引用本文： 林法彬, 邱福南. DNA 甲基化与胆管癌研究进展. 中国普外基础与临床杂志, 2019, 26(7): 870-875. doi: 10.7507/1007-9424.201812063 复制
胆管癌是目前已知的最凶险的恶性肿瘤之一，现有的治疗方案对胆管癌的疗效有限，使得胆管癌患者的预后较差，随着发病率在全球范围内的增高，胆管癌受到越来越多的关注。胆管癌发病的最新分子机制研究进展[1]表明，胆管癌发生过程中除了遗传变化之外，某些基因启动子区域甲基化水平的改变也起到了重要的致癌作用。笔者现就 DNA 甲基化相关原理和与胆管癌相关的甲基化基因机制进行综述、分析，对甲基化基因作为胆管癌治疗的研究进展进行讨论，并对其研究问题和未来方向予以展望。
1 胆管癌概述与危险因素
胆管癌是胆管不同位置上的上皮细胞的恶性肿瘤。从解剖学上它可以分为肝内胆管癌、肝门周围胆管癌和远端胆管癌 3 种亚型[2]。这些亚型不仅在解剖位置上有所不同，其流行病学、起源、病因、发病机理和治疗方面也存在显著不同。尽管全世界的胆管癌发病率和病因存在差异，但在过去的几十年中，在全球范围内其发病率在逐年增加。已确定的胆管癌危险因素包括：年龄增长、吸烟、原发性硬化性胆管炎、糖尿病[3]、胆总管囊肿等。近年，肝硬变、丙型和乙型病毒性肝炎也被认为是胆管癌的危险因素，在西方国家和亚洲国家之间，丙型肝炎和乙型肝炎对肿瘤生长的作用有所区别。在西方国家，丙型肝炎更具有流行性，但在亚洲国家乙型肝炎更具流行性。美国和欧洲的研究[4-5]表明，肝内胆管癌的危险因素与丙型肝炎具有相关性；韩国[6]和中国[7]的研究表明，乙型肝炎是造成肝内胆管癌的重要危险因素之一。在东南亚以及南亚地区，胆管癌的发病率相对较高，这与肝吸虫、华支睾吸虫有关[8-9]。胆管癌早期诊断困难，包括计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）在内的影像学方法，以及低特异性和缺乏绝对诊断标准的血清 CA19-9 的血清学检测都不足以用于胆管癌的诊断[10]。目前来说，对于少数早期胆管癌患者，手术是唯一的治疗选择。因此迫切需要一种能够快速、精准的诊断、检测胆管癌的生物标志物。DNA 异常甲基化是肿瘤公认的表观遗传特征并且已经在大多类型肿瘤中被发现，是一种在哺乳动物基因组中发生最频繁的表观遗传学事件，因此被更多人作为了潜在的生物标志物[11-13]。
2 DNA 甲基化
表观遗传学研究基因活性或功能的可遗传变化，而这与 DNA 序列本身的任何变化无关。DNA 甲基化作为共价化学修饰是表观遗传机制的一种。DNA 甲基转移酶（DNMTS）催化 S-腺苷甲硫氨酸，使其成为甲基的直接供体，将甲基转移到 DNA 分子的碱基上。甲基与 DNA 中胞嘧啶上的第 5 碳原子共价结合，胞嘧啶由此成为 5-甲基胞嘧啶。异常 DNA 甲基化在肿瘤中的作用主要包括 DNA 低甲基化、DNA 高甲基化以及 5mC 突变。DNA 低甲基化能够使癌基因转录激活[14]，而抑癌基因的失活突变大多是其启动子高甲基化造成的。
CpG 二核苷酸是发生 DNA 甲基化的主要位点。在人类的基因体中，甲基化的 CpG 二核苷酸主要有两种分布位置，其中一种位于 CpG 岛区。在基因启动子的转录调控区附近常成簇存在着富含 CpG 的 DNA 片段，约每 10 bp 就出现 1 个 CpG 位点，通常长度在 1～2 kb 左右，G 和 C 含量占核苷酸至少 50%，实测/预期的 CpG 比率>0.6，称为 CpG 岛[15]，其在进化中具有保守性。CpG 岛在人类基因体中十分常见，50% 的基因都包含有 CpG 岛。基因的启动子一般含有 CpG 岛，尤其是管家基因的启动子区[15]，有时也位于基因 5’端的外显子和内含子。DNA 上 CpG 岛甲基化水平常在肿瘤细胞中发生改变，正常细胞的 CpG 岛一般不发生甲基化，但在细胞发生癌变时，有些抑癌基因的启动子甲基化，使得基因表达下调或沉默，细胞出现无限制生长。除了 CpG 岛之外，位于岛屿周围的较低 CpG 密度的区域，称为“CpG 海岸”（距离 CpG 岛最多 2 kb）和“CpG 架”（距离 CpG 岛 2～4 kb），远离 CpG 岛的区域（距离 CpG 岛最少 4 kb）被一些作者命名为“大海”。尽管CpG密度降低，但已证明这些区域对于基因表达调节具有功能上的重要性。
