引用本文： 孙晗, 陈武, 王云, 王亦秋, 饶建华, 刘霞, 刘鹏, 田庆中. 肝细胞性肝癌组织中甲胎蛋白的表达对化疗耐药的预测价值. 中国普外基础与临床杂志, 2019, 26(4): 432-437. doi: 10.7507/1007-9424.201811053 复制
肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是临床常见的恶性肿瘤，全世界每年有 30～50 万例新发患者，其发病率逐年上升，并且呈现年轻化趋势[1]。我国属肝癌高发国家，发病率居世界首位[2]，其给个人和家庭带来了沉重的负担。由于 HCC 具有多血管、恶性程度高、生长速度快、转移范围广、复发率高等特点，仅有 20%～25% 的患者可以通过肝切除和肝移植治疗，大多数患者初次就诊时已经丧失了手术机会。肝动脉插管栓塞化疗（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）是治疗中晚期 HCC 常用的方法[3]，但化疗多药耐药（multidrug resistance，MDR）现象严重阻碍了 HCC 的化疗效果。因此，研究引起肝癌 MDR 的相关因素、作用机制并逆转 MDR，提高肝癌化疗效果成为了亟待解决的问题之一。本研究从术前穿刺取得的肝脏肿瘤组织样本中筛选出 HCC，利用免疫组织化学技术对其进行甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）检测，同时评估 TACE 后的治疗效果，旨在探讨肿瘤组织中 AFP 的表达与化疗耐药的关系。
1 资料与方法
1.1 研究对象
对 2008 年 1 月至 2017 年 12 月期间东南大学附属徐州医院实施 TACE 治疗的原发性肝癌患者进行筛选，入组标准为：① 术前行肝脏穿刺活检或术中姑息性手术肿瘤活检，病理学检查结果提示原发性 HCC；② TACE 治疗前未行根治性手术切除；③ TACE 前后均未行肿瘤微波消融或者射频消融治疗；④ 根据第 7 版美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）癌症分期指南[4]，患者的临床分期为 Ⅲ 期（ⅢA–ⅢC 期）；⑤ 患者手术前后临床资料完整（包括手术前后影像资料以及检验结果）；⑥ 患者在 TACE 治疗前未口服索拉非尼等靶向药物。排除标准为：① 美国东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG） 评分[5]>2 分；② 合并其他脏器如心、肺、肾功能不全者；③ DSA 造影发现中重度肝动脉-门静脉瘘或肝动脉-肝静脉瘘者；④ 合并有其他恶性肿瘤；⑤ 合并有糖尿病等内分泌或免疫系统疾病；⑥ 穿刺活检结果为假阴性。共有 62 例患者符合上述条件纳入研究，收集这些患者的临床信息、影像资料及其肿瘤石蜡标本。本研究通过了医院伦理委员会审批。
1.2 TACE 治疗
62 例 HCC 患者行 TACE 前经穿刺或活检留取 HCC 组织标本 3～4 条组织条备检（其中 45 例行肝脏穿刺活检，17 例患者术中探查发现无法行根治性手术而仅行肝肿瘤组织活检）。TACE 治疗过程为：采用 Seldinger 方法，于右侧腹股沟区消毒、1% 利多卡因局部浸润麻醉后，行右侧股动脉穿刺，成功后置入导管鞘，导管选择性插入肝动脉后行 DSA 造影，了解肿瘤的大小、位置、肿瘤血管分布、有无动静脉瘘等，然后根据病灶大小和患者的肝功能状况经导管分别注入丝裂霉素 C （MMC） 4～8 mg+5-氟尿嘧啶 （5-Fu） 500～1 000 mg+表阿霉素（E-ADM）10～30 mg 以及超液化碘油 20 mL，注射结束后拔出导管，对穿刺部位进行加压包扎。17 例剖腹探查活检患者根据其术后恢复情况，于术后 1 个月内行 TACE 治疗，其 TACE 的治疗过程与 45 例行肝脏穿刺活检的患者一致。
