组之间存在差异性表达的环状 RNA 有 146 种，其中 29 种表达上调，117 种表达下调；经过 RT-PCR 验证后，他们发现，烟雾病患者相对于健康对照者其血液标本中上调最显著的 3 种环状 RNA 分别是：has_circ_062557、has_circ_067130 和 has_circ_067209，下调最显著的 3 种环状 RNA 分别是：has_circ_100914、has_circ_089761 和 has_circ_089763，提示这 6 种环状 RNA 可能是烟雾病诊断的重要生物学标志物。Han 等[47]利用微阵列分析分析了大鼠脑卒中模型脑组织中环状 RNA 的表达，并且进一步筛选验证出了表达明显上调的环状 RNA Hectd1；之后在人类脑卒中患者血浆中的研究结果也表明，Hectd1 的表达显著上调。分析机制可能是，Hectd1 作为内源性的 microRNA142 海绵来抑制 microRNA142 的活性，从而抑制了 TCDD 诱导的 ADP 多聚核糖聚合酶（TIPARP）的表达，进而抑制星形胶质细胞的自噬[47]。推测 Hectd1 可能参与脑卒中的发生发展，并可作为其诊断的生物标志物及治疗的靶点。
2.1.4 外周血环状 RNA 在自身免疫性疾病诊断中的作用
2.1.4.1 外周血环状 RNA 与系统性红斑狼疮（SLE）
Zhang 等[48]在其研究中，首先对 4 例 SLE 患者和 4 例健康对照患者的血浆样品进行了 circRNA 芯片检测，共鉴定出 4 763 种环状 RNA，其中在 2 组之间表达差异具有统计学意义的共有 112 种（53 种表达上调，59 种表达下调）。随后，他们筛选出了 3 种表达上调或下调最明显的环状 RNA，即 has_circRNA_407176、has_circRNA_406567 及 has_circRNA_001308，并利用 122 例 SLE 患者和 102 名健康对照组的血浆样本，以及 26 例 SLE 患者和 26 名健康对照组的外周血单核细胞样本对实验结果进行了验证，最终发现，SLE 患者血浆标本及外周血单核细胞标本中的 has_circRNA_407176 和 has_circRNA_001308 的表达水平较健康对照均明显下调，但 has_circRNA_406567 的验证结果无统计学差异。因而推论，has_circRNA_407176 和 has_circRNA_001308 可能是 SLE 的外周血生物标志物。Li 等[8]则利用环状 RNA 微阵列技术检测了 SLE 患者与健康对照者的血清环状 RNA，鉴定出了 207 种差异表达的环状 RNA（113 种表达上调，94 种表达下调），经过进一步筛选验证发现，has_circ_102584、hsa_circ_400011 和 hsa_circ_101471 在 SLE 患者血清中的表达水平显著下降，而 hsa_circ_100226 的表达则显著上调。此外，还有研究[49]发现，SLE 患者外周血单核细胞中 hsa_circ_0049224 和 has_circ_0049220 的表达水平显著低于健康对照，且上述 2 种环状 RNA 的表达水平与 SLE 活动水平呈负相关。
2.1.4.2 外周血环状 RNA 与多发性硬化症
Iparraguirre 等[50]对多发性硬化症患者的外周血白细胞进行了环状 RNA 微阵列分析，并与健康者进行对照，确定了多发性硬化症患者外周血白细胞的环状 RNA 表达谱，共有 13 617 种环状 RNA，且发现 2 组之间有 406 种环状 RNA 存在表达差异；经过进一步筛选验证，发现 circ0005402 和 circ0035560 在多发性硬化症患者外周血标本中的表达水平显著降低，此 2 种环状 RNA 可作为多发性硬化症诊断的生物学标志物。
2.1.4.3 外周血环状 RNA 与类风湿性关节炎
Ouyang 等[51]使用环状 RNA 微阵列分析分析了 4 例类风湿性关节炎患者及健康对照外周血白细胞的环状 RNA 表达谱，发现类风湿性关节炎患者中有9 种环状 RNA 表达上调，3 种表达下调；经进一步筛选并在 30 例类风湿性关节炎患者及 25 份健康对照标本中进行验证分析，发现 circRNA_104871、circRNA_003524、circRNA_101873 和 circRNA_103047 在类风湿性关节炎及健康对照外周血白细胞中的表达具有显著差异且有诊断价值，其中 ROC 结果提示 circRNA_104871 的诊断价值最高。此外，Luo 等[52]的研究发现，外周血 has_circ_0044235 可能是类风湿性关节炎的诊断标志物。Zheng 等[7]在其研究中也发现了在类风湿性关节炎患者及健康对照者外周血单核细胞中表达具有显著差异的 5 种环状 RNA，其中 4 种表达上调：has_circRNA_104194、has_circRNA_103334、has_circRNA_104593 和 has_circRNA_101407；1 种表达下调：has_circRNA_102594。
2.1.4.4 外周血环状 RNA 与原发性胆汁性胆管炎
Zheng 等[53]使用环状 RNA 微阵列分析鉴定了 6 例原发性胆汁性胆管炎患者及 6 位健康对照者血浆标本的环状 RNA 表达谱，共有 7 344 种环状 RNA 被鉴定出，其中 2 组间差异有统计学意义的共有 22 种（18 种表达上调，4 种表达下调）；随后他们进行进一步筛选、增加样本量并使用 RT-PCR 进行验证以及进行 ROC 分析，最终确定了曲线下面积（AUC）较高、P值较低且表达水平较高的 hsa_circ_402458，作为原发性胆汁性胆管炎的最佳生物标志物。
2.1.5 外周血环状 RNA 在糖尿病及糖尿病相关性疾病诊断中的作用
2.1.5.1 外周血环状 RNA 与糖尿病
Zhao 等[54]在其研究中使用微阵列分析对 6 例 2 型糖尿病患者及 6 例健康对照的血浆标本进行了环状 RNA 微阵列分析，共发现 489 种在 2 组之间表达差异具有统计学意义的环状 RNA，其中有 78 种表达上调，411 种表达下调；随后经过筛选，在扩大样本量的 2 型糖尿病患者、糖尿病前期人群及健康对照组 3 组中进行了验证及分析，发现 has_circ_0054633 对糖尿病前期及 2 型糖尿病具有一定的诊断能力，具有作为二者血浆诊断标志物的潜力。此外，Li 等[55]则在其研究中通过分析冠心病患者、糖尿病患者、糖尿病合并冠心病患者及健康对照者的血浆环状 RNA，发现在上述 3 种患者血浆中显著下调的 has_circRNA_11783-2 与糖尿病及冠心病关系密切。