另外一种甲基化的 CpG 二核苷酸分布散乱，70%～90% 的 CpG 被甲基化修饰，当其甲基化状态变化时，导致染色体稳定性降低、基因表达非正常，是发生肿瘤的重要诱因[16]。分布散乱的 CpG 二核苷酸存在于基因间区域以及基因体中。基因间区域存在大量甲基化沉默的转座子和病毒元件。它们的复制或插入可导致基因破坏和 DNA 突变，因此绝大多数通过 DNA 甲基化或 5mC 脱氨突变失活。所以在基因间区域中，DNA 甲基化的主要作用之一便是抑制潜在危险遗传元件的表达。在植物中基因体中的甲基化经常发生，但在哺乳动物细胞中，基因体甲基化与表达之间的关系尚未明确。在基因体中各个区域 DNA 甲基化的结果是不同的。Brenet 等[17]研究表明，高密度的外显子甲基化的发生较过去所认知或预期统计的更加频繁。与更下游的外显子和内含子相比，第 1 外显子甲基化发生相对较少，但第 1 外显子的甲基化对转录沉默至关重要。
除 CpG 甲基化外，还有一种非 CpG 甲基化（mCH，其中 H=A，C，T）。Lister 等[18]研究证实了这种 DNA 修饰的存在，出现在多种人类细胞和组织中，包括不同的多能细胞、雌性生殖细胞、神经元和神经胶质。由于 mCH 发现不久，因此其具体作用仍不清楚，在此不详述。
3 异常 DNA 甲基化作为胆管癌的生物标志物
发生胆管癌的分子途径包括抑癌基因突变失活、致癌基因的过度激活以及异常 DNA 甲基化改变导致的重要分子途径失调。通过在基因组和表观基因组内积累遗传变化，逐渐发展成胆管癌。可信的生物标志物能够早期筛查胆管癌，提高早期诊断率，改善预后，预测治疗反应复发风险。
Lee 等[19]在肝内胆管细胞癌中检测的基因座甲基化频率 14-3-3sigma 为 59.5%、APC 为 26.6%、E-cadherin 为 21.5%、p16 为 17.7%、MGMT 为 11.4%、THBS1 为 11.4%、p14 为 8.9%、TIMP 为 38.9%、DAP 激酶为 7.6%、GSTP1 为 6.3%、COX-2 为 5.1%、MINT12 为 50.6%、MINT1 为 40.5%、MINT25 为 15.4%、MINT32 为 35.4%以及 MINT31 为 1.3%。这些结果表明，异常 DNA 甲基化在胆管癌中的发生频率非常高，并且与胆管癌的发生密切相关。
不同胆管癌亚型中的 DNA 甲基化水平存在异同。Yang 等[11]研究发现，大多数肿瘤抑制基因在肝内和肝外胆管癌之间具有相似的甲基化频率，例如 APC、E-cadherin/CDH1、p15 INK4b、p16 INK4a 和 MGMT 的甲基化。但在肝外胆管癌中，RASSF1A 的甲基化（30/36）发生频率高于肝内胆管癌（17/36，83% 比 47%，P=0.003）。在肝内胆管细胞癌中，GSTP 启动子甲基化比在肝外胆管癌中更常见，并且这种差异具有统计学意义（31% 比 6%，P=0.012）。Borger 等[20]研究发现，在肝内胆管癌 IDH1 和 IDH2 的突变率很高（9/40，23%），但在肝外胆管癌中未发现（0/22）。Kipp 等[21] 对 94 例甲醛固定、石蜡包埋的胆管癌（67 例肝内、27 例肝外）进行测序，发现在肝内胆管癌中 IDH1/2 突变频率高于肝外胆管癌（28% 比 7%，P=0.03）。IDH1 和 IDH2 蛋白酶活性的产物是 2-羟戊二酸，而突变的 IDH1 和 IDH2 蛋白使 α-酮戊二酸减少并积累 α-酮戊二酸拮抗剂 2-羟戊二酸，导致 DNA 甲基化[22]。不仅如此，血清中存在 2-羟戊二酸易于检测，可作为生物标志物。部分基因甲基化已在前期文献中报告[23-24]，因此以下例举一些近年来与胆管癌有关的甲基化基因。
3.1 OPCML 和 SFRP1