1.3 TACE 疗效观察
患者于 TACE 治疗前及治疗后 1 个月均行 CT 检查，使用的机器型号为 Brilliance 64 排螺旋 CT（美国 Philips 公司）或 Discovery CT750 HD 64 排螺旋 CT（美国 GE 公司）。由两位高年资影像科医师进行双盲法图像分析。观察指标包括：肿瘤部位、大小、形态、强化程度、强化形式以及肿瘤与周围血管的关系。按照欧洲肝病学会（European Association for the study of the liver，EASL）标准进行疗效评价[6-7]：完全缓解（complete response，CR）定义为肿瘤没有强化区域，反映了肿瘤完全坏死；部分缓解（partial response，PR）定义为强化区面积减少 50%以上，代表肿瘤部分坏死；稳定（stable disease，SD）定义为肿瘤反应在 PR 和 PD 之间；进展（progressive disease，PD）定义为 1 个可测量病灶增大 25%以上或新病灶出现。将疗效达到 CR 和 PR 的患者归入化疗敏感组，而疗效属于 SD 和 PD 的患者归入化疗耐药组。
1.4 HCC 组织中 AFP 表达的检测
首先对获取的 HCC 组织标本行苏木精-尹红（hematoxylin and eosin，HE）染色以明确 HCC 诊断，然后采用 EnVision 二步法行免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）染色检测 HCC 组织中 AFP 的表达。AFP 抗体购自 Roche 公司，由 Roche Benchmark XT 全自动免疫组化仪完成检测。根据阳性细胞在全部组织细胞中所占比例判定染色结果，其中肿瘤细胞无染色判为阴性；阳性细胞占比<10% 判为局灶阳性；阳性细胞占比为 10%～30% 判为弱阳性；阳性细胞占比 30%～70% 判为中度阳性；阳性细胞占比>70% 判为强阳性。将肿瘤细胞无染色、局灶阳性以及弱阳性病例判为 AFP 表达阴性，而肿瘤细胞中度阳性以及强阳性的病例则判为 AFP 表达阳性。
1.5 统计学方法
采用 STATA10.0 软件进行分析。计量指标以均数±标准差（
±s）表示，2 组间比较采用 t 检验；计数资料的比较采用 χ2 检验或 Fisher 检验；肿瘤组织中 AFP 的表达与化疗耐药之间的相关性采用 logistic 回归分析。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 HCC 组织中 AFP 表达与肿瘤耐药的关系
将 62 例患者行 TACE 治疗前与治疗后 1 个月的 CT 检查结果进行比较，结果显示有 26 例患者（41.9%）TACE 治疗后符合化疗敏感标准，其中符合 CR 标准 0 例，符合 PR 标准 26 例，其余 36 例患者（58.1%）考虑化疗耐药，其中符合 SD 标准 24 例，PD 标准 12 例，即化疗敏感组 26 例，化疗耐药组 36 例。免疫组化染色结果显示，原发性 HCC 组织中 AFP 阳性染色主要位于细胞质，部分胞膜也有着色（图 1），62 例中 AFP 染色阳性者 42 例（67.7%），AFP 染色阴性者 20 例（32.3%）。在 42 例 AFP 染色阳性者中，化疗耐药者有 29 例（69.0%），在 20 例 AFP 染色阴性者中，化疗耐药者有 7 例（35.0%），见表 1。该结果提示：HCC 组织中 AFP 表达阳性与肿瘤耐药具有相关性。
图1
示 HCC 组织中 AFP 免疫组化染色结果
a：示 HCC 组织中 AFP 强阳性染色，染色部位位于细胞质，部分在细胞膜（IHC ×100）；b：示 HCC 组织中 AFP 阴性染色（IHC ×100）
表1
62 例 HCC 患者的 AFP 表达与 TACE 疗效的关系［例（%）］
2.2 HCC 患者临床病理特征与肿瘤耐药的关系
