引用本文： 赵斌, 张覃, 李庄, 张本斯, 李艳娇, 黄煜. 分泌 EphrinAl-Caspase-3 的 T 淋巴细胞抑制乳腺癌细胞生长的动物研究. 中国普外基础与临床杂志, 2019, 26(3): 288-293. doi: 10.7507/1007-9424.201811027 复制
目前公认，人乳腺癌不是单一的疾病，而是在多种致癌因子作用下，发生基因突变，致使细胞增生失控的恶性肿瘤[1-7]。2016 年女性中最常见的癌症是乳腺癌，预计在不久的将来，乳腺癌将约占女性所有新诊断癌症的 29%[8]。由于早期诊断的进步和更有效的治疗方法，乳腺癌成为慢性疾病而不是威胁生命的疾病。尽管乳腺癌的综合治疗取得长足的进步，但其发病率高、侵袭性强、极易复发和转移。靶向治疗是继手术、放疗及化疗三大传统治疗手段之外的治疗方法，已成为研究热点。目前临床上传统的化学治疗有选择性差、毒副反应大、易耐药等缺点，而靶向治疗乳腺癌能最大限度地降低并发症发生率，改善患者的生活质量，具有安全、可靠及高效的特点。本研究通过将分泌 EphrinAl-Caspase-3 的淋巴细胞作用于荷瘤动物，对其肿瘤生长情况以及 EphrinAl-Caspase-3 和 Ki-67 的表达情况进行研究，希望对以后乳腺癌的靶向治疗及预后评估提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验动物
实验用健康 6 周龄的 BALB/c 雌性裸鼠 35 只，由昆明医科大学呈贡校区医学实验学部提供，动物使用许可证号：SCXK（滇）K2015-0002。所选实验用裸鼠于实验动物中心动物房中、在无特定病原体条件下饲养。
1.2 主要材料和试剂
主要材料：单层培养的 EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴细胞（前期实验备置，实验室保存）、未感染腺病毒的 T 淋巴细胞和酪氨酸激酶 EphrinA2 受体（EphA2）阳性乳腺肿瘤细胞 ［前期分离培养的人乳腺癌细胞 EphA2 鉴定为阳性，实验室保存］。主要试剂：胰酶、PBS、RIPA 裂解液 ［含苯甲基磺酰氟（ PMSF）］、3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺（TMB）、OCT 包埋剂、生物素化抗体工作液和非免疫正常山羊血清（购于索莱宝公司）；雌二醇（98%，E808987，购于麦克林公司）、Matrige 胶（购于 Corning 公司）、Caspase-3 和 Ki-67 的一抗（购于 biopsydig 公司）及异硫氰酸荧光素（FITC）标记的二抗工作液（购于 ABnerve 公司）。
1.3 方法
1.3.1 裸鼠乳腺癌模型的建立
取对数生长期的单层培养的 EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴细胞以 0.25% 胰酶消化后，用 PBS 洗 2 次，细胞计数后制备成细胞悬液 100 μL（含 5×106 个细胞）。分离培养的人乳腺癌细胞，经EphA2 鉴定为阳性乳腺癌细胞后，取对数生长期细胞制作成细胞悬液（1×105 个/mL），计算活细胞数，再用生理盐水稀释至所需浓度（细胞数多为 1×106 个/mL ～1×107 个/mL）。将其与 Matrige 胶和雌激素混合，按每只雌性裸鼠 0.2 mL 注射（含 1×107 个细胞），缓慢注入裸鼠的左乳腺脂肪垫内。操作中要使细胞积聚成团，在皮下要形成皮丘。裸鼠于实验动物中心动物房中、无特定病原体条件下饲养，同时观察动物的神态、进食和活动状态。
1.3.2 荷瘤动物的治疗