阿片肽结合蛋白（OPCML）属于细胞黏附分子中的一员，由 OPCML 基因所编码，该蛋白质定位于质膜中并且可能在阿片受体功能中具有辅助作用。分泌型卷曲相关蛋白 1 （SFRP1）基因位于染色体 8p12-p11.1，编码 SFRP1，可充当 Wnt 信号传导的可溶性调节剂，抑制 Wnt 活性，导致细胞异常增殖[25]。Dicer 是 RNase Ⅲ 内切核糖核酸酶家族的成员之一，在调节哺乳动物癌细胞 CpG 岛的甲基化中起到重要作用。Cheng 等[26]证明，Dicer 通过促进 SFRP1 启动子的 DNA 甲基化，导致 SFRP1 表达下调，促进胆管癌细胞增殖和侵袭。Amornpisutt 等[27]通过应用甲基化敏感的高分辨率熔解（MS-HRM）等方法表明，OPCML 的敏感度、特异度和准确率分别为 89.04%、100% 和 90.36%，SFRP1 的敏感度、特异度和准确率分别为 83.56%、100% 和 85.54%，提示 OPCML 和 SFRP1 的 DNA 甲基化水平是诊断胆管癌的潜在生物标志物，具有高特异度、灵敏度和准确性。
3.2 人半胱氨酸双加氧酶 1（CDO1）
CDO1 基因位于 5 号染色体长臂 23 区 2 亚带（5q23.2）上，其编码的蛋白是一种非血红素结构的含铁金属酶，参与半胱氨酸向半胱氨酸亚磺酸盐的转化，在牛磺酸生物合成中起关键作用。目前，通过研究发现 CDO1 基因启动子区 DNA 甲基化能够导致多种肿瘤的发生[28]。因此，CDO1 启动子区异常 DNA 甲基化是多种肿瘤中的诊断和（或）预后的生物标志物，例如结直肠癌、胆囊癌、胃癌等[29-31]。Nakamoto 等[32]在胆管癌患者中研究 CDO1 基因启动子甲基化和预后的相关性，研究结果表明，CDO1 基因表现优异（AUC=0.93），甚至作为单一甲基化标志物的 COD1 基因与组合分析（AUC=0.94）表现相当，证明了 CDO1 基因的启动子 DNA 甲基化是原发性肝外胆管细胞癌（EHCC）有效的分子诊断和预后生物标志物。
3.3 DLEC1
DLEC1 基因位于染色体上的 3p21.3-22，全长 59 kb，包含 37 个外显子。DLEC1 蛋白主要存在于细胞质中，但细胞核中存在相对少量的 DLEC1 蛋白，其具有抑制细胞集落形成、诱导细胞 G1 期停滞、抑制细胞迁移等功能，以此抑制肿瘤发育生长。其与多种恶性肿瘤的发生有关，包括肾细胞癌，非小细胞肺癌和前列腺癌[33-34]，而目前该基因在胆管癌细胞中研究较少。Kim 等[35]通过对 10 例肝内胆管癌和正常囊性导管标本使用 MethyLight 检测，筛选出 113 个启动子 CpG 岛位点，并从中选择 30 个与肿瘤相关的高甲基化 CpG 岛位点，用来分析 172 个肝内胆管癌的甲基化状态。在小管型肝内胆管细胞癌患者（n=68）中发现 DLEC1 甲基化 26 例（38.2%），并与肿瘤相关生存率和无复发生存率的临床结果相关，DLEC1 甲基化可作为小管型肝内胆管细胞癌患者的预后标志物。
3.4 GATA5
GATA5 基因位于 20q13.2-q13.3 上，其编码的蛋白属于锌指转录因子（GATA1-6）家族，对共有 DNA 序列（A/T）GATA（A/G）具有高亲和力。研究表明，GATA5 CpG 岛甲基化和转录失活涉及结直肠癌、胃癌、肺癌和肾癌[36-38]。然而鲜有人研究胆管癌中的 GATA5 CpG 岛甲基化。Liu 等[39]通过综合分析 152 例胆管癌患者组织样本，表明甲基化介导的 GATA5 基因沉默抑制胆管癌细胞增殖和转移及 GATA5 通过失活 Wnt/β-连环蛋白信号传导来抑制胆管癌增殖和转移，从而在胆管癌细胞中起负面作用。GATA5 在胆管癌发展中的作用仍需进一步阐明。抛开其他表观遗传调控机制如组蛋白乙酰化，GATA5 结合位点的下游基因在癌细胞中通过高甲基化而表观遗传沉默以及 VHL/HIF 信号传导的潜在相互作用也是未来研究的方向。
异常 DNA 甲基化作为生物标志物通常不是某种肿瘤的特性，因此难以找到胆管癌中特异 DNA 甲基化基因。然而甲基化标志物的组合分析能够更好地诊断和治疗胆管癌，弥补了独立分析特异性不高的缺点。
4 DNA 甲基化在诊断和治疗胆管癌中的作用
DNA 甲基化具有可逆性，一些位点可根据细胞活性发生去甲基化，因此通过使用甲基化抑制剂重新激活肿瘤抑制基因成为新型的肿瘤治疗疗法，Zebularine 便是一种甲基化抑制剂。Zebularine 是一种新型的 DNMT 抑制胞嘧啶核苷类似物。研究表明，相较于正常细胞，Zebularine 对癌细胞具有更高的选择性[40]，但其临床效益尚需进一步的评估。Zebularine 通过降低 DNMT1 水平和 DNA 去甲基化，诱导某些基因的激活，包括原钙粘蛋白、转录调节因子和 Wnt 信号传导相关基因，以此诱导胆管癌细胞的凋亡。Zebularine 可降低不同类型癌细胞中的 DNMT 亚型。Nakamura 等[41]研究表明，Zebularine 可降低 TFK-1 和 HuCCT1 细胞中 DNMT3A、DNMT3B 尤其是 DNMT1 的水平，导致 TFK-1 和 HuCCT1 细胞活力降低。