结果见表 2。由表 2 可见，化疗敏感组与化疗耐药组患者在性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、肿瘤分化程度、肝功能 Child-Pugh 分级以及是否合并肝炎 ［乙型肝炎和（或）丙型肝炎］ 方面之间的差异均无统计学意义（P>0.05），而在患者血清 AFP 水平、是否合并门静脉癌栓（portal veinous tumor thrombus，PVTT）以及肿瘤数量方面 2 组间比较差异有统计学意义（P<0.05），化疗敏感组的 AFP 水平阳性、合并门静脉癌栓以及肿瘤单发患者的占比显著低于化疗耐药组。
表2
62 例 HCC 患者临床病理学特征与肿瘤耐药的关系
2.3 HCC 化疗耐药影响因素的 logistic 回归分析结果
对可能影响 HCC 化疗耐药的因素进一步行 logistic 回归单因素和多因素分析，其单因素分析结果显示，肿瘤组织的 AFP 阳性表达，血清 AFP 水平升高、合并 PVTT 以及肿瘤数量是 HCC 化疗耐药的相关危险因素（P<0. 05) ；多因素分析结果显示，肿瘤组织的 AFP 阳性表达和合并 PVTT 是 HCC 化疗耐药的独立危险因素（P<0.05)，见表 3。
表3
HCC 化疗耐药影响因素的 logistic 回归分析
3 讨论
AFP 是一种分子量约为 70×103的胚胎性糖蛋白，由 500 个氨基酸组成，由 Halbrecht 等[8]于 1956 年从胎儿血清中首次发现，1964 年 Tatarinov[9]首次从 HCC 患者的血清中检测到 AFP，1978 年在第 12 届国际癌症大会上正式确认 AFP 是一种特异性的肝癌标志物，其作用至今尚无其他标志物可以取代。既往国内外对 AFP 的诊断价值及其与 HCC 临床病理之间的关系进行了大量的研究报道，结果发现无论是手术还是姑息性治疗，高表达 AFP 的患者均较低表达 AFP 的患者预后更差，甚至一些肝脏肿瘤分期系统（如 CLIP 分期系统）都将 AFP 水平作为一个预后因素[10]。然而，关于 AFP 与 HCC 化疗耐药之间的关系却鲜有报道。因此，本研究通过分析 HCC 的组织中 AFP 表达、肿瘤分化程度、血清 AFP 水平以及临床特征，探讨 HCC 化疗耐药的影响因素，有助于为逆转 MDR 提供新的理论线索和潜在的干预靶标。
本研究结果表明，HCC 组织中 AFP 表达阳性是影响其化疗耐药的一个重要因素。其作用机制可能与以下因素有关：① 通过上调 MDR1 基因的表达诱导肝脏肿瘤耐药。体外实验[11]显示，在 AFP 阴性的肝癌细胞系 SMMC-7721 中转染 AFP 表达颗粒后，发现其 MDR1 的表达产物 P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）显著增高。而通过反义 RNA 重组腺病毒载体靶向逆转 AFP 阳性的肝癌多药耐药细胞 HepG2R 后，能够有效降低 P-gp 的表达[12]。鉴于 P-gp 蛋白具有 ATP 依赖性跨膜转运活性，可将药物转运至细胞外，因此可使得细胞获得耐药性。② 通过抗凋亡作用引起耐药。目前已知肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）及其受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）和 Fas 及其配体（Fas ligand，FasL）均在细胞凋亡中起到重要的作用。而在 HCC 组织中 AFP 能够下调肝脏肿瘤细胞 TNFR 的表达、上调 FasL 的表达以及抑制淋巴细胞中 TNF 的分泌[13-15]，这种主动防御方式，不仅可以使得肿瘤凋亡减少，还可以导致肿瘤周围淋巴细胞凋亡增多。除了 TNF/TNFR 和 Fas/FasL 系统外，有研究[16]发现，AFP 可以促进肝癌细胞突变型 p53 基因的表达，导致其失去野生型 p53 基因所具有的抑制 survivin 基因表达的功能，survivin 表达产物能够抑制 caspase-3,7,9 的活性，阻碍细胞凋亡的发生。