2.1.5.2 外周血环状 RNA 与糖尿病视网膜病变
Zhang 等[56]首先鉴定了糖尿病视网膜病变患者和非糖尿病个体视网膜的环状 RNA 表达谱，然后进一步筛选并分析验证得出，circ_0005015 在糖尿病视网膜病变患者的病变视网膜组织中表达明显上升，且对糖尿病视网膜病变具有一定的诊断价值。随后他们检测了正常人、白内障患者及糖尿病视网膜病变患者血浆中 circ-0005015 的表达水平，发现糖尿病视网膜病变患者血浆中 circ-0005015 的表达水平明显高于其他 2 组；另外他们还发现，circ_0005015 可能通过调控人视网膜微血管内皮细胞（HRVEC）的功能参与糖尿病视网膜病变的发病机制[56]。他们的研究证明了，circ_0005015 是一种很有前途的可以用于糖尿病视网膜病变诊断和预后的生物标志物，并且可以促进视网膜内皮血管生成。而在另一项研究中，Gu 等[57]则直接鉴定了糖尿病视网膜病变患者、单纯糖尿病无视网膜病变患者及健康对照者的环状 RNA 表达谱，发现糖尿病视网膜病变患者与单纯糖尿病患者及健康对照之间共有 32 种环状 RNA 的表达差异具有统计学意义，且这 32 种环状 RNA 在糖尿病视网膜患者血清中的表达均上调。
2.1.5.3 外周血环状 RNA 与 2 型糖尿病患者慢性感染
Fang 等[58]在其研究中鉴定了 2 型糖尿病患者与健康对照者外周血白细胞的环状 RNA 表达谱，发现 2 组之间有 220 种环状 RNA 的表达存在差异，其中 107 种表达上调，113 种表达下调。经过筛选验证，发现 2 型糖尿病患者外周血白细胞中 circANKRD36 的表达水平相对于健康对照明显上升，且其表达水平与糖化血红蛋白及白介素 6 水平呈正相关，因而推论，circANKRD36 可以作为筛查 2 型糖尿病患者慢性炎症的潜在生物标志物。
2.1.5.4 外周血环状 RNA 与 2 型糖尿病合并抑郁症
当前已有研究[59-61]发现，2 型糖尿病和抑郁症之间有密切联系。基于此，Jiang 等[62]利用环状 RNA 微阵列分析检测了合并抑郁症的 2 型糖尿病患者及单纯 2 型糖尿病患者全血标本的环状 RNA 表达谱，结果发现，合并抑郁症的 2 型糖尿病患者与单纯2 型糖尿病患者相比，其血液标本中有 183 种环状 RNA 表达上调，64 种表达下调；经过进一步筛选验证，确定了 4 种在 2 组之间表达具有显著差异且经 QT-PCR 验证与微阵列分析结果一致的环状 RNA，分别是 has_circRNA_003251、has_circRNA_015115、has_circRNA_100918 和 has_circRNA_001520；其后，他们进一步筛选了以上 4 种环状 RNA 可以靶向调节的 microRNA，并研究了其可能的作用通路，结果显示，以上 4 种环状 RNA 可能通过参与甲状腺激素、Wnt、ErbB 和丝裂原活化蛋白激酶信号通路而发挥作用。
2.1.6 外周血环状 RNA 在其他疾病诊断中的作用
2.1.6.1 外周血环状 RNA 与活动性肺结核
Huang 等[63]鉴定了 3 例活动性肺结核患者及 3 例健康对照者外周血单核细胞的环状 RNA 表达谱，发现共有 37 种差异表达的环状 RNA，其中 13 种表达上调，24 种表达下调。随后在表达上调和下调的环状 RNA 中分别选择了最显著的 3 种：即 hsa_circRNA_001937、hsa_circRNA_009024、hsa_circRNA_005086 和 hsa_circRNA_102101、hsa_circRNA_104964、hsa_circRNA_104296；之后扩大样本量进行验证，并检测了其诊断价值及诊断的敏感性及特异性，结果提示，hsa_circRNA_001937的诊断敏感性及特异性最高，最具诊断价值，且其与 hsa_circRNA_009024 联合时诊断的准确性更高。该研究结果提示，外周血 hsa_circRNA_001937 是一个很有潜力的活动性肺结核的诊断标志物。外周血环状 RNA 在活动性肺结核诊断中的重要潜力在 Qian 等[64]的研究中亦得到了证实。此外，Zhang 等[65]利用全转录组测序分析了 3 例肺结核患者及 3 例健康对照者的外周血环状 RNA 的表达情况，共鉴定出 16 288 种环状 RNA，其中 170 种环状 RNA 表达在 2 组之间存在显著差异（有 102 种环状 RNA 在肺结核患者外周血中表达上调，68 种表达下调），进一步筛选出的 hsa_circRNA_14623、hsa_circ_09585、hsa_circ_005538、hsa_circ_09993、hsa_circ_13478 和 hsa_circ_00074 经 QT-PCR 验证结果与测序结果一致，可能的信号通路也在该研究中被分析。这提示环状 RNA 作为肺结核血液标志物的重要潜能及其在肺结核病理生理中可能发挥重要作用。
2.1.6.2 外周血环状 RNA 与子痫前期
Jiang 等[66]首次通过环状 RNA 微阵列分析鉴定了子痫前期孕妇和健康对照孕妇外周血细胞的环状 RNA 谱，结果发现，子痫前期孕妇和健康对照孕妇外周血细胞中共有 5 396 种环状 RNA 被鉴定，其中有显著差异的环状 RNA 有 2 178 种（子痫前期孕妇外周血相对于健康对照者表达上调的环状 RNA 有 1 294 种，表达下调的有 884 种）；经筛选及进一步验证，他们确定了在子痫前期孕妇外周血中表达显著上调的2 种环状 RNA，即 has_circ_0004904 和 has_circ_0001855，提示此 2 种环状 RNA 对于子痫前期具有诊断价值；此外，他们还发现，上述 2 种环状 RNA 可能上调妊娠相关血浆蛋白 A（PAPP-A）的表达水平，且上述 2 种环状 RNA 合并 PAPP-A 对子痫前期具有更好的诊断价值。
2.1.6.3 外周血环状 RNA 与慢性髓系白血病
Liu 等[67]在其研究中利用高通量测序技术鉴定了慢性髓系白血病患者及健康对照者的外周血环状 RNA 表达谱，且经筛选验证分析发现，相较于健康对照，慢性髓系白血病患者外周血中 has_circ_0080145 的表达水平明显上调，且功能实验等结果证明，敲低 has_circ_0080145 会显著抑制慢性髓系白血病细胞增殖，且其可能是通过作为 microRNA-29b 海绵来发挥作用的。他们的研究提示，has_circ_0080145 可能是慢性髓系白血病重要的诊断和预后标志物及潜在的治疗靶点。
2.2 唾液中的环状 RNA 与疾病诊断
唾液因其取材方便、快捷、廉价、取材过程无创等优点，近年来越来越被视作疾病研究中的理想的体液标本。关于唾液中的疾病标志物的研究越来越多，唾液中环状 RNA 的研究也正在兴起，环状 RNA 因其稳定性高等特点正被越来越多的研究证实其作为疾病生物标志物的重要作用。