综上所述，可知在各种类型的肿瘤中 Wnt 信号通路的激活与肿瘤发生和进展密切相关，Nakamura 等[41]证明 Zebularine 可诱导 Wnt 信号通路相关基因的 DNA 去甲基化，并降低胆管癌细胞中 β-连环蛋白的水平。其中“Wnt 信号通路”中的 31 个基因出现去甲基化，包括 Wnt 信号增强基因和阻遏基因。总之，肿瘤抑制基因去甲基化可能是治疗胆管癌的高效生物标志物。利用 DNA 甲基化抑制剂进行的表观遗传治疗通过肿瘤抑制基因的再激活，使得胆管癌的治疗具有相当大的希望。
最新研究[42]表明，一氧化氮（NO）通过改变表观遗传酶来改变 DNA 甲基化和组蛋白修饰，能够直接或间接的影响表观遗传机制。Spirlì等[43]证明了促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）通过诱导一氧化氮合酶 2（NOS2）刺激胆管上皮细胞产生 NO。持续性炎症通过损伤 DNA 以及激活细胞因子和其他生长因子来促进肿瘤发生[44]。当肝损伤引起慢性炎症和胆汁淤积时，促炎细胞因子如 TNF-α 和 IFN-γ 刺激胆管上皮细胞产生 NO，NO 则改变某些基因 DNA 的甲基化，导致胆管上皮细胞的加速生长，而胆管上皮细胞的加速增殖促进肿瘤抑制基因的异常 DNA 甲基化，最终导致胆管癌的发生。以上研究也能够为胆管癌治疗的新靶点提供新的思路。
诊断胆管恶性肿瘤的标准方法是通过具有侵入性操作的组织采样，如内镜逆行胰胆管造影术（ERCP）下使用刷状细胞学检测，但其灵敏度太低。因此，迫切需要用于胆管癌早期诊断的高特异度标志物。Prachayakul 等[45]通过定量甲基化特异性聚合酶链反应（QMSP）评估 HOXA1、RASSF1A、p16 和 NEUROG1 启动子的 DNA 甲基化水平，证明了 HOXA1 和 NEUROG1 启动子甲基化检测可显著提高常规细胞学诊断的灵敏度。胆管癌的诊断方法除常规细胞学分析评估外，目前还可通过共聚焦激光内窥显微镜检查、单人操作胆管镜靶向活组织检查（single-operator cholangioscopy with targeted biopsies）以及荧光原位杂交（FISH）进行分析评估。
5 存在的问题及展望
目前，作为胆管癌的诊断标志物主要是 CA19-9、血小板衍生生长因子、癌胚抗原、CA-125 等分子标志物。但这些标志物缺乏针对胆管癌的敏感度和特异度。DNA 启动子区异常甲基化用于此目的具有可行性。在组织特异性甲基化水平上，胆管癌中甲基化的 p16 和 RASSF1A 基因可以作为早期诊断的潜在分子标志物。然而在全基因组甲基化水平上，这些基因在其他多种上皮癌细胞中也表现出高甲基化，因此在测量血液、尿液、粪便等含有人全部 DNA 样本的分析物时，p16 和 RASSF1A 基因可能会受到其他多种上皮癌细胞的干扰，使得这些基因对于胆管癌的特异性识别较低，因此，需要新的技术用于鉴定胆管癌特异性甲基化标志物，使其能够进行评估全基因组的高甲基化启动子区域。介于检测全基因组甲基化难度，在胆管癌分子标志物的选择上，Shin 等[46]开发了一种使用胆汁标本诊断胆管癌的有效方法。这种方法利用 MethyLight 测定法对胆汁中 DNA 样本的 5 个基因（CCND2、CDH13、GRIN2B、RUNX3 和 TWIST1）进行 DNA 甲基化检测，其灵敏度为 83%，特异度为 100%。使用这种微创检查方法获取胆汁标本，并检测相关基因甲基化水平进行胆管癌的早期筛查和诊断，不仅排除了部分基因组的干扰，而且能最大程度减小了对患者的伤害。
总之，胆管癌因其细胞的复杂性和生长模式的多样性，难以得到有效的诊疗。因此在胆管癌早期阶段得到诊断，并实现肿瘤治愈性的治疗仍是人类目前面临的难题。而异常 DNA 甲基化的肿瘤抑制基因和重要分子途径通路的相关基因可作为胆管癌诊断和治疗的生物标志物且 DNA 甲基化抑制剂通过抑制肿瘤细胞有望达到治疗的效果。