上述这些抗肿瘤细胞凋亡作用减弱了化疗药物对 HCC 的影响。③ 促进肿瘤细胞增殖的作用。目前已知磷酸肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，AKT）/雷帕霉素靶蛋白（the mammalian target of rapamycin，mTOR）通路可以促进细胞增殖并抑制其凋亡，在肿瘤的发生发展过程中起到极其重要的作用。而第 10 号染色体磷酸酶和张力蛋白同源丢失性基因（phosphatase and tension homolog deleted on chromosome ten，PTEN）被认为是继 p53 基因后，另一种与肿瘤发生关系密切的抑癌基因，其编码的产物可以对上述通路产生抑制作用[17]；在前列腺癌、子宫内膜癌、肾癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌、肺癌、膀胱癌、甲状腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤等多种肿瘤中均已发现该基因异常[17-18]。在 HCC 中已有研究[19]发现，AFP 与肿瘤细胞膜上受体结合后，能够抑制 PTEN 活性，从而激活 P13K/AKT/mTOR 信号通路，促进 Src、Ras 等癌基因的表达。此外，AFP 还可以通过影响细胞内的第 2 信息物质 cAMP 和 Ca2+等的浓度，从而调控转录调节因子的作用，促进 Ras、C-fos、C-jun 等癌基因的表达[20]。这些癌基因最终将导致 HCC 的恶性转化及肿瘤增殖[21-22]。
本研究中需要引起我们注意的是，血清 AFP 阳性在多因素回归分析中并无显著意义。考虑是因为部分 HCC 肿瘤组织中虽然表达 AFP，但并未分泌入血或者分泌入血极少，使得血清中 AFP 检测为阴性。但是目前已知 AFP 在细胞内也可与 caspase-3 结合，通过抑制其活性，阻断凋亡信号的转导，从而使得肝癌细胞耐受化学药物诱导的凋亡[23-24]。该结果提示：HCC 组织的 AFP 阳性表达较血清 AFP 阳性对明确肿瘤耐药具有更高的特异度及临床应用价值。
目前已知 PVTT 是 HCC 患者预后较差的主要原因之一，而在本研究中我们发现其也是 HCC 化疗耐药的独立危险因素。这主要是因为：① HCC 肿瘤中心区的血供来自于肝动脉，而包括 PVTT 在内的肿瘤周围组织血供主要来自于门静脉，因此 TACE 对于门静脉出现癌栓治疗效果甚微。② PVTT 形成后会增大门静脉压力，减少门静脉血供，使得肝脏的储备能力降低。虽然门静脉和肝动脉之间存在广泛的吻合支[25]，但是 TACE 治疗后动脉栓塞则必然会进一步损伤肝功能，从而限制了具有肝毒性的化疗药物使用的剂量，最终导致化疗效果不佳。③ PVTT 可引起肿瘤血管的功能异常，形成缺氧的微环境，促进缺氧诱导因子 1α 的生成（hypoxia-inducible factor，HIF-1α）。体外实验[26]中已经证实 HepG2 肝癌细胞可通过 HIF-1α 调控 MDR 基因的表达，导致耐药表型形成；而在体内实验[27]中，HIF-1α 蛋白的表达水平在耐药肝癌组织中显著高于化疗敏感肝癌组织，这也间接说明了 HIF-1α 在 HCC 化疗耐药的形成过程中起了重要作用。
本研究也存在一些局限性：① 样本量较少；② 化疗方案单一；③ 不能排除超液化碘油对肿瘤治疗的影响，使得结果出现偏倚；④ 单中心研究；⑤ 没有对患者进行生存分析；⑥ 给药途径单一，没有进行门静脉化疗或者门静脉化疗联合肝动脉化疗的比较研究；⑦ 标本的取材部位和取材量没有进行控制和统一，而肿瘤不同部位其蛋白表达水平可能不同，使得结果可能出现偏倚。而通过完善上述缺陷，是否能够得出相同结论还需要进一步证实。总之，在现有技术条件下，我们认为肿瘤组织 AFP 表达阳性是判断 HCC 化疗耐药的一个重要指标，而其具体作用机制尚有待进一步研究。
肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是临床常见的恶性肿瘤，全世界每年有 30～50 万例新发患者，其发病率逐年上升，并且呈现年轻化趋势[1]。我国属肝癌高发国家，发病率居世界首位[2]，其给个人和家庭带来了沉重的负担。由于 HCC 具有多血管、恶性程度高、生长速度快、转移范围广、复发率高等特点，仅有 20%～25% 的患者可以通过肝切除和肝移植治疗，大多数患者初次就诊时已经丧失了手术机会。肝动脉插管栓塞化疗（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）是治疗中晚期 HCC 常用的方法[3]，但化疗多药耐药（multidrug resistance，MDR）现象严重阻碍了 HCC 的化疗效果。因此，研究引起肝癌 MDR 的相关因素、作用机制并逆转 MDR，提高肝癌化疗效果成为了亟待解决的问题之一。本研究从术前穿刺取得的肝脏肿瘤组织样本中筛选出 HCC，利用免疫组织化学技术对其进行甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）检测，同时评估 TACE 后的治疗效果，旨在探讨肿瘤组织中 AFP 的表达与化疗耐药的关系。
1 资料与方法
1.1 研究对象
对 2008 年 1 月至 2017 年 12 月期间东南大学附属徐州医院实施 TACE 治疗的原发性肝癌患者进行筛选，入组标准为：① 术前行肝脏穿刺活检或术中姑息性手术肿瘤活检，病理学检查结果提示原发性 HCC；② TACE 治疗前未行根治性手术切除；③ TACE 前后均未行肿瘤微波消融或者射频消融治疗；④ 根据第 7 版美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）癌症分期指南[4]，患者的临床分期为 Ⅲ 期（ⅢA–ⅢC 期）；⑤ 患者手术前后临床资料完整（包括手术前后影像资料以及检验结果）；⑥ 患者在 TACE 治疗前未口服索拉非尼等靶向药物。排除标准为：① 美国东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG） 评分[5]>2 分；② 合并其他脏器如心、肺、肾功能不全者；③ DSA 造影发现中重度肝动脉-门静脉瘘或肝动脉-肝静脉瘘者；④ 合并有其他恶性肿瘤；⑤ 合并有糖尿病等内分泌或免疫系统疾病；⑥ 穿刺活检结果为假阴性。共有 62 例患者符合上述条件纳入研究，收集这些患者的临床信息、影像资料及其肿瘤石蜡标本。本研究通过了医院伦理委员会审批。
1.2 TACE 治疗
62 例 HCC 患者行 TACE 前经穿刺或活检留取 HCC 组织标本 3～4 条组织条备检（其中 45 例行肝脏穿刺活检，17 例患者术中探查发现无法行根治性手术而仅行肝肿瘤组织活检）。TACE 治疗过程为：采用 Seldinger 方法，于右侧腹股沟区消毒、1% 利多卡因局部浸润麻醉后，行右侧股动脉穿刺，成功后置入导管鞘，导管选择性插入肝动脉后行 DSA 造影，了解肿瘤的大小、位置、肿瘤血管分布、有无动静脉瘘等，然后根据病灶大小和患者的肝功能状况经导管分别注入丝裂霉素 C （MMC） 4～8 mg+5-氟尿嘧啶 （5-Fu） 500～1 000 mg+表阿霉素（E-ADM）10～30 mg 以及超液化碘油 20 mL，注射结束后拔出导管，对穿刺部位进行加压包扎。17 例剖腹探查活检患者根据其术后恢复情况，于术后 1 个月内行 TACE 治疗，其 TACE 的治疗过程与 45 例行肝脏穿刺活检的患者一致。
1.3 TACE 疗效观察