Zhao 等[68]通过微阵列分析方法鉴定了 3 例口腔鳞状细胞癌患者和 3 例健康对照者唾液中的环状 RNA 表达谱，发现有 32 种环状 RNA 在 2 组之间的表达存在差异，其中有 12 种环状 RNA 在口腔鳞癌患者唾液中的表达相对于健康对照上调，20 种下调。随后他们选择了上调最显著的 3 种环状 RNA（hsa_circ_0001874、hsa_circ_0001971 和 hsa_circ_0008068）和下调最显著的 3 种（hsa_circ_0000140、hsa_circ_0002632 和 hsa_circ_0008792）进行进一步验证分析，发现 qRT-PCR 验证结果与微阵列分析结果一致。ROC 分析则显示，上述 6 种环状 RNA 均对口腔鳞癌具有诊断价值，其中 hsa_circ_0001874 的AUC值最高，且 hsa_circ_0001874 与 hsa_circ_0001971 联合后的诊断准确度更高。在对以上 6 种环状 RNA 与口腔鳞癌患者的临床特征进行分析后发现，has-circ-0001874 与肿瘤 TNM 及病理分级相关，has-circ-0001971 与 TNM 分期相关，其余环状 RNA 与临床特征无关。此外，研究者还对比了口腔鳞癌患者术前 1 个月与术后 1 个月唾液中 hsa_circ_0001874 与 hsa_circ_0001971 的表达水平，发现术后 1 个月上述 2 种环状 RNA 在口腔鳞癌患者唾液中的表达水平较术前 1 个月明显减低。Zhao 等[68]通过上述研究向人们证实了唾液环状 RNA 在口腔鳞癌的诊断及预后中的重要潜力。这也为更多的关于唾液环状 RNA 与人类疾病关系的研究奠定了基础。
2.3 尿液中的环状 RNA 与疾病诊断
尿液是人体的重要排泄物，泌尿系统的多种疾病都会在尿液中有所体现，而尿液本身因其取材方便快捷、方法简单廉价等优点在临床应用广泛。除了尿液临床指标检测有助于泌尿系统疾病的诊断和病情判断外，尿液中的非编码 RNA 这类重要的生物分子，目前业已有研究[69]发现其具有疾病诊断及预后相关的潜力。
Chen 等[69]利用环状 RNA 微阵列分析方法鉴定了膀胱尿路上皮癌和癌旁组织中的环状 RNA 表达谱，经过分析验证发现，环状 RNA circPRMT5 的表达在癌组织中显著上调；随后又检测了膀胱尿路上皮癌患者血清及尿液外泌体中的 circPRMT5，发现与健康对照相比，膀胱尿路上皮癌患者的血清及尿液外泌体中 circPRMT5 的表达显著上调，且与肿瘤淋巴结转移及进展相关，提示血清及尿液中的外泌体环状 RNA circPRMT5 具有作为膀胱尿路上皮癌诊断及预后生物标志物的重要潜能。
2.4 胃液中的环状 RNA 与疾病诊断
Shao 等[70]在其研究中，利用环状 RNA 微阵列分析鉴定了胃癌及癌旁组织中的环状 RNA 谱，经进一步研究发现，hsa_circ_0014717 在胃癌组织中的表达水平明显下调，且与胃癌肿瘤分期、远处转移、CEA 水平及 CA19-9 水平相关，但与淋巴结转移等其他临床特征无关。同时他们发现，hsa_circ_0014717 可以在胃液中稳定存在，但是在比较了胃癌患者、胃溃疡患者、慢性萎缩性胃炎患者及健康对照者胃液中的 has_circ_0014717 水平后发现，此环状 RNA 的表达水平在胃癌、胃溃疡及健康对照组胃液中的差异并无统计学意义，仅在慢性萎缩性胃炎患者的胃液中表达显著下调[70]。虽然 Shao 等[70]的研究未成功证明胃液中环状 RNA has_circ_0014717 可作为胃癌的诊断标志物，但却成功证实了环状 RNA 可以稳定在胃液中存在，且可能与慢性萎缩性胃炎的诊断有关，但具体还需进一步研究证实。
2.5 精浆中的环状 RNA 与疾病诊断
Dong 等[71]利用高通量测序鉴定了人类睾丸组织的环状 RNA 表达谱，总共发现 15 996 种环状 RNA，随后他们利用基因分析筛选了与生殖相关的环状 RNA，并在健康成年男性的精浆中也发现了这些与生殖相关的环状 RNA。同时他们发现，精浆中的这些环状 RNA 与蛋白结合形成复合物且性质十分稳定，提示精浆中的相关环状 RNA 可能具有作为生殖相关疾病的生物标志物的潜能，但是尚无与相应疾病相关的确切研究，所以还需要进一步研究。但无论如何，他们的研究为今后男性不育疾病的无创生物标志物的开发奠定了基础。
3 小结与展望
无创的、可以早期诊断疾病或判断疾病病情的诊断手段是目前临床疾病诊疗中所迫切需要的，环状 RNA 因其性质稳定、高表达、可被分泌至体液中等特点，在疾病诊断及预后中具有重要潜力，研究前景广阔。如前述，目前已经有相关研究结果发表，但由于目前关于环状 RNA 的研究尚处于起始阶段，关于体液环状 RNA 与疾病的研究数量少，研究病种单一，有些体液环状 RNA 的研究更是尚无人涉足，目前尚有许多空白需要填补，如尿液中是否有合适的环状 RNA 与泌尿系统各种恶性肿瘤或者慢性肾脏病等疾病的诊断相关、脑脊液中的环状 RNA 检测是否可辅助诊断神经系统疾病、关节液中的环状 RNA 与骨关节疾病的诊断有何关系等。此外，当前已发表的研究也需要继续深入研究，以便成果能够早日应用于临床。
环状 RNA 是一类内源性的、经反向剪接后由 3′端及 5′端共价结合形成的环状 RNA 分子[1]，广泛存在于多种生物体内，具有结构稳定、序列保守、组织细胞特异性等特点。随着高通量测序技术等 RNA 研究技术的飞速发展，环状 RNA 的神秘面纱也在逐渐被人们揭开。环状 RNA 与人类疾病的密切关系正在被人们证实，目前已有研究发现，环状 RNA 与各种肿瘤[2]、心血管疾病[3]、神经系统疾病[4]、骨关节炎[5]、自身免疫性疾病[6-8]等多种疾病相关，环状 RNA 作为生物标志物的潜力也正在被逐步证实。另外，体液检测由于其取材方便、创伤小等特点已被广泛应用于临床。当前已有研究[9]发现，环状 RNA 能经外泌体等途径被分泌到体液中，Memczak 等[10]也报道了在人体血液中检测出了大量环状 RNA，这些都充分说明了体液环状 RNA 作为生物标志物用于疾病诊断等的可能性。当前一些研究成果也证实了这一点。关于体液环状 RNA 检测在疾病诊断、预后等方面应用的研究正在成为环状 RNA 研究领域的新星和热点，笔者现就目前国内外有关体液环状 RNA 在人类疾病诊断方面的研究作一综述。
1 环状 RNA 概述
1.1 环状 RNA 分类
1.1.1 外显子环状 RNA