乳腺癌细胞接种至裸鼠1 周后，可见肿瘤体积达到 0.1 cm3 左右大小，表示成瘤（接种了 35 只小鼠，其中 31 只成瘤，选择肿瘤大小均一的 30 只）。将 30 只荷瘤鼠按随机数字表随机分为 3 个组，每组 10 只裸鼠：PBS 组、未感染腺病毒组（阴性对照组）以及感染 EphrinAl-Caspase-3 的 T 淋巴细胞组（感染组）。随机分组完成后，将 T 淋巴细胞接种于 T75 细胞培养瓶中，以感染复数（MOI）为 800 的 pAd-EphrinAl-Caspase-3 病毒液感染 T 淋巴细胞（操作按试剂盒说明书进行），3 d 后收集细胞，即 EphrinAl-Caspase3-T 淋巴细胞。PBS 组裸鼠瘤内注射 PBS 溶液，阴性对照组裸鼠瘤内注射 1×106 个未感染腺病毒的 T 淋巴细胞，感染组裸鼠瘤内注射 1×106 个 EphrinAl-Caspase3-T 淋巴细胞，体积均是 10 μL。
1.3.3 荷瘤动物的肿瘤生长状况观察
3 组（n=5，随机取其中 5 只）荷瘤裸鼠接受不同的 T 淋巴细胞（或 PBS 液）移植治疗后，每隔 3 天用游标卡尺测量肿瘤的大小（0、3、6、9、12 及 15 d），肿瘤体积（cm3）=长（cm）×宽（cm）2/2。以各时间点的平均瘤体积绘制 3 组大鼠的生长曲线图。实验结束时荷瘤裸鼠断颈处死。
1.3.4 肿瘤组织的病理学检查
实验结束后 3 组裸鼠被断颈处死（用于生存曲线绘制的 5 只裸鼠），剥离肿瘤，将肿瘤组织于 4% 多聚甲醛中固定 48 h 后分别转入 15% 和 30% 的蔗糖溶液中脱水，脱水完成后以 OCT 包埋（冰冻切片包埋），于–20 ℃ 恒温箱中切片，在荧光显微镜下观察表达绿色荧光蛋白的 T 淋巴细胞的存在。此外，将固定好的肿瘤组织常规切片，65 ℃ 烤片 2 h 后，二甲苯（Ⅰ）中脱蜡 10 min，再于二甲苯（Ⅱ）中脱蜡 10 min；100% 乙醇（Ⅰ）中 5 min 以洗去二甲苯，100% 乙醇（Ⅱ）中 5 min 洗去二甲苯；95% 乙醇中水化 5 min，85% 乙醇中水化 5 min，75% 乙醇中水化 5 min，蒸馏水中水化待用；使用 0.01 mol/L 柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复，将修复好的切片用 PBS 液清洗 2 次，每次各 5 min；然后滴加非免疫正常山羊血清 100 μL 进行封闭，室温孵育 60 min；用移液枪吸去封闭液，然后分别滴加 Caspase-3 和 Ki-67 的一抗，4 ℃ 孵育过夜。PBS 液充分清洗 4 次，每次 5 min；滴加 FITC 标记的二抗工作液 100 μL，室温孵育 15 min；PBS 液充分淋洗 4 次，各 5 min；在石蜡切片的中央滴加适量中性树胶，盖上盖玻片封固后以荧光显微镜观察。
1.3.5 肿瘤组织中 EphrinAl-Caspase-3 的含量检测
3 组内剩余的 5 只裸鼠经上述的细胞移植后，分别在 3、6、9、12 及 15 d 获取裸鼠皮下肿瘤组织匀浆，行 ELISA 检测 EphrinAl-Caspase-3 的含量。首先将少量组织块（100 mg）置于 2 mL 匀浆器中球状部位，用剪刀将组织块剪碎，加 400 μL 单去污剂裂解液裂（RIPA 裂解液）于匀浆器中进行匀浆。裂解 30 min 后，用移液器将裂解液移至 1.5 mL 离心管中，并在 4 ℃ 下 12 000 r/min 离心 5 min（r=10 cm），取上清进行检测或是置于 –20 ℃ 保存。将标准品工作液依次加入到酶标板的前 2 列孔中，每个浓度的工作液并列加 2 孔，每孔 100 μL；待测样品加入到其他孔，每孔 100 μL。给酶标板覆膜，37 ℃ 孵育 90 min。弃去液体，甩干，不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液 100 μL，混匀；酶标板加上覆膜，37 ℃ 温育 1 h。甩尽孔内液体，每孔加洗涤液 350 μL，浸泡 2 min，甩掉酶标板内的液体，厚吸水纸上拍干。重复此洗板步骤 3 次。每孔加酶结合物工作液 100 μL，加上覆膜，37 ℃ 温育 30 min。弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次。每孔加 90 μL 底物溶液（TMB），酶标板加上覆膜、37 ℃ 避光孵育 15 min。每孔加终止液 50 μL，终止反应。立即用酶标仪在 450 nm 波长测量各孔的光密度（A）值，根据样品 A 值，计算样品滴度。