患者于 TACE 治疗前及治疗后 1 个月均行 CT 检查，使用的机器型号为 Brilliance 64 排螺旋 CT（美国 Philips 公司）或 Discovery CT750 HD 64 排螺旋 CT（美国 GE 公司）。由两位高年资影像科医师进行双盲法图像分析。观察指标包括：肿瘤部位、大小、形态、强化程度、强化形式以及肿瘤与周围血管的关系。按照欧洲肝病学会（European Association for the study of the liver，EASL）标准进行疗效评价[6-7]：完全缓解（complete response，CR）定义为肿瘤没有强化区域，反映了肿瘤完全坏死；部分缓解（partial response，PR）定义为强化区面积减少 50%以上，代表肿瘤部分坏死；稳定（stable disease，SD）定义为肿瘤反应在 PR 和 PD 之间；进展（progressive disease，PD）定义为 1 个可测量病灶增大 25%以上或新病灶出现。将疗效达到 CR 和 PR 的患者归入化疗敏感组，而疗效属于 SD 和 PD 的患者归入化疗耐药组。
1.4 HCC 组织中 AFP 表达的检测
首先对获取的 HCC 组织标本行苏木精-尹红（hematoxylin and eosin，HE）染色以明确 HCC 诊断，然后采用 EnVision 二步法行免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）染色检测 HCC 组织中 AFP 的表达。AFP 抗体购自 Roche 公司，由 Roche Benchmark XT 全自动免疫组化仪完成检测。根据阳性细胞在全部组织细胞中所占比例判定染色结果，其中肿瘤细胞无染色判为阴性；阳性细胞占比<10% 判为局灶阳性；阳性细胞占比为 10%～30% 判为弱阳性；阳性细胞占比 30%～70% 判为中度阳性；阳性细胞占比>70% 判为强阳性。将肿瘤细胞无染色、局灶阳性以及弱阳性病例判为 AFP 表达阴性，而肿瘤细胞中度阳性以及强阳性的病例则判为 AFP 表达阳性。
1.5 统计学方法
采用 STATA10.0 软件进行分析。计量指标以均数±标准差（±s）表示，2 组间比较采用 t 检验；计数资料的比较采用 χ2 检验或 Fisher 检验；肿瘤组织中 AFP 的表达与化疗耐药之间的相关性采用 logistic 回归分析。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 HCC 组织中 AFP 表达与肿瘤耐药的关系
将 62 例患者行 TACE 治疗前与治疗后 1 个月的 CT 检查结果进行比较，结果显示有 26 例患者（41.9%）TACE 治疗后符合化疗敏感标准，其中符合 CR 标准 0 例，符合 PR 标准 26 例，其余 36 例患者（58.1%）考虑化疗耐药，其中符合 SD 标准 24 例，PD 标准 12 例，即化疗敏感组 26 例，化疗耐药组 36 例。免疫组化染色结果显示，原发性 HCC 组织中 AFP 阳性染色主要位于细胞质，部分胞膜也有着色（图 1），62 例中 AFP 染色阳性者 42 例（67.7%），AFP 染色阴性者 20 例（32.3%）。在 42 例 AFP 染色阳性者中，化疗耐药者有 29 例（69.0%），在 20 例 AFP 染色阴性者中，化疗耐药者有 7 例（35.0%），见表 1。该结果提示：HCC 组织中 AFP 表达阳性与肿瘤耐药具有相关性。
图1
示 HCC 组织中 AFP 免疫组化染色结果
a：示 HCC 组织中 AFP 强阳性染色，染色部位位于细胞质，部分在细胞膜（IHC ×100）；b：示 HCC 组织中 AFP 阴性染色（IHC ×100）
表1
62 例 HCC 患者的 AFP 表达与 TACE 疗效的关系［例（%）］
2.2 HCC 患者临床病理特征与肿瘤耐药的关系