当前研究发现的大部分环状 RNA 为外显子来源的环状 RNA，即外显子环状 RNA。目前研究发现，外显子环状 RNA 主要通过直接的反式剪接和外显子跳读 2 种机制合成，前者是指外显子下游的 RNA 序列（即 3′ 末端）与上游的 RNA 序列（即 5′ 末端）相结合而形成环状 RNA[11]；后者又称套索驱动环化，是指在转录过程中，不均一核 RNA（hnRNA）部分折叠而拉近非相邻的外显子，从而发生外显子跳读并形成套索结构，套索结构被剪切并发生反向剪接而形成环状 RNA[12]。
1.1.2 内含子环状 RNA
内含子环状 RNA，顾名思义，即来源于内含子的环状 RNA。由于剪接机制不同，内含子可以分为自我剪接内含子、酶促剪接内含子及核 mRNA 内含子，机体内的内含子环状 RNA 则主要来源于自我剪接内含子。相较于外显子环状 RNA，内含子环状 RNA 的数量较少，其保守性亦较低，另外在稳定性、丰度、功能等方面，二者亦不尽相同[12]。
1.1.3 外显子-内含子环状 RNA
外显子-内含子环状 RNA 系指 2 个或 2 个以上外显子环化时，其间的内含子滞留并同时环化而形成的既包含外显子又包含内含子的环状 RNA，主要存在于细胞核中，可调节亲本基因表达[13-14]。
1.2 环状 RNA 的特点
1.2.1 稳定性高
环状 RNA 因其没有 3′ 和 5′ 端结构，且其本身为环状闭合结构，故不易被核酸外切酶作用发生水解[15-16]，所以其在生物体内能稳定存在。研究[12]发现，大多数环状 RNA 的半衰期超过 48 h。
1.2.2 分布广泛
自从 19 世纪 70 年代环状 RNA 在类病毒中被发现，此后的研究分别从真菌、病毒、昆虫、人类细胞等多种生命体中发现了环状 RNA 的存在。已经有大量研究[16-20]证实，环状 RNA 普遍存在于各种原核、真核细胞及病毒中。
1.2.3 具有保守性及组织特异性
已有研究[12, 16]证实，环状 RNA 在不同物种间亦具有保守性。例如，Jeck 等[12]发现，人类成纤维细胞中的 2 121 种环状 RNA 能与小鼠基因组相配，其中 457 个被匹配的小鼠基因组可以产生相同的环状 RNA，这从一个方面体现了环状 RNA 在不同物种间的保守性。而 Memczak 等[16]则发现，小鼠和人体不仅有 82 种相同的环状 RNA，更发现了环状 RNA CDR1as 在脑组织中的表达水平高、而在非神经系统组织中表达水平相对较低的现象，这说明环状 RNA 除了保守性，更存在组织特异性。
1.2.4 高表达
有研究[12, 20-21]发现，部分环状 RNA 相对于其相同来源的线性转录本而言，其表达量高出了十多倍。
1.3 环状 RNA 的作用途径
1.3.1 microRNA 分子的海绵功能
环状 RNA 分子上存在 microRNA 的结合位点，环状 RNA 可以通过与 microRNA 的结合调节下游基因表达，进而发挥相应的生物功能[22]。现有的研究已经发现，多种环状 RNA 具有 microRNA 分子海绵功能，如 CDR1as[23]、circular RNA ITCH[13]等。
1.3.2 调控亲本基因转录
由于环状 RNA 可被视作一种剪接异构体，故其可能通过翻译成功能性蛋白或者减少可被翻译成功能性蛋白的规范化剪接转录本，从而在可变调节水平调节基因转录[24]。
1.3.3 与 RNA 结合蛋白相互作用
环状 RNA 可以与某些功能性蛋白结合，进而发挥生物学功能，例如 RNA 剪切因子 muscleblind-like（MBL）可以促进环状 RNA Mbl（circ Mbl）的环化，而 circ Mbl 也能与 MBL 结合，降低 MBL 的浓度，从而减少 circ Mbl 的合成[25]。
1.3.4 翻译成蛋白质或多肽而发挥作用
目前已有研究[26]发现，环状 RNA 可直接翻译成蛋白质或多肽而发挥其生物学功能。例如，早在 20 世纪 80 年代，Kos 等[26]就发现，丁型肝炎核心的单股负链环状 RNA 可转录翻译成丁型肝炎核心抗原。
2 体液环状 RNA 在疾病诊断中的作用
2.1 外周血环状 RNA 与疾病诊断
外周血血液标本（血浆/血清）采集方便且创伤较小，是目前临床应用得最多的检验标本，血液标本可以提供疾病诊断依据、反映疾病进展过程、辅助判断疾病预后等。目前，通过检测血液标本中的环状 RNA，并判断环状 RNA 与疾病诊断及预后相关性的研究亦不在少数。
2.1.1 外周血环状 RNA 在恶性肿瘤诊断中的作用
2.1.1.1 外周血环状 RNA 与胃肠道恶性肿瘤
Chen 等[27]通过检测 104 例胃癌患者及健康对照者的血清环状 RNA 后发现，胃癌患者血清中 has_circ_0000190 的表达下调，且其表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、TNM 分期及 CA19-9 水平相关，故而推断 has_circ_0000190 可作为胃癌诊断的生物标志物。且在研究中，Chen 等[27]发现，has_circ_0000190 作为胃癌的诊断标志物，其敏感性和特异性均优于 CEA、CA19-9 等常用标志物。此外，Li 等[28]亦发现，胃癌患者术前血清 has_circ_002059 的表达水平低于术后，差异具有统计学意义，且低表达的 has_circ_002059 与胃癌的远处转移及进展分期相关，提示 has_circ_002059 可能为胃癌诊断及预后判断的潜在生物学标志物。Zhao 等[29]也在研究中发现了可以作为胃癌诊断生物标志物的环状 RNA，即 has_circ_0000181。他们在研究中发现，胃癌患者血清中 has_circ_0000181 的表达相较于健康对照明显下降，且低表达的 has_circ_0000181 与肿瘤分化程度及 CEA 水平相关[29]。Huang 等[30]则通过研究发现，相对于健康对照，胃癌患者血浆中的 hsa_circ_0000745 的表达水平明显降低，证明了 hsa_circ_0000745 作为胃癌诊断标志物的可能性。Sun 等[31]则发现，胃癌患者与健康对照相比，其血浆中 hsa_circ_0000520 的表达明显下调，推测其具有作为胃癌诊断非侵入性标志物之潜能。此外，被发现可能具有胃癌非侵入性诊断标志物潜力的环状 RNA 还有 has_circ_00006633，由 Lu 等[32]研究发现。Lu 等[32]发现，胃癌患者血浆中的 has_circ_00006633 的表达水平与正常对照组相比明显下调。目前已有研究[9]发现，结肠癌细胞外泌体中 circRTN4 呈高表达，该结果提示我们，有可能通过检测外周血外泌体中的环状 RNA 来诊断结肠癌。
2.1.1.2 外周血环状 RNA 与肝细胞肝癌（HCC）
