结直肠癌患者外周血及其癌组织中 CD19<sup>+</sup>IL-10<sup>+</sup>B 细胞及其亚群含量的差异及意义_《中国普外基础与临床杂志》

作者：

许杰 , 陈小龙 , 胡欣雨 , 左宗林 , 陈鹏 , 冯立波 , 邹庆伟 ,  夏冬

西南医科大学附属医院胃肠外科（四川泸州 646000）;

关键词：

结直肠癌 CD19⁺ IL-10⁺ B 细胞调节性 B 细胞

DOI：

10.7507/1007-9424.201903070

视频：

导出 下载 收藏 扫码 引用

摘要 全文 图表 视频 参考文献 施引文献 补充材料

目的探讨 CD19⁺IL-10⁺ B 细胞及其亚群在结直肠癌患者外周血及其癌组织中的表达差异及临床意义。方法纳入在西南医科大学附属医院 2017 年 11 月至 2018 年 11 月期间确诊为结直肠癌并行手术患者共 38 例，用流式细胞术检测结直肠癌患者外周血、癌组织及其相应癌旁组织中 CD19⁺IL-10⁺ B 细胞及其3 种亚群 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 细胞、CD19⁺IL-10⁺CD24^intCD38^int B 细胞及 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^– B 细胞占 CD19⁺ B 细胞的百分比；另外纳入同时间段在西南医科大学附属医院健康体检者共 37 例，仅抽取外周血同法分离细胞。比较 CD19⁺IL-10⁺ B 细胞及其亚群含量在结直肠癌和健康对照者外周血中以及在结直肠癌患者癌组织及其相应癌旁组织中的表达差异，并分析其与结直肠癌患者临床病理特征的关系。结果 ① 结直肠癌患者外周血中 CD19⁺IL-10⁺ B 细胞和 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 细胞含量明显高于健康对照组（分别为：t=9.09，P<0.01；t=9.36，P<0.01），CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^– B 细胞含量明显低于健康对照组（t=6.15，P<0.01），而 CD19⁺IL-10⁺CD24^intCD38^int B 细胞含量在 2 组间比较差异无统计学意义（t=1.78，P=0.08）。② CD19⁺IL-10⁺ B 细胞和 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hiB 细胞含量在结直肠癌患者的癌组织中明显高于在其相应的癌旁组织中（分别为：t=11.67，P<0.01；t=19.64，P<0.01），而 CD19⁺IL-10⁺CD24^intCD38^int B 细胞和 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^– B 细胞含量在二者间比较差异无统计学意义（分别为：t=1.72，P=0.09；t=1.57，P=0.12）。③ CD19⁺IL-10⁺ B 细胞及其亚群 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 细胞含量在Ⅲ+Ⅳ期结直肠癌患者外周血中明显高于Ⅰ+Ⅱ期者（t=5.39，P<0.01；t=3.13，P<0.01），而其他均未发现差异有统计学意义（P>0.05）。结论 CD19⁺IL-10⁺ B 细胞在结直肠癌患者的外周血和癌组织以及中晚期结直肠癌患者的外周血中均明显增高，且其以 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 细胞亚群升高为主，结果提示，CD19⁺IL-10⁺ B 细胞及其亚群 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 细胞可能与结直肠癌的发生及进展有关。

引用本文： 许杰, 陈小龙, 胡欣雨, 左宗林, 陈鹏, 冯立波, 邹庆伟, 夏冬. 