结果见表 2。由表 2 可见，化疗敏感组与化疗耐药组患者在性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、肿瘤分化程度、肝功能 Child-Pugh 分级以及是否合并肝炎 ［乙型肝炎和（或）丙型肝炎］ 方面之间的差异均无统计学意义（P>0.05），而在患者血清 AFP 水平、是否合并门静脉癌栓（portal veinous tumor thrombus，PVTT）以及肿瘤数量方面 2 组间比较差异有统计学意义（P<0.05），化疗敏感组的 AFP 水平阳性、合并门静脉癌栓以及肿瘤单发患者的占比显著低于化疗耐药组。
表2
62 例 HCC 患者临床病理学特征与肿瘤耐药的关系
2.3 HCC 化疗耐药影响因素的 logistic 回归分析结果
对可能影响 HCC 化疗耐药的因素进一步行 logistic 回归单因素和多因素分析，其单因素分析结果显示，肿瘤组织的 AFP 阳性表达，血清 AFP 水平升高、合并 PVTT 以及肿瘤数量是 HCC 化疗耐药的相关危险因素（P<0. 05) ；多因素分析结果显示，肿瘤组织的 AFP 阳性表达和合并 PVTT 是 HCC 化疗耐药的独立危险因素（P<0.05)，见表 3。
表3
HCC 化疗耐药影响因素的 logistic 回归分析
3 讨论
AFP 是一种分子量约为 70×103的胚胎性糖蛋白，由 500 个氨基酸组成，由 Halbrecht 等[8]于 1956 年从胎儿血清中首次发现，1964 年 Tatarinov[9]首次从 HCC 患者的血清中检测到 AFP，1978 年在第 12 届国际癌症大会上正式确认 AFP 是一种特异性的肝癌标志物，其作用至今尚无其他标志物可以取代。既往国内外对 AFP 的诊断价值及其与 HCC 临床病理之间的关系进行了大量的研究报道，结果发现无论是手术还是姑息性治疗，高表达 AFP 的患者均较低表达 AFP 的患者预后更差，甚至一些肝脏肿瘤分期系统（如 CLIP 分期系统）都将 AFP 水平作为一个预后因素[10]。然而，关于 AFP 与 HCC 化疗耐药之间的关系却鲜有报道。因此，本研究通过分析 HCC 的组织中 AFP 表达、肿瘤分化程度、血清 AFP 水平以及临床特征，探讨 HCC 化疗耐药的影响因素，有助于为逆转 MDR 提供新的理论线索和潜在的干预靶标。
本研究结果表明，HCC 组织中 AFP 表达阳性是影响其化疗耐药的一个重要因素。其作用机制可能与以下因素有关：① 通过上调 MDR1 基因的表达诱导肝脏肿瘤耐药。体外实验[11]显示，在 AFP 阴性的肝癌细胞系 SMMC-7721 中转染 AFP 表达颗粒后，发现其 MDR1 的表达产物 P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）显著增高。而通过反义 RNA 重组腺病毒载体靶向逆转 AFP 阳性的肝癌多药耐药细胞 HepG2R 后，能够有效降低 P-gp 的表达[12]。鉴于 P-gp 蛋白具有 ATP 依赖性跨膜转运活性，可将药物转运至细胞外，因此可使得细胞获得耐药性。② 通过抗凋亡作用引起耐药。目前已知肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）及其受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）和 Fas 及其配体（Fas ligand，FasL）均在细胞凋亡中起到重要的作用。而在 HCC 组织中 AFP 能够下调肝脏肿瘤细胞 TNFR 的表达、上调 FasL 的表达以及抑制淋巴细胞中 TNF 的分泌[13-15]，这种主动防御方式，不仅可以使得肿瘤凋亡减少，还可以导致肿瘤周围淋巴细胞凋亡增多。除了 TNF/TNFR 和 Fas/FasL 系统外，有研究[16]发现，AFP 可以促进肝癌细胞突变型 p53 基因的表达，导致其失去野生型 p53 基因所具有的抑制 survivin 基因表达的功能，survivin 表达产物能够抑制 caspase-3,7,9 的活性，阻碍细胞凋亡的发生。