Zhang 等[33]发现，HCC 患者血浆中 has_circ_0001445 的转录水平低于肝硬变患者、乙肝患者及健康对照，而且受试者操作特征曲线（ROC）结果亦提示，血浆 has_circ_0001445 可作为一种比较准确的标志物，用以区分 HCC 病例与健康人群、肝硬变或乙肝患者。
2.1.1.3 外周血环状 RNA 与胰腺癌
Li 等[34]发现，转移性胰腺癌患者的血浆外泌体中 circ-IARS 的表达明显上调，且 circ-IARS 高表达与肿瘤血管浸润、肝转移及 TNM 分期相关；生存分析结果则表明，circ-IARS 表达与胰腺癌患者的生存时间呈负相关。这提示，血浆外泌体中的 circ-IARS 可能为胰腺癌早期诊断及预后判断方面的非侵入性生物标志物。此外，Yang 等[35]在其研究中也发现，相对于健康对照来说，胰腺癌患者血浆中 circ-LDLRAD3 的表达显著上调，且与血管、淋巴浸润及转移相关，因而推测 circ-LDLRAD3 可以作为胰腺癌的诊断标志物。Shao 等[36]则发现，对吉西他滨治疗无应答的胰腺导管腺癌患者，其血浆 chr14：101402109-101464448+和 chr14：52729603-52780244+相较于应答患者明显升高；在细胞实验中，他们亦发现，沉默上述 2 种环状 RNA 表达的、对吉西他滨耐药的癌细胞可恢复对吉西他滨的耐药性，而过度表达则会增加对吉西他滨的耐药性。这提示血浆 chr14：101402109-101464448+和 chr14：52729603-52780244+可能作为非侵入性生物标志物，在判断胰腺导管腺癌对吉西他滨耐药方面具有重要应用价值，也提示了此 2 种环状 RNA 作为对吉西他滨耐药的胰腺导管腺癌患者的潜在治疗靶点的可能性。
2.1.1.4 外周血环状 RNA 与乳腺癌
Yin 等[37]通过环状 RNA 的微阵列分析发现，乳腺癌患者相较于健康对照者其血浆环状 RNA 有 19 种表达上调，22 种表达下调；经 RT-PCR 验证发现，has_circ_0001785、has_circ_0108942 和 has_circ_0068033 的表达下调具有统计学意义，其中 has_circ_0001785 的诊断价值优于其他 2 种环状 RNA，且其表达与肿瘤病理分级、TNM 分期及远处转移相关。同时他们[37]发现，has_circ_0001785 的诊断准确性要高于 CEA 和 CA153，且乳腺癌患者术后血清中 has_circ_0001785 的表达水平明显低于术前，这提示 has_circ_0001785 具有乳腺癌诊断标志物的重要作用。
2.1.1.5 外周血环状 RNA 与肺癌
Zhu 等[38]发现，肺腺癌患者血浆中 hsa_circ_0013958 的表达水平明显下调，且与 TNM 分期和淋巴结转移相关，细胞实验亦证实了 hsa_circ_0013958 具有促进肺腺癌细胞增殖浸润和侵袭的作用，并有抑制细胞凋亡的作用。此外，他们的研究[38]还发现，hsa_circ_0013958 是通过作为 mircoRNA-134 海绵并抑制其功能来发挥作用的，而 microRNA-134 则是通过下调细胞周期蛋白 D1（CCND1）来发挥对非小细胞肺癌的抑癌作用，因而，Zhu 等[38]推测，mircoRNA-134 可能是通过 microRNA-134-CCND1 通路来发挥作用的。他们的研究结果显示了 has_circ_0013958 作为肺腺癌早期诊断及筛查的重要非侵入性生物标志物的可能性。另外，Hang 等[39]研究发现，非小细胞肺癌患者血清中 circFARSA 的表达上调，通过细胞实验他们还证实了 circFARSA 对细胞侵袭及迁移的促进作用。他们的研究[39]同时也表明，circFARSA 可能通过作为 microRNA-330-5P 和 microRNA-326 海绵，通过减轻二者对癌基因脂肪酸合成酶的抑制作用而发挥作用。这为血浆 circFARSA 作为非小细胞肺癌非侵入性生物标志物提供了证据。
2.1.1.6 外周血环状 RNA 与子宫内膜癌
Xu 等[40]检测了 10 例 Ⅲ 期子宫内膜癌患者血浆外泌体中的环状 RNA，并与健康者对照，发现共有 275 种环状 RNA 的差异存在统计学意义，其中 209 种表达上调，66 种表达下调。经进一步筛选及验证发现，hsa_circ_ 0109046 和 hsa_circ_0002577 这 2 种环状 RNA 的表达水平在子宫内膜癌患者的血清外泌体中显著上升，提示其作为子宫内膜癌的血液诊断标志物之可能。
2.1.2 外周血环状 RNA 在心血管疾病诊断中的作用
2.1.2.1 外周血环状 RNA 与冠心病及心肌梗塞
Zhao 等[41]通过对冠心病患者和健康对照患者血清中的环状 RNA 进行 RNA 微阵列分析发现，冠心病患者的血清环状 RNA 相较于健康对照有 12 种上调，10 种下调，随后经过进一步筛选并扩大样本量验证后发现，冠心病患者血清中明显上调的 hsa_circ_0124644 具有最高的灵敏度和特异度，且其联合同样在冠心病患者血清中表达上调的 hsa_circ_0098964 后，对冠心病具有更高的诊断价值。Deng 等[42]通过环状 RNA 微阵列分析比较了急性心肌梗塞患者与健康对照者的血浆环状 RNA 谱，共有 7 326 种环状 RNA 被检测到，有 160 种环状 RNA 在急性心肌梗塞患者组与健康对照组之间的差异存在统计学意义，其中 73 种表达上调，87 种表达下调；经过进一步筛选发现，circRNA-081881 在急性心肌梗塞患者血浆标本中的表达水平相较于健康对照组明显降低了 12.5 倍，提示 circRNA-081881 具有作为急性心肌梗塞诊断标志物的潜力。Salgado-Somoza 等[43]检测了 472 例急性心肌梗塞患者在心肌再灌注时环状 RNA MICRA 的表达水平，并用心脏彩超评估了 4 个月后患者的左室射血分数（EF）值，依据欧洲心脏病学会（ESC）心力衰竭指南将患者分为 EF 降低组（rEF 组）、中值 EF 组（mrEF 组）及保留 EF 组（pEF 组），经过分析比较发现，rEF 组患者全血标本中环状 RNA MICRA 的表达水平较 mrEF 组及 pEF 组明显降低，而 mrEF 组与 pEF 组之间比较差异无统计学意义。这提示了环状 RNA MICRA 作为心肌梗塞患者预后生物标志物的重要潜力。
2.1.2.2 外周血环状 RNA 与心力衰竭
除了前文提及的全血标本环状 RNA MICRA 可能在预测急性心肌梗塞患者 EF 值降低方面具有重要潜力外，目前尚无其他确切环状 RNA 在外周血中被发现可作为心力衰竭诊断的标志物，但环状 RNA 研究整体尚处于初始阶段。由于环状 RNA 的性质稳定等特点，外周血环状 RNA 作为心力衰竭诊断标志物的研究前景仍光明。