1.4 统计学方法
本实验数据的统计分析使用 SPSS 20.0 统计软件进行。统计方法采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 方法。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 荷瘤鼠的肿瘤生长状况
乳腺癌细胞接种裸鼠 1 周后可触及皮下肿瘤，测得 3 组裸鼠不同时间点的肿瘤体积（图 1a）。总体而言，PBS 组和阴性对照组裸鼠的肿瘤体积增长较快且两组间的差异不大；而感染组裸鼠的肿瘤生长总体平稳、其增长速度低于 PBS 组和阴性对照。第 0 天和第 3 天时，3 组裸鼠的肿瘤体积比较差异均无统计学意义（P>0.05）；第6 天时 3 组的肿瘤体积差异变大，感染组和 PBS 组/阴性对照组比较差异均有统计学意义（P=0.002，P=0.036），随后感染组和 PBS 组/阴性对照组的肿瘤体积差异进一步变大，且随着时间的延长越来越明显，但各时点 PBS 组和阴性对照组的肿瘤体积比较差异均无统计学意义（P>0.05）。实验结束后剥离 3 组裸鼠的肿瘤，结果感染组的肿瘤体积与 PBS 组/阴性对照组相比明显缩小（图 1b–1d）。
图1
示 3 组裸鼠肿瘤体积变化及大体外观，以及示 3 组肿瘤组织中的 EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴细胞分布、Caspase-3 阳性细胞及 Ki-67 阳性细胞情况（免疫荧光染色 ×100）
a：3 组裸鼠肿瘤体积的变化趋势，与其余2组比较，*
2.2 肿瘤组织的病理学检查结果
在荧光显微镜下观察到，感染组裸鼠的肿瘤组织中可见到散在的绿色荧光蛋白标记的 EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴细胞的存在，而在 PBS 组和阴性对照组裸鼠的肿瘤组织中则均没有检测到绿色荧光蛋白的存在（图 1e–1g）。肿瘤组织的免疫荧光检测结果显示，感染组相对于阴性对照组或 PBS 组，其Caspase-3 阳性细胞比例较高（图 1h–1j），Ki-67 阳性细胞比例较低（图 1k–1m）。
2.3 肿瘤组织中 EphrinAl-Caspase-3 的滴度检测
感染组裸鼠肿瘤组织中在第 3 天就可以检测到 EphrinAl-Caspase-3 的表达，在第 6 天时达到高峰，随后分泌量逐渐降低（图 2）；PBS 组和阴性对照组裸鼠肿瘤组织中各时点均没有检测到 EphrinAl-Caspase-3 的表达。
图2
不同时间点 EphrinAl-Caspase-3 在感染组肿瘤组织中的表达
3 讨论
乳腺癌是危害妇女健康的最常见的恶性肿瘤之一。随着乳腺癌的临床管理显著改善，近年来乳腺癌诊断率较前提高。尽管如此，乳腺癌仍是全球女性担心的重点问题[9]。虽然乳腺癌是大多数女性最害怕的疾病，但它并不是女性死亡的主要原因。乳腺癌患者的存活率在过去的 20 年中急剧提升，这主要是由于乳腺摄影筛查技术的早期检测、患者意识的提高以及更有效的治疗方式所致[10]。
虽然目前新旧多种抗肿瘤药物的开发及应用显著提高了乳腺癌的生存率，但是使用化学治疗剂有可能引起心血管并发症，其中以心脏衰竭（CHF）、心肌缺血及高血压较为常见[11-15]。多项研究[16-19]表明，当曲妥珠单抗纳入治疗方案时，人类表皮生长因子-2（HER-2）阳性患者的死亡率降低，总生存（OS）率增加；曲妥珠单抗的最严重的并发症是其潜在心脏毒性，然而其心脏毒性的确切机制仍不清楚。因此，研究开发对乳腺癌抗癌活性强、低甚至无毒副作用的新制剂是大势所趋。