上述这些抗肿瘤细胞凋亡作用减弱了化疗药物对 HCC 的影响。③ 促进肿瘤细胞增殖的作用。目前已知磷酸肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，AKT）/雷帕霉素靶蛋白（the mammalian target of rapamycin，mTOR）通路可以促进细胞增殖并抑制其凋亡，在肿瘤的发生发展过程中起到极其重要的作用。而第 10 号染色体磷酸酶和张力蛋白同源丢失性基因（phosphatase and tension homolog deleted on chromosome ten，PTEN）被认为是继 p53 基因后，另一种与肿瘤发生关系密切的抑癌基因，其编码的产物可以对上述通路产生抑制作用[17]；在前列腺癌、子宫内膜癌、肾癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌、肺癌、膀胱癌、甲状腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤等多种肿瘤中均已发现该基因异常[17-18]。在 HCC 中已有研究[19]发现，AFP 与肿瘤细胞膜上受体结合后，能够抑制 PTEN 活性，从而激活 P13K/AKT/mTOR 信号通路，促进 Src、Ras 等癌基因的表达。此外，AFP 还可以通过影响细胞内的第 2 信息物质 cAMP 和 Ca2+等的浓度，从而调控转录调节因子的作用，促进 Ras、C-fos、C-jun 等癌基因的表达[20]。这些癌基因最终将导致 HCC 的恶性转化及肿瘤增殖[21-22]。
本研究中需要引起我们注意的是，血清 AFP 阳性在多因素回归分析中并无显著意义。考虑是因为部分 HCC 肿瘤组织中虽然表达 AFP，但并未分泌入血或者分泌入血极少，使得血清中 AFP 检测为阴性。但是目前已知 AFP 在细胞内也可与 caspase-3 结合，通过抑制其活性，阻断凋亡信号的转导，从而使得肝癌细胞耐受化学药物诱导的凋亡[23-24]。该结果提示：HCC 组织的 AFP 阳性表达较血清 AFP 阳性对明确肿瘤耐药具有更高的特异度及临床应用价值。
目前已知 PVTT 是 HCC 患者预后较差的主要原因之一，而在本研究中我们发现其也是 HCC 化疗耐药的独立危险因素。这主要是因为：① HCC 肿瘤中心区的血供来自于肝动脉，而包括 PVTT 在内的肿瘤周围组织血供主要来自于门静脉，因此 TACE 对于门静脉出现癌栓治疗效果甚微。② PVTT 形成后会增大门静脉压力，减少门静脉血供，使得肝脏的储备能力降低。虽然门静脉和肝动脉之间存在广泛的吻合支[25]，但是 TACE 治疗后动脉栓塞则必然会进一步损伤肝功能，从而限制了具有肝毒性的化疗药物使用的剂量，最终导致化疗效果不佳。③ PVTT 可引起肿瘤血管的功能异常，形成缺氧的微环境，促进缺氧诱导因子 1α 的生成（hypoxia-inducible factor，HIF-1α）。体外实验[26]中已经证实 HepG2 肝癌细胞可通过 HIF-1α 调控 MDR 基因的表达，导致耐药表型形成；而在体内实验[27]中，HIF-1α 蛋白的表达水平在耐药肝癌组织中显著高于化疗敏感肝癌组织，这也间接说明了 HIF-1α 在 HCC 化疗耐药的形成过程中起了重要作用。
本研究也存在一些局限性：① 样本量较少；② 化疗方案单一；③ 不能排除超液化碘油对肿瘤治疗的影响，使得结果出现偏倚；④ 单中心研究；⑤ 没有对患者进行生存分析；⑥ 给药途径单一，没有进行门静脉化疗或者门静脉化疗联合肝动脉化疗的比较研究；⑦ 标本的取材部位和取材量没有进行控制和统一，而肿瘤不同部位其蛋白表达水平可能不同，使得结果可能出现偏倚。而通过完善上述缺陷，是否能够得出相同结论还需要进一步证实。总之，在现有技术条件下，我们认为肿瘤组织 AFP 表达阳性是判断 HCC 化疗耐药的一个重要指标，而其具体作用机制尚有待进一步研究。