2.1.2.3 外周血环状 RNA 与高血压
Bao 等[44]通过微阵列分析比较了原发性高血压患者与健康对照组全血标本中环状 RNA 的表达水平，通过验证筛选并进一步分析发现，在原发性高血压患者全血标本中 has_circ_0037911 的表达明显上调，且与血肌酐水平相关，推测 has_circ_0037911 可能在原发性高血压的发病中起重要作用，且是高血压临床预测和诊断的潜在生物标志物。另外，Wu 等[45]通过环状 RNA 微阵列分析比较了高血压患者和健康对照者血浆中环状 RNA 的表达差异，发现高血压患者血浆中的环状 RNA 相对于健康对照有 13 种表达下调，46 种表达上调，其中 has_circ_0000437、has_circ_0008139、has_circ_0005870 和 has_circ_0040809 的表达水平在 2 组间的差异有统计学意义；经过进一步验证发现，has_circ_0005870 在高血压患者血浆中的表达明显下调，提示其可能是诊断高血压的一种新型生物标志物。
2.1.3 外周血环状 RNA 在神经系统疾病诊断中的作用
Zhao 等[46]使用微阵列分析比较了烟雾病和健康对照者血液标本的环状 RNA，发现 2 组之间存在差异性表达的环状 RNA 有 146 种，其中 29 种表达上调，117 种表达下调；经过 RT-PCR 验证后，他们发现，烟雾病患者相对于健康对照者其血液标本中上调最显著的 3 种环状 RNA 分别是：has_circ_062557、has_circ_067130 和 has_circ_067209，下调最显著的 3 种环状 RNA 分别是：has_circ_100914、has_circ_089761 和 has_circ_089763，提示这 6 种环状 RNA 可能是烟雾病诊断的重要生物学标志物。Han 等[47]利用微阵列分析分析了大鼠脑卒中模型脑组织中环状 RNA 的表达，并且进一步筛选验证出了表达明显上调的环状 RNA Hectd1；之后在人类脑卒中患者血浆中的研究结果也表明，Hectd1 的表达显著上调。分析机制可能是，Hectd1 作为内源性的 microRNA142 海绵来抑制 microRNA142 的活性，从而抑制了 TCDD 诱导的 ADP 多聚核糖聚合酶（TIPARP）的表达，进而抑制星形胶质细胞的自噬[47]。推测 Hectd1 可能参与脑卒中的发生发展，并可作为其诊断的生物标志物及治疗的靶点。
2.1.4 外周血环状 RNA 在自身免疫性疾病诊断中的作用
2.1.4.1 外周血环状 RNA 与系统性红斑狼疮（SLE）
Zhang 等[48]在其研究中，首先对 4 例 SLE 患者和 4 例健康对照患者的血浆样品进行了 circRNA 芯片检测，共鉴定出 4 763 种环状 RNA，其中在 2 组之间表达差异具有统计学意义的共有 112 种（53 种表达上调，59 种表达下调）。随后，他们筛选出了 3 种表达上调或下调最明显的环状 RNA，即 has_circRNA_407176、has_circRNA_406567 及 has_circRNA_001308，并利用 122 例 SLE 患者和 102 名健康对照组的血浆样本，以及 26 例 SLE 患者和 26 名健康对照组的外周血单核细胞样本对实验结果进行了验证，最终发现，SLE 患者血浆标本及外周血单核细胞标本中的 has_circRNA_407176 和 has_circRNA_001308 的表达水平较健康对照均明显下调，但 has_circRNA_406567 的验证结果无统计学差异。因而推论，has_circRNA_407176 和 has_circRNA_001308 可能是 SLE 的外周血生物标志物。Li 等[8]则利用环状 RNA 微阵列技术检测了 SLE 患者与健康对照者的血清环状 RNA，鉴定出了 207 种差异表达的环状 RNA（113 种表达上调，94 种表达下调），经过进一步筛选验证发现，has_circ_102584、hsa_circ_400011 和 hsa_circ_101471 在 SLE 患者血清中的表达水平显著下降，而 hsa_circ_100226 的表达则显著上调。此外，还有研究[49]发现，SLE 患者外周血单核细胞中 hsa_circ_0049224 和 has_circ_0049220 的表达水平显著低于健康对照，且上述 2 种环状 RNA 的表达水平与 SLE 活动水平呈负相关。
2.1.4.2 外周血环状 RNA 与多发性硬化症
Iparraguirre 等[50]对多发性硬化症患者的外周血白细胞进行了环状 RNA 微阵列分析，并与健康者进行对照，确定了多发性硬化症患者外周血白细胞的环状 RNA 表达谱，共有 13 617 种环状 RNA，且发现 2 组之间有 406 种环状 RNA 存在表达差异；经过进一步筛选验证，发现 circ0005402 和 circ0035560 在多发性硬化症患者外周血标本中的表达水平显著降低，此 2 种环状 RNA 可作为多发性硬化症诊断的生物学标志物。
2.1.4.3 外周血环状 RNA 与类风湿性关节炎
Ouyang 等[51]使用环状 RNA 微阵列分析分析了 4 例类风湿性关节炎患者及健康对照外周血白细胞的环状 RNA 表达谱，发现类风湿性关节炎患者中有9 种环状 RNA 表达上调，3 种表达下调；经进一步筛选并在 30 例类风湿性关节炎患者及 25 份健康对照标本中进行验证分析，发现 circRNA_104871、circRNA_003524、circRNA_101873 和 circRNA_103047 在类风湿性关节炎及健康对照外周血白细胞中的表达具有显著差异且有诊断价值，其中 ROC 结果提示 circRNA_104871 的诊断价值最高。此外，Luo 等[52]的研究发现，外周血 has_circ_0044235 可能是类风湿性关节炎的诊断标志物。Zheng 等[7]在其研究中也发现了在类风湿性关节炎患者及健康对照者外周血单核细胞中表达具有显著差异的 5 种环状 RNA，其中 4 种表达上调：has_circRNA_104194、has_circRNA_103334、has_circRNA_104593 和 has_circRNA_101407；1 种表达下调：has_circRNA_102594。
2.1.4.4 外周血环状 RNA 与原发性胆汁性胆管炎