人 Caspase-3 基因位于 4q33-q35.1 上，具有2 635 个碱基对，7 个外显子。它选择性剪接产生2 种转录物，即 Caspase-3 和 Caspase-3s，其中 Caspase-3 是 Caspase 家族中最重要的凋亡执行者之一，它可激活脱氧核糖核酸酶（CAD），继而引起细胞核浓缩及 DNA 裂解，使细胞发生凋亡。在许多肿瘤细胞的凋亡中发现有 Caspase 的活化。目前也已经采用一系列新的与 Caspase 有关的诱导凋亡的方法来治疗肿瘤。酪氨酸激酶蛋白家族与许多类型癌症相关联，包括前列腺癌、肺癌、食管癌、黑色素瘤、白血病、结直肠癌、宫颈癌、卵巢癌和乳腺癌[20-21]。此外，在乳腺癌中跨膜 Eph 受体 EphA2 的亚类呈过表达[22]。本实验的目标是通过与 EphrinAl（一种 EphA2 受体的天然配体）偶联的 Caspase-3，诱导癌变细胞再次进入细胞凋亡途径，以抑制增殖，达到靶向治疗的目的。在本实验中笔者观察到，第 6 天时感染组的肿瘤体积与 PBS 组/阴性对照组的差异存在统计学意义（P<0.05），随后测得的肿瘤体积差异进一步变大，且随着时间的延长越来越明显；之后剥离 3 组裸鼠的肿瘤发现，感染组与 PBS 组/阴性对照组比较其肿瘤体积明显缩小。该结果表明，EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴细胞移植对裸鼠乳腺癌的荷瘤生长具有明显的抑制作用，提示其有着较好的抑瘤作用，但肿瘤并没有完全消失。
EphrinAl-Caspase-3 体系的相关性研究主要是探讨其对乳腺癌荷瘤裸鼠模型的体内抑制作用。本实验通过 ELSIA 法检测发现：感染组在第 3 天就可以检测出 EphrinAl-Caspase-3 的表达，第 6 天时达到高峰，随后分泌量逐渐降低，另外 2 组未检测到 EphrinAl-Caspase-3 的表达；肿瘤冰冻切片荧光结果显示，感染组的肿瘤组织中可见散在的绿色荧光蛋白标记的 EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴细胞的存在，其余 2 组未见。该结果表明，EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴细胞在乳腺癌肿瘤组织中具有良好的分泌 EphrinAl-Caspase-3 的效果。
Nakopoulou 等[23]报道，约有 75.2%（137 例中有 103 例）的乳腺浸润性肿瘤样本存在 Caspase-3 蛋白的高表达。目前的研究[24]结果表明，高 Caspase-3 表达与乳腺癌患者的乳腺癌特异性生存率相关。Ki-67 水平被认为是乳腺癌患者中有价值的生物标志物，可以用于治疗以及随访监测[25]。Ki-67 是与细胞周期相关的核抗原，通常用于测量细胞增殖率，可用于评估乳腺癌的增殖活性，是乳腺癌患者复发和生存的预后生物标志物。本实验对 3 组肿瘤组织中 Caspase-3 和 Ki-67 抗体的表达进行了免疫荧光检测，结果发现，感染组中 Caspase-3 阳性细胞比例上升，Ki-67 阳性细胞比例下降。该实验结果提示，诱导肿瘤细胞凋亡可能是 EphrinAl-Caspase-3 抗肿瘤的重要机制之一，表明 EphrinAl-Caspase-3 可能通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤的生长。这为低甚至无毒副作用新制剂的研究提供了一定的研究基础。
综上所述，笔者推测，EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴细胞移植可以有效地抑制乳腺癌荷瘤动物体内肿瘤的生长。随着实验研究的不断深入，相信 EphrinAl-Caspase-3 抑瘤的机制将会进一步明确，本实验结果希望能为乳腺癌的治疗提供新方向，但由于本实验的样本量、地域、设备等因素的原因，EphrinAl-Caspase-3 抑制乳腺肿瘤生长的确切机制还有待进一步考证。