胆管癌是目前已知的最凶险的恶性肿瘤之一，现有的治疗方案对胆管癌的疗效有限，使得胆管癌患者的预后较差，随着发病率在全球范围内的增高，胆管癌受到越来越多的关注。胆管癌发病的最新分子机制研究进展[1]表明，胆管癌发生过程中除了遗传变化之外，某些基因启动子区域甲基化水平的改变也起到了重要的致癌作用。笔者现就 DNA 甲基化相关原理和与胆管癌相关的甲基化基因机制进行综述、分析，对甲基化基因作为胆管癌治疗的研究进展进行讨论，并对其研究问题和未来方向予以展望。
1 胆管癌概述与危险因素
胆管癌是胆管不同位置上的上皮细胞的恶性肿瘤。从解剖学上它可以分为肝内胆管癌、肝门周围胆管癌和远端胆管癌 3 种亚型[2]。这些亚型不仅在解剖位置上有所不同，其流行病学、起源、病因、发病机理和治疗方面也存在显著不同。尽管全世界的胆管癌发病率和病因存在差异，但在过去的几十年中，在全球范围内其发病率在逐年增加。已确定的胆管癌危险因素包括：年龄增长、吸烟、原发性硬化性胆管炎、糖尿病[3]、胆总管囊肿等。近年，肝硬变、丙型和乙型病毒性肝炎也被认为是胆管癌的危险因素，在西方国家和亚洲国家之间，丙型肝炎和乙型肝炎对肿瘤生长的作用有所区别。在西方国家，丙型肝炎更具有流行性，但在亚洲国家乙型肝炎更具流行性。美国和欧洲的研究[4-5]表明，肝内胆管癌的危险因素与丙型肝炎具有相关性；韩国[6]和中国[7]的研究表明，乙型肝炎是造成肝内胆管癌的重要危险因素之一。在东南亚以及南亚地区，胆管癌的发病率相对较高，这与肝吸虫、华支睾吸虫有关[8-9]。胆管癌早期诊断困难，包括计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）在内的影像学方法，以及低特异性和缺乏绝对诊断标准的血清 CA19-9 的血清学检测都不足以用于胆管癌的诊断[10]。目前来说，对于少数早期胆管癌患者，手术是唯一的治疗选择。因此迫切需要一种能够快速、精准的诊断、检测胆管癌的生物标志物。DNA 异常甲基化是肿瘤公认的表观遗传特征并且已经在大多类型肿瘤中被发现，是一种在哺乳动物基因组中发生最频繁的表观遗传学事件，因此被更多人作为了潜在的生物标志物[11-13]。
2 DNA 甲基化
表观遗传学研究基因活性或功能的可遗传变化，而这与 DNA 序列本身的任何变化无关。DNA 甲基化作为共价化学修饰是表观遗传机制的一种。DNA 甲基转移酶（DNMTS）催化 S-腺苷甲硫氨酸，使其成为甲基的直接供体，将甲基转移到 DNA 分子的碱基上。甲基与 DNA 中胞嘧啶上的第 5 碳原子共价结合，胞嘧啶由此成为 5-甲基胞嘧啶。异常 DNA 甲基化在肿瘤中的作用主要包括 DNA 低甲基化、DNA 高甲基化以及 5mC 突变。DNA 低甲基化能够使癌基因转录激活[14]，而抑癌基因的失活突变大多是其启动子高甲基化造成的。
CpG 二核苷酸是发生 DNA 甲基化的主要位点。在人类的基因体中，甲基化的 CpG 二核苷酸主要有两种分布位置，其中一种位于 CpG 岛区。在基因启动子的转录调控区附近常成簇存在着富含 CpG 的 DNA 片段，约每 10 bp 就出现 1 个 CpG 位点，通常长度在 1～2 kb 左右，G 和 C 含量占核苷酸至少 50%，实测/预期的 CpG 比率>0.6，称为 CpG 岛[15]，其在进化中具有保守性。CpG 岛在人类基因体中十分常见，50% 的基因都包含有 CpG 岛。基因的启动子一般含有 CpG 岛，尤其是管家基因的启动子区[15]，有时也位于基因 5’端的外显子和内含子。DNA 上 CpG 岛甲基化水平常在肿瘤细胞中发生改变，正常细胞的 CpG 岛一般不发生甲基化，但在细胞发生癌变时，有些抑癌基因的启动子甲基化，使得基因表达下调或沉默，细胞出现无限制生长。除了 CpG 岛之外，位于岛屿周围的较低 CpG 密度的区域，称为“CpG 海岸”（距离 CpG 岛最多 2 kb）和“CpG 架”（距离 CpG 岛 2～4 kb），远离 CpG 岛的区域（距离 CpG 岛最少 4 kb）被一些作者命名为“大海”。尽管CpG密度降低，但已证明这些区域对于基因表达调节具有功能上的重要性。