Zheng 等[53]使用环状 RNA 微阵列分析鉴定了 6 例原发性胆汁性胆管炎患者及 6 位健康对照者血浆标本的环状 RNA 表达谱，共有 7 344 种环状 RNA 被鉴定出，其中 2 组间差异有统计学意义的共有 22 种（18 种表达上调，4 种表达下调）；随后他们进行进一步筛选、增加样本量并使用 RT-PCR 进行验证以及进行 ROC 分析，最终确定了曲线下面积（AUC）较高、P值较低且表达水平较高的 hsa_circ_402458，作为原发性胆汁性胆管炎的最佳生物标志物。
2.1.5 外周血环状 RNA 在糖尿病及糖尿病相关性疾病诊断中的作用
2.1.5.1 外周血环状 RNA 与糖尿病
Zhao 等[54]在其研究中使用微阵列分析对 6 例 2 型糖尿病患者及 6 例健康对照的血浆标本进行了环状 RNA 微阵列分析，共发现 489 种在 2 组之间表达差异具有统计学意义的环状 RNA，其中有 78 种表达上调，411 种表达下调；随后经过筛选，在扩大样本量的 2 型糖尿病患者、糖尿病前期人群及健康对照组 3 组中进行了验证及分析，发现 has_circ_0054633 对糖尿病前期及 2 型糖尿病具有一定的诊断能力，具有作为二者血浆诊断标志物的潜力。此外，Li 等[55]则在其研究中通过分析冠心病患者、糖尿病患者、糖尿病合并冠心病患者及健康对照者的血浆环状 RNA，发现在上述 3 种患者血浆中显著下调的 has_circRNA_11783-2 与糖尿病及冠心病关系密切。
2.1.5.2 外周血环状 RNA 与糖尿病视网膜病变
Zhang 等[56]首先鉴定了糖尿病视网膜病变患者和非糖尿病个体视网膜的环状 RNA 表达谱，然后进一步筛选并分析验证得出，circ_0005015 在糖尿病视网膜病变患者的病变视网膜组织中表达明显上升，且对糖尿病视网膜病变具有一定的诊断价值。随后他们检测了正常人、白内障患者及糖尿病视网膜病变患者血浆中 circ-0005015 的表达水平，发现糖尿病视网膜病变患者血浆中 circ-0005015 的表达水平明显高于其他 2 组；另外他们还发现，circ_0005015 可能通过调控人视网膜微血管内皮细胞（HRVEC）的功能参与糖尿病视网膜病变的发病机制[56]。他们的研究证明了，circ_0005015 是一种很有前途的可以用于糖尿病视网膜病变诊断和预后的生物标志物，并且可以促进视网膜内皮血管生成。而在另一项研究中，Gu 等[57]则直接鉴定了糖尿病视网膜病变患者、单纯糖尿病无视网膜病变患者及健康对照者的环状 RNA 表达谱，发现糖尿病视网膜病变患者与单纯糖尿病患者及健康对照之间共有 32 种环状 RNA 的表达差异具有统计学意义，且这 32 种环状 RNA 在糖尿病视网膜患者血清中的表达均上调。
2.1.5.3 外周血环状 RNA 与 2 型糖尿病患者慢性感染
Fang 等[58]在其研究中鉴定了 2 型糖尿病患者与健康对照者外周血白细胞的环状 RNA 表达谱，发现 2 组之间有 220 种环状 RNA 的表达存在差异，其中 107 种表达上调，113 种表达下调。经过筛选验证，发现 2 型糖尿病患者外周血白细胞中 circANKRD36 的表达水平相对于健康对照明显上升，且其表达水平与糖化血红蛋白及白介素 6 水平呈正相关，因而推论，circANKRD36 可以作为筛查 2 型糖尿病患者慢性炎症的潜在生物标志物。
2.1.5.4 外周血环状 RNA 与 2 型糖尿病合并抑郁症
当前已有研究[59-61]发现，2 型糖尿病和抑郁症之间有密切联系。基于此，Jiang 等[62]利用环状 RNA 微阵列分析检测了合并抑郁症的 2 型糖尿病患者及单纯 2 型糖尿病患者全血标本的环状 RNA 表达谱，结果发现，合并抑郁症的 2 型糖尿病患者与单纯2 型糖尿病患者相比，其血液标本中有 183 种环状 RNA 表达上调，64 种表达下调；经过进一步筛选验证，确定了 4 种在 2 组之间表达具有显著差异且经 QT-PCR 验证与微阵列分析结果一致的环状 RNA，分别是 has_circRNA_003251、has_circRNA_015115、has_circRNA_100918 和 has_circRNA_001520；其后，他们进一步筛选了以上 4 种环状 RNA 可以靶向调节的 microRNA，并研究了其可能的作用通路，结果显示，以上 4 种环状 RNA 可能通过参与甲状腺激素、Wnt、ErbB 和丝裂原活化蛋白激酶信号通路而发挥作用。
2.1.6 外周血环状 RNA 在其他疾病诊断中的作用
2.1.6.1 外周血环状 RNA 与活动性肺结核
Huang 等[63]鉴定了 3 例活动性肺结核患者及 3 例健康对照者外周血单核细胞的环状 RNA 表达谱，发现共有 37 种差异表达的环状 RNA，其中 13 种表达上调，24 种表达下调。随后在表达上调和下调的环状 RNA 中分别选择了最显著的 3 种：即 hsa_circRNA_001937、hsa_circRNA_009024、hsa_circRNA_005086 和 hsa_circRNA_102101、hsa_circRNA_104964、hsa_circRNA_104296；之后扩大样本量进行验证，并检测了其诊断价值及诊断的敏感性及特异性，结果提示，hsa_circRNA_001937的诊断敏感性及特异性最高，最具诊断价值，且其与 hsa_circRNA_009024 联合时诊断的准确性更高。该研究结果提示，外周血 hsa_circRNA_001937 是一个很有潜力的活动性肺结核的诊断标志物。外周血环状 RNA 在活动性肺结核诊断中的重要潜力在 Qian 等[64]的研究中亦得到了证实。此外，Zhang 等[65]利用全转录组测序分析了 3 例肺结核患者及 3 例健康对照者的外周血环状 RNA 的表达情况，共鉴定出 16 288 种环状 RNA，其中 170 种环状 RNA 表达在 2 组之间存在显著差异（有 102 种环状 RNA 在肺结核患者外周血中表达上调，68 种表达下调），进一步筛选出的 hsa_circRNA_14623、hsa_circ_09585、hsa_circ_005538、hsa_circ_09993、hsa_circ_13478 和 hsa_circ_00074 经 QT-PCR 验证结果与测序结果一致，可能的信号通路也在该研究中被分析。这提示环状 RNA 作为肺结核血液标志物的重要潜能及其在肺结核病理生理中可能发挥重要作用。
2.1.6.2 外周血环状 RNA 与子痫前期