目前公认，人乳腺癌不是单一的疾病，而是在多种致癌因子作用下，发生基因突变，致使细胞增生失控的恶性肿瘤[1-7]。2016 年女性中最常见的癌症是乳腺癌，预计在不久的将来，乳腺癌将约占女性所有新诊断癌症的 29%[8]。由于早期诊断的进步和更有效的治疗方法，乳腺癌成为慢性疾病而不是威胁生命的疾病。尽管乳腺癌的综合治疗取得长足的进步，但其发病率高、侵袭性强、极易复发和转移。靶向治疗是继手术、放疗及化疗三大传统治疗手段之外的治疗方法，已成为研究热点。目前临床上传统的化学治疗有选择性差、毒副反应大、易耐药等缺点，而靶向治疗乳腺癌能最大限度地降低并发症发生率，改善患者的生活质量，具有安全、可靠及高效的特点。本研究通过将分泌 EphrinAl-Caspase-3 的淋巴细胞作用于荷瘤动物，对其肿瘤生长情况以及 EphrinAl-Caspase-3 和 Ki-67 的表达情况进行研究，希望对以后乳腺癌的靶向治疗及预后评估提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验动物
实验用健康 6 周龄的 BALB/c 雌性裸鼠 35 只，由昆明医科大学呈贡校区医学实验学部提供，动物使用许可证号：SCXK（滇）K2015-0002。所选实验用裸鼠于实验动物中心动物房中、在无特定病原体条件下饲养。
1.2 主要材料和试剂
主要材料：单层培养的 EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴细胞（前期实验备置，实验室保存）、未感染腺病毒的 T 淋巴细胞和酪氨酸激酶 EphrinA2 受体（EphA2）阳性乳腺肿瘤细胞 ［前期分离培养的人乳腺癌细胞 EphA2 鉴定为阳性，实验室保存］。主要试剂：胰酶、PBS、RIPA 裂解液 ［含苯甲基磺酰氟（ PMSF）］、3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺（TMB）、OCT 包埋剂、生物素化抗体工作液和非免疫正常山羊血清（购于索莱宝公司）；雌二醇（98%，E808987，购于麦克林公司）、Matrige 胶（购于 Corning 公司）、Caspase-3 和 Ki-67 的一抗（购于 biopsydig 公司）及异硫氰酸荧光素（FITC）标记的二抗工作液（购于 ABnerve 公司）。
1.3 方法
1.3.1 裸鼠乳腺癌模型的建立
取对数生长期的单层培养的 EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴细胞以 0.25% 胰酶消化后，用 PBS 洗 2 次，细胞计数后制备成细胞悬液 100 μL（含 5×106 个细胞）。分离培养的人乳腺癌细胞，经EphA2 鉴定为阳性乳腺癌细胞后，取对数生长期细胞制作成细胞悬液（1×105 个/mL），计算活细胞数，再用生理盐水稀释至所需浓度（细胞数多为 1×106 个/mL ～1×107 个/mL）。将其与 Matrige 胶和雌激素混合，按每只雌性裸鼠 0.2 mL 注射（含 1×107 个细胞），缓慢注入裸鼠的左乳腺脂肪垫内。操作中要使细胞积聚成团，在皮下要形成皮丘。裸鼠于实验动物中心动物房中、无特定病原体条件下饲养，同时观察动物的神态、进食和活动状态。
1.3.2 荷瘤动物的治疗