另外一种甲基化的 CpG 二核苷酸分布散乱，70%～90% 的 CpG 被甲基化修饰，当其甲基化状态变化时，导致染色体稳定性降低、基因表达非正常，是发生肿瘤的重要诱因[16]。分布散乱的 CpG 二核苷酸存在于基因间区域以及基因体中。基因间区域存在大量甲基化沉默的转座子和病毒元件。它们的复制或插入可导致基因破坏和 DNA 突变，因此绝大多数通过 DNA 甲基化或 5mC 脱氨突变失活。所以在基因间区域中，DNA 甲基化的主要作用之一便是抑制潜在危险遗传元件的表达。在植物中基因体中的甲基化经常发生，但在哺乳动物细胞中，基因体甲基化与表达之间的关系尚未明确。在基因体中各个区域 DNA 甲基化的结果是不同的。Brenet 等[17]研究表明，高密度的外显子甲基化的发生较过去所认知或预期统计的更加频繁。与更下游的外显子和内含子相比，第 1 外显子甲基化发生相对较少，但第 1 外显子的甲基化对转录沉默至关重要。
除 CpG 甲基化外，还有一种非 CpG 甲基化（mCH，其中 H=A，C，T）。Lister 等[18]研究证实了这种 DNA 修饰的存在，出现在多种人类细胞和组织中，包括不同的多能细胞、雌性生殖细胞、神经元和神经胶质。由于 mCH 发现不久，因此其具体作用仍不清楚，在此不详述。
3 异常 DNA 甲基化作为胆管癌的生物标志物
发生胆管癌的分子途径包括抑癌基因突变失活、致癌基因的过度激活以及异常 DNA 甲基化改变导致的重要分子途径失调。通过在基因组和表观基因组内积累遗传变化，逐渐发展成胆管癌。可信的生物标志物能够早期筛查胆管癌，提高早期诊断率，改善预后，预测治疗反应复发风险。
Lee 等[19]在肝内胆管细胞癌中检测的基因座甲基化频率 14-3-3sigma 为 59.5%、APC 为 26.6%、E-cadherin 为 21.5%、p16 为 17.7%、MGMT 为 11.4%、THBS1 为 11.4%、p14 为 8.9%、TIMP 为 38.9%、DAP 激酶为 7.6%、GSTP1 为 6.3%、COX-2 为 5.1%、MINT12 为 50.6%、MINT1 为 40.5%、MINT25 为 15.4%、MINT32 为 35.4%以及 MINT31 为 1.3%。这些结果表明，异常 DNA 甲基化在胆管癌中的发生频率非常高，并且与胆管癌的发生密切相关。
不同胆管癌亚型中的 DNA 甲基化水平存在异同。Yang 等[11]研究发现，大多数肿瘤抑制基因在肝内和肝外胆管癌之间具有相似的甲基化频率，例如 APC、E-cadherin/CDH1、p15 INK4b、p16 INK4a 和 MGMT 的甲基化。但在肝外胆管癌中，RASSF1A 的甲基化（30/36）发生频率高于肝内胆管癌（17/36，83% 比 47%，P=0.003）。在肝内胆管细胞癌中，GSTP 启动子甲基化比在肝外胆管癌中更常见，并且这种差异具有统计学意义（31% 比 6%，P=0.012）。Borger 等[20]研究发现，在肝内胆管癌 IDH1 和 IDH2 的突变率很高（9/40，23%），但在肝外胆管癌中未发现（0/22）。Kipp 等[21] 对 94 例甲醛固定、石蜡包埋的胆管癌（67 例肝内、27 例肝外）进行测序，发现在肝内胆管癌中 IDH1/2 突变频率高于肝外胆管癌（28% 比 7%，P=0.03）。IDH1 和 IDH2 蛋白酶活性的产物是 2-羟戊二酸，而突变的 IDH1 和 IDH2 蛋白使 α-酮戊二酸减少并积累 α-酮戊二酸拮抗剂 2-羟戊二酸，导致 DNA 甲基化[22]。不仅如此，血清中存在 2-羟戊二酸易于检测，可作为生物标志物。部分基因甲基化已在前期文献中报告[23-24]，因此以下例举一些近年来与胆管癌有关的甲基化基因。
3.1 OPCML 和 SFRP1