Jiang 等[66]首次通过环状 RNA 微阵列分析鉴定了子痫前期孕妇和健康对照孕妇外周血细胞的环状 RNA 谱，结果发现，子痫前期孕妇和健康对照孕妇外周血细胞中共有 5 396 种环状 RNA 被鉴定，其中有显著差异的环状 RNA 有 2 178 种（子痫前期孕妇外周血相对于健康对照者表达上调的环状 RNA 有 1 294 种，表达下调的有 884 种）；经筛选及进一步验证，他们确定了在子痫前期孕妇外周血中表达显著上调的2 种环状 RNA，即 has_circ_0004904 和 has_circ_0001855，提示此 2 种环状 RNA 对于子痫前期具有诊断价值；此外，他们还发现，上述 2 种环状 RNA 可能上调妊娠相关血浆蛋白 A（PAPP-A）的表达水平，且上述 2 种环状 RNA 合并 PAPP-A 对子痫前期具有更好的诊断价值。
2.1.6.3 外周血环状 RNA 与慢性髓系白血病
Liu 等[67]在其研究中利用高通量测序技术鉴定了慢性髓系白血病患者及健康对照者的外周血环状 RNA 表达谱，且经筛选验证分析发现，相较于健康对照，慢性髓系白血病患者外周血中 has_circ_0080145 的表达水平明显上调，且功能实验等结果证明，敲低 has_circ_0080145 会显著抑制慢性髓系白血病细胞增殖，且其可能是通过作为 microRNA-29b 海绵来发挥作用的。他们的研究提示，has_circ_0080145 可能是慢性髓系白血病重要的诊断和预后标志物及潜在的治疗靶点。
2.2 唾液中的环状 RNA 与疾病诊断
唾液因其取材方便、快捷、廉价、取材过程无创等优点，近年来越来越被视作疾病研究中的理想的体液标本。关于唾液中的疾病标志物的研究越来越多，唾液中环状 RNA 的研究也正在兴起，环状 RNA 因其稳定性高等特点正被越来越多的研究证实其作为疾病生物标志物的重要作用。
Zhao 等[68]通过微阵列分析方法鉴定了 3 例口腔鳞状细胞癌患者和 3 例健康对照者唾液中的环状 RNA 表达谱，发现有 32 种环状 RNA 在 2 组之间的表达存在差异，其中有 12 种环状 RNA 在口腔鳞癌患者唾液中的表达相对于健康对照上调，20 种下调。随后他们选择了上调最显著的 3 种环状 RNA（hsa_circ_0001874、hsa_circ_0001971 和 hsa_circ_0008068）和下调最显著的 3 种（hsa_circ_0000140、hsa_circ_0002632 和 hsa_circ_0008792）进行进一步验证分析，发现 qRT-PCR 验证结果与微阵列分析结果一致。ROC 分析则显示，上述 6 种环状 RNA 均对口腔鳞癌具有诊断价值，其中 hsa_circ_0001874 的AUC值最高，且 hsa_circ_0001874 与 hsa_circ_0001971 联合后的诊断准确度更高。在对以上 6 种环状 RNA 与口腔鳞癌患者的临床特征进行分析后发现，has-circ-0001874 与肿瘤 TNM 及病理分级相关，has-circ-0001971 与 TNM 分期相关，其余环状 RNA 与临床特征无关。此外，研究者还对比了口腔鳞癌患者术前 1 个月与术后 1 个月唾液中 hsa_circ_0001874 与 hsa_circ_0001971 的表达水平，发现术后 1 个月上述 2 种环状 RNA 在口腔鳞癌患者唾液中的表达水平较术前 1 个月明显减低。Zhao 等[68]通过上述研究向人们证实了唾液环状 RNA 在口腔鳞癌的诊断及预后中的重要潜力。这也为更多的关于唾液环状 RNA 与人类疾病关系的研究奠定了基础。
2.3 尿液中的环状 RNA 与疾病诊断
尿液是人体的重要排泄物，泌尿系统的多种疾病都会在尿液中有所体现，而尿液本身因其取材方便快捷、方法简单廉价等优点在临床应用广泛。除了尿液临床指标检测有助于泌尿系统疾病的诊断和病情判断外，尿液中的非编码 RNA 这类重要的生物分子，目前业已有研究[69]发现其具有疾病诊断及预后相关的潜力。
Chen 等[69]利用环状 RNA 微阵列分析方法鉴定了膀胱尿路上皮癌和癌旁组织中的环状 RNA 表达谱，经过分析验证发现，环状 RNA circPRMT5 的表达在癌组织中显著上调；随后又检测了膀胱尿路上皮癌患者血清及尿液外泌体中的 circPRMT5，发现与健康对照相比，膀胱尿路上皮癌患者的血清及尿液外泌体中 circPRMT5 的表达显著上调，且与肿瘤淋巴结转移及进展相关，提示血清及尿液中的外泌体环状 RNA circPRMT5 具有作为膀胱尿路上皮癌诊断及预后生物标志物的重要潜能。
2.4 胃液中的环状 RNA 与疾病诊断
Shao 等[70]在其研究中，利用环状 RNA 微阵列分析鉴定了胃癌及癌旁组织中的环状 RNA 谱，经进一步研究发现，hsa_circ_0014717 在胃癌组织中的表达水平明显下调，且与胃癌肿瘤分期、远处转移、CEA 水平及 CA19-9 水平相关，但与淋巴结转移等其他临床特征无关。同时他们发现，hsa_circ_0014717 可以在胃液中稳定存在，但是在比较了胃癌患者、胃溃疡患者、慢性萎缩性胃炎患者及健康对照者胃液中的 has_circ_0014717 水平后发现，此环状 RNA 的表达水平在胃癌、胃溃疡及健康对照组胃液中的差异并无统计学意义，仅在慢性萎缩性胃炎患者的胃液中表达显著下调[70]。虽然 Shao 等[70]的研究未成功证明胃液中环状 RNA has_circ_0014717 可作为胃癌的诊断标志物，但却成功证实了环状 RNA 可以稳定在胃液中存在，且可能与慢性萎缩性胃炎的诊断有关，但具体还需进一步研究证实。
2.5 精浆中的环状 RNA 与疾病诊断
Dong 等[71]利用高通量测序鉴定了人类睾丸组织的环状 RNA 表达谱，总共发现 15 996 种环状 RNA，随后他们利用基因分析筛选了与生殖相关的环状 RNA，并在健康成年男性的精浆中也发现了这些与生殖相关的环状 RNA。同时他们发现，精浆中的这些环状 RNA 与蛋白结合形成复合物且性质十分稳定，提示精浆中的相关环状 RNA 可能具有作为生殖相关疾病的生物标志物的潜能，但是尚无与相应疾病相关的确切研究，所以还需要进一步研究。但无论如何，他们的研究为今后男性不育疾病的无创生物标志物的开发奠定了基础。
3 小结与展望
无创的、可以早期诊断疾病或判断疾病病情的诊断手段是目前临床疾病诊疗中所迫切需要的，环状 RNA 因其性质稳定、高表达、可被分泌至体液中等特点，在疾病诊断及预后中具有重要潜力，研究前景广阔。如前述，目前已经有相关研究结果发表，但由于目前关于环状 RNA 的研究尚处于起始阶段，关于体液环状 RNA 与疾病的研究数量少，研究病种单一，有些体液环状 RNA 的研究更是尚无人涉足，目前尚有许多空白需要填补，如尿液中是否有合适的环状 RNA 与泌尿系统各种恶性肿瘤或者慢性肾脏病等疾病的诊断相关、脑脊液中的环状 RNA 检测是否可辅助诊断神经系统疾病、关节液中的环状 RNA 与骨关节疾病的诊断有何关系等。此外，当前已发表的研究也需要继续深入研究，以便成果能够早日应用于临床。