乳腺癌细胞接种至裸鼠1 周后，可见肿瘤体积达到 0.1 cm3 左右大小，表示成瘤（接种了 35 只小鼠，其中 31 只成瘤，选择肿瘤大小均一的 30 只）。将 30 只荷瘤鼠按随机数字表随机分为 3 个组，每组 10 只裸鼠：PBS 组、未感染腺病毒组（阴性对照组）以及感染 EphrinAl-Caspase-3 的 T 淋巴细胞组（感染组）。随机分组完成后，将 T 淋巴细胞接种于 T75 细胞培养瓶中，以感染复数（MOI）为 800 的 pAd-EphrinAl-Caspase-3 病毒液感染 T 淋巴细胞（操作按试剂盒说明书进行），3 d 后收集细胞，即 EphrinAl-Caspase3-T 淋巴细胞。PBS 组裸鼠瘤内注射 PBS 溶液，阴性对照组裸鼠瘤内注射 1×106 个未感染腺病毒的 T 淋巴细胞，感染组裸鼠瘤内注射 1×106 个 EphrinAl-Caspase3-T 淋巴细胞，体积均是 10 μL。
1.3.3 荷瘤动物的肿瘤生长状况观察
3 组（n=5，随机取其中 5 只）荷瘤裸鼠接受不同的 T 淋巴细胞（或 PBS 液）移植治疗后，每隔 3 天用游标卡尺测量肿瘤的大小（0、3、6、9、12 及 15 d），肿瘤体积（cm3）=长（cm）×宽（cm）2/2。以各时间点的平均瘤体积绘制 3 组大鼠的生长曲线图。实验结束时荷瘤裸鼠断颈处死。
1.3.4 肿瘤组织的病理学检查
实验结束后 3 组裸鼠被断颈处死（用于生存曲线绘制的 5 只裸鼠），剥离肿瘤，将肿瘤组织于 4% 多聚甲醛中固定 48 h 后分别转入 15% 和 30% 的蔗糖溶液中脱水，脱水完成后以 OCT 包埋（冰冻切片包埋），于–20 ℃ 恒温箱中切片，在荧光显微镜下观察表达绿色荧光蛋白的 T 淋巴细胞的存在。此外，将固定好的肿瘤组织常规切片，65 ℃ 烤片 2 h 后，二甲苯（Ⅰ）中脱蜡 10 min，再于二甲苯（Ⅱ）中脱蜡 10 min；100% 乙醇（Ⅰ）中 5 min 以洗去二甲苯，100% 乙醇（Ⅱ）中 5 min 洗去二甲苯；95% 乙醇中水化 5 min，85% 乙醇中水化 5 min，75% 乙醇中水化 5 min，蒸馏水中水化待用；使用 0.01 mol/L 柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复，将修复好的切片用 PBS 液清洗 2 次，每次各 5 min；然后滴加非免疫正常山羊血清 100 μL 进行封闭，室温孵育 60 min；用移液枪吸去封闭液，然后分别滴加 Caspase-3 和 Ki-67 的一抗，4 ℃ 孵育过夜。PBS 液充分清洗 4 次，每次 5 min；滴加 FITC 标记的二抗工作液 100 μL，室温孵育 15 min；PBS 液充分淋洗 4 次，各 5 min；在石蜡切片的中央滴加适量中性树胶，盖上盖玻片封固后以荧光显微镜观察。
1.3.5 肿瘤组织中 EphrinAl-Caspase-3 的含量检测
3 组内剩余的 5 只裸鼠经上述的细胞移植后，分别在 3、6、9、12 及 15 d 获取裸鼠皮下肿瘤组织匀浆，行 ELISA 检测 EphrinAl-Caspase-3 的含量。首先将少量组织块（100 mg）置于 2 mL 匀浆器中球状部位，用剪刀将组织块剪碎，加 400 μL 单去污剂裂解液裂（RIPA 裂解液）于匀浆器中进行匀浆。裂解 30 min 后，用移液器将裂解液移至 1.5 mL 离心管中，并在 4 ℃ 下 12 000 r/min 离心 5 min（r=10 cm），取上清进行检测或是置于 –20 ℃ 保存。将标准品工作液依次加入到酶标板的前 2 列孔中，每个浓度的工作液并列加 2 孔，每孔 100 μL；待测样品加入到其他孔，每孔 100 μL。给酶标板覆膜，37 ℃ 孵育 90 min。弃去液体，甩干，不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液 100 μL，混匀；酶标板加上覆膜，37 ℃ 温育 1 h。甩尽孔内液体，每孔加洗涤液 350 μL，浸泡 2 min，甩掉酶标板内的液体，厚吸水纸上拍干。重复此洗板步骤 3 次。每孔加酶结合物工作液 100 μL，加上覆膜，37 ℃ 温育 30 min。弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次。每孔加 90 μL 底物溶液（TMB），酶标板加上覆膜、37 ℃ 避光孵育 15 min。每孔加终止液 50 μL，终止反应。立即用酶标仪在 450 nm 波长测量各孔的光密度（A）值，根据样品 A 值，计算样品滴度。