阿片肽结合蛋白（OPCML）属于细胞黏附分子中的一员，由 OPCML 基因所编码，该蛋白质定位于质膜中并且可能在阿片受体功能中具有辅助作用。分泌型卷曲相关蛋白 1 （SFRP1）基因位于染色体 8p12-p11.1，编码 SFRP1，可充当 Wnt 信号传导的可溶性调节剂，抑制 Wnt 活性，导致细胞异常增殖[25]。Dicer 是 RNase Ⅲ 内切核糖核酸酶家族的成员之一，在调节哺乳动物癌细胞 CpG 岛的甲基化中起到重要作用。Cheng 等[26]证明，Dicer 通过促进 SFRP1 启动子的 DNA 甲基化，导致 SFRP1 表达下调，促进胆管癌细胞增殖和侵袭。Amornpisutt 等[27]通过应用甲基化敏感的高分辨率熔解（MS-HRM）等方法表明，OPCML 的敏感度、特异度和准确率分别为 89.04%、100% 和 90.36%，SFRP1 的敏感度、特异度和准确率分别为 83.56%、100% 和 85.54%，提示 OPCML 和 SFRP1 的 DNA 甲基化水平是诊断胆管癌的潜在生物标志物，具有高特异度、灵敏度和准确性。
3.2 人半胱氨酸双加氧酶 1（CDO1）
CDO1 基因位于 5 号染色体长臂 23 区 2 亚带（5q23.2）上，其编码的蛋白是一种非血红素结构的含铁金属酶，参与半胱氨酸向半胱氨酸亚磺酸盐的转化，在牛磺酸生物合成中起关键作用。目前，通过研究发现 CDO1 基因启动子区 DNA 甲基化能够导致多种肿瘤的发生[28]。因此，CDO1 启动子区异常 DNA 甲基化是多种肿瘤中的诊断和（或）预后的生物标志物，例如结直肠癌、胆囊癌、胃癌等[29-31]。Nakamoto 等[32]在胆管癌患者中研究 CDO1 基因启动子甲基化和预后的相关性，研究结果表明，CDO1 基因表现优异（AUC=0.93），甚至作为单一甲基化标志物的 COD1 基因与组合分析（AUC=0.94）表现相当，证明了 CDO1 基因的启动子 DNA 甲基化是原发性肝外胆管细胞癌（EHCC）有效的分子诊断和预后生物标志物。
3.3 DLEC1
DLEC1 基因位于染色体上的 3p21.3-22，全长 59 kb，包含 37 个外显子。DLEC1 蛋白主要存在于细胞质中，但细胞核中存在相对少量的 DLEC1 蛋白，其具有抑制细胞集落形成、诱导细胞 G1 期停滞、抑制细胞迁移等功能，以此抑制肿瘤发育生长。其与多种恶性肿瘤的发生有关，包括肾细胞癌，非小细胞肺癌和前列腺癌[33-34]，而目前该基因在胆管癌细胞中研究较少。Kim 等[35]通过对 10 例肝内胆管癌和正常囊性导管标本使用 MethyLight 检测，筛选出 113 个启动子 CpG 岛位点，并从中选择 30 个与肿瘤相关的高甲基化 CpG 岛位点，用来分析 172 个肝内胆管癌的甲基化状态。在小管型肝内胆管细胞癌患者（n=68）中发现 DLEC1 甲基化 26 例（38.2%），并与肿瘤相关生存率和无复发生存率的临床结果相关，DLEC1 甲基化可作为小管型肝内胆管细胞癌患者的预后标志物。
3.4 GATA5
GATA5 基因位于 20q13.2-q13.3 上，其编码的蛋白属于锌指转录因子（GATA1-6）家族，对共有 DNA 序列（A/T）GATA（A/G）具有高亲和力。研究表明，GATA5 CpG 岛甲基化和转录失活涉及结直肠癌、胃癌、肺癌和肾癌[36-38]。然而鲜有人研究胆管癌中的 GATA5 CpG 岛甲基化。Liu 等[39]通过综合分析 152 例胆管癌患者组织样本，表明甲基化介导的 GATA5 基因沉默抑制胆管癌细胞增殖和转移及 GATA5 通过失活 Wnt/β-连环蛋白信号传导来抑制胆管癌增殖和转移，从而在胆管癌细胞中起负面作用。GATA5 在胆管癌发展中的作用仍需进一步阐明。抛开其他表观遗传调控机制如组蛋白乙酰化，GATA5 结合位点的下游基因在癌细胞中通过高甲基化而表观遗传沉默以及 VHL/HIF 信号传导的潜在相互作用也是未来研究的方向。
异常 DNA 甲基化作为生物标志物通常不是某种肿瘤的特性，因此难以找到胆管癌中特异 DNA 甲基化基因。然而甲基化标志物的组合分析能够更好地诊断和治疗胆管癌，弥补了独立分析特异性不高的缺点。
4 DNA 甲基化在诊断和治疗胆管癌中的作用
DNA 甲基化具有可逆性，一些位点可根据细胞活性发生去甲基化，因此通过使用甲基化抑制剂重新激活肿瘤抑制基因成为新型的肿瘤治疗疗法，Zebularine 便是一种甲基化抑制剂。Zebularine 是一种新型的 DNMT 抑制胞嘧啶核苷类似物。研究表明，相较于正常细胞，Zebularine 对癌细胞具有更高的选择性[40]，但其临床效益尚需进一步的评估。Zebularine 通过降低 DNMT1 水平和 DNA 去甲基化，诱导某些基因的激活，包括原钙粘蛋白、转录调节因子和 Wnt 信号传导相关基因，以此诱导胆管癌细胞的凋亡。Zebularine 可降低不同类型癌细胞中的 DNMT 亚型。Nakamura 等[41]研究表明，Zebularine 可降低 TFK-1 和 HuCCT1 细胞中 DNMT3A、DNMT3B 尤其是 DNMT1 的水平，导致 TFK-1 和 HuCCT1 细胞活力降低。