1.4 统计学方法
本实验数据的统计分析使用 SPSS 20.0 统计软件进行。统计方法采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 方法。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 荷瘤鼠的肿瘤生长状况
乳腺癌细胞接种裸鼠 1 周后可触及皮下肿瘤，测得 3 组裸鼠不同时间点的肿瘤体积（图 1a）。总体而言，PBS 组和阴性对照组裸鼠的肿瘤体积增长较快且两组间的差异不大；而感染组裸鼠的肿瘤生长总体平稳、其增长速度低于 PBS 组和阴性对照。第 0 天和第 3 天时，3 组裸鼠的肿瘤体积比较差异均无统计学意义（P>0.05）；第6 天时 3 组的肿瘤体积差异变大，感染组和 PBS 组/阴性对照组比较差异均有统计学意义（P=0.002，P=0.036），随后感染组和 PBS 组/阴性对照组的肿瘤体积差异进一步变大，且随着时间的延长越来越明显，但各时点 PBS 组和阴性对照组的肿瘤体积比较差异均无统计学意义（P>0.05）。实验结束后剥离 3 组裸鼠的肿瘤，结果感染组的肿瘤体积与 PBS 组/阴性对照组相比明显缩小（图 1b–1d）。
图1
示 3 组裸鼠肿瘤体积变化及大体外观，以及示 3 组肿瘤组织中的 EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴细胞分布、Caspase-3 阳性细胞及 Ki-67 阳性细胞情况（免疫荧光染色 ×100）
a：3 组裸鼠肿瘤体积的变化趋势，与其余2组比较，*
2.2 肿瘤组织的病理学检查结果
在荧光显微镜下观察到，感染组裸鼠的肿瘤组织中可见到散在的绿色荧光蛋白标记的 EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴细胞的存在，而在 PBS 组和阴性对照组裸鼠的肿瘤组织中则均没有检测到绿色荧光蛋白的存在（图 1e–1g）。肿瘤组织的免疫荧光检测结果显示，感染组相对于阴性对照组或 PBS 组，其Caspase-3 阳性细胞比例较高（图 1h–1j），Ki-67 阳性细胞比例较低（图 1k–1m）。
2.3 肿瘤组织中 EphrinAl-Caspase-3 的滴度检测
感染组裸鼠肿瘤组织中在第 3 天就可以检测到 EphrinAl-Caspase-3 的表达，在第 6 天时达到高峰，随后分泌量逐渐降低（图 2）；PBS 组和阴性对照组裸鼠肿瘤组织中各时点均没有检测到 EphrinAl-Caspase-3 的表达。
图2
不同时间点 EphrinAl-Caspase-3 在感染组肿瘤组织中的表达
3 讨论
乳腺癌是危害妇女健康的最常见的恶性肿瘤之一。随着乳腺癌的临床管理显著改善，近年来乳腺癌诊断率较前提高。尽管如此，乳腺癌仍是全球女性担心的重点问题[9]。虽然乳腺癌是大多数女性最害怕的疾病，但它并不是女性死亡的主要原因。乳腺癌患者的存活率在过去的 20 年中急剧提升，这主要是由于乳腺摄影筛查技术的早期检测、患者意识的提高以及更有效的治疗方式所致[10]。
虽然目前新旧多种抗肿瘤药物的开发及应用显著提高了乳腺癌的生存率，但是使用化学治疗剂有可能引起心血管并发症，其中以心脏衰竭（CHF）、心肌缺血及高血压较为常见[11-15]。多项研究[16-19]表明，当曲妥珠单抗纳入治疗方案时，人类表皮生长因子-2（HER-2）阳性患者的死亡率降低，总生存（OS）率增加；曲妥珠单抗的最严重的并发症是其潜在心脏毒性，然而其心脏毒性的确切机制仍不清楚。因此，研究开发对乳腺癌抗癌活性强、低甚至无毒副作用的新制剂是大势所趋。
人 Caspase-3 基因位于 4q33-q35.1 上，具有2 635 个碱基对，7 个外显子。它选择性剪接产生2 种转录物，即 Caspase-3 和 Caspase-3s，其中 Caspase-3 是 Caspase 家族中最重要的凋亡执行者之一，它可激活脱氧核糖核酸酶（CAD），继而引起细胞核浓缩及 DNA 裂解，使细胞发生凋亡。在许多肿瘤细胞的凋亡中发现有 Caspase 的活化。目前也已经采用一系列新的与 Caspase 有关的诱导凋亡的方法来治疗肿瘤。酪氨酸激酶蛋白家族与许多类型癌症相关联，包括前列腺癌、肺癌、食管癌、黑色素瘤、白血病、结直肠癌、宫颈癌、卵巢癌和乳腺癌[20-21]。此外，在乳腺癌中跨膜 Eph 受体 EphA2 的亚类呈过表达[22]。本实验的目标是通过与 EphrinAl（一种 EphA2 受体的天然配体）偶联的 Caspase-3，诱导癌变细胞再次进入细胞凋亡途径，以抑制增殖，达到靶向治疗的目的。在本实验中笔者观察到，第 6 天时感染组的肿瘤体积与 PBS 组/阴性对照组的差异存在统计学意义（P<0.05），随后测得的肿瘤体积差异进一步变大，且随着时间的延长越来越明显；之后剥离 3 组裸鼠的肿瘤发现，感染组与 PBS 组/阴性对照组比较其肿瘤体积明显缩小。该结果表明，EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴细胞移植对裸鼠乳腺癌的荷瘤生长具有明显的抑制作用，提示其有着较好的抑瘤作用，但肿瘤并没有完全消失。
EphrinAl-Caspase-3 体系的相关性研究主要是探讨其对乳腺癌荷瘤裸鼠模型的体内抑制作用。本实验通过 ELSIA 法检测发现：感染组在第 3 天就可以检测出 EphrinAl-Caspase-3 的表达，第 6 天时达到高峰，随后分泌量逐渐降低，另外 2 组未检测到 EphrinAl-Caspase-3 的表达；肿瘤冰冻切片荧光结果显示，感染组的肿瘤组织中可见散在的绿色荧光蛋白标记的 EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴细胞的存在，其余 2 组未见。该结果表明，EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴细胞在乳腺癌肿瘤组织中具有良好的分泌 EphrinAl-Caspase-3 的效果。
Nakopoulou 等[23]报道，约有 75.2%（137 例中有 103 例）的乳腺浸润性肿瘤样本存在 Caspase-3 蛋白的高表达。目前的研究[24]结果表明，高 Caspase-3 表达与乳腺癌患者的乳腺癌特异性生存率相关。Ki-67 水平被认为是乳腺癌患者中有价值的生物标志物，可以用于治疗以及随访监测[25]。Ki-67 是与细胞周期相关的核抗原，通常用于测量细胞增殖率，可用于评估乳腺癌的增殖活性，是乳腺癌患者复发和生存的预后生物标志物。本实验对 3 组肿瘤组织中 Caspase-3 和 Ki-67 抗体的表达进行了免疫荧光检测，结果发现，感染组中 Caspase-3 阳性细胞比例上升，Ki-67 阳性细胞比例下降。该实验结果提示，诱导肿瘤细胞凋亡可能是 EphrinAl-Caspase-3 抗肿瘤的重要机制之一，表明 EphrinAl-Caspase-3 可能通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤的生长。这为低甚至无毒副作用新制剂的研究提供了一定的研究基础。
综上所述，笔者推测，EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴细胞移植可以有效地抑制乳腺癌荷瘤动物体内肿瘤的生长。随着实验研究的不断深入，相信 EphrinAl-Caspase-3 抑瘤的机制将会进一步明确，本实验结果希望能为乳腺癌的治疗提供新方向，但由于本实验的样本量、地域、设备等因素的原因，EphrinAl-Caspase-3 抑制乳腺肿瘤生长的确切机制还有待进一步考证。