综上所述，可知在各种类型的肿瘤中 Wnt 信号通路的激活与肿瘤发生和进展密切相关，Nakamura 等[41]证明 Zebularine 可诱导 Wnt 信号通路相关基因的 DNA 去甲基化，并降低胆管癌细胞中 β-连环蛋白的水平。其中“Wnt 信号通路”中的 31 个基因出现去甲基化，包括 Wnt 信号增强基因和阻遏基因。总之，肿瘤抑制基因去甲基化可能是治疗胆管癌的高效生物标志物。利用 DNA 甲基化抑制剂进行的表观遗传治疗通过肿瘤抑制基因的再激活，使得胆管癌的治疗具有相当大的希望。
最新研究[42]表明，一氧化氮（NO）通过改变表观遗传酶来改变 DNA 甲基化和组蛋白修饰，能够直接或间接的影响表观遗传机制。Spirlì等[43]证明了促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）通过诱导一氧化氮合酶 2（NOS2）刺激胆管上皮细胞产生 NO。持续性炎症通过损伤 DNA 以及激活细胞因子和其他生长因子来促进肿瘤发生[44]。当肝损伤引起慢性炎症和胆汁淤积时，促炎细胞因子如 TNF-α 和 IFN-γ 刺激胆管上皮细胞产生 NO，NO 则改变某些基因 DNA 的甲基化，导致胆管上皮细胞的加速生长，而胆管上皮细胞的加速增殖促进肿瘤抑制基因的异常 DNA 甲基化，最终导致胆管癌的发生。以上研究也能够为胆管癌治疗的新靶点提供新的思路。
诊断胆管恶性肿瘤的标准方法是通过具有侵入性操作的组织采样，如内镜逆行胰胆管造影术（ERCP）下使用刷状细胞学检测，但其灵敏度太低。因此，迫切需要用于胆管癌早期诊断的高特异度标志物。Prachayakul 等[45]通过定量甲基化特异性聚合酶链反应（QMSP）评估 HOXA1、RASSF1A、p16 和 NEUROG1 启动子的 DNA 甲基化水平，证明了 HOXA1 和 NEUROG1 启动子甲基化检测可显著提高常规细胞学诊断的灵敏度。胆管癌的诊断方法除常规细胞学分析评估外，目前还可通过共聚焦激光内窥显微镜检查、单人操作胆管镜靶向活组织检查（single-operator cholangioscopy with targeted biopsies）以及荧光原位杂交（FISH）进行分析评估。
5 存在的问题及展望
目前，作为胆管癌的诊断标志物主要是 CA19-9、血小板衍生生长因子、癌胚抗原、CA-125 等分子标志物。但这些标志物缺乏针对胆管癌的敏感度和特异度。DNA 启动子区异常甲基化用于此目的具有可行性。在组织特异性甲基化水平上，胆管癌中甲基化的 p16 和 RASSF1A 基因可以作为早期诊断的潜在分子标志物。然而在全基因组甲基化水平上，这些基因在其他多种上皮癌细胞中也表现出高甲基化，因此在测量血液、尿液、粪便等含有人全部 DNA 样本的分析物时，p16 和 RASSF1A 基因可能会受到其他多种上皮癌细胞的干扰，使得这些基因对于胆管癌的特异性识别较低，因此，需要新的技术用于鉴定胆管癌特异性甲基化标志物，使其能够进行评估全基因组的高甲基化启动子区域。介于检测全基因组甲基化难度，在胆管癌分子标志物的选择上，Shin 等[46]开发了一种使用胆汁标本诊断胆管癌的有效方法。这种方法利用 MethyLight 测定法对胆汁中 DNA 样本的 5 个基因（CCND2、CDH13、GRIN2B、RUNX3 和 TWIST1）进行 DNA 甲基化检测，其灵敏度为 83%，特异度为 100%。使用这种微创检查方法获取胆汁标本，并检测相关基因甲基化水平进行胆管癌的早期筛查和诊断，不仅排除了部分基因组的干扰，而且能最大程度减小了对患者的伤害。
总之，胆管癌因其细胞的复杂性和生长模式的多样性，难以得到有效的诊疗。因此在胆管癌早期阶段得到诊断，并实现肿瘤治愈性的治疗仍是人类目前面临的难题。而异常 DNA 甲基化的肿瘤抑制基因和重要分子途径通路的相关基因可作为胆管癌诊断和治疗的生物标志物且 DNA 甲基化抑制剂通过抑制肿瘤细胞有望达到治疗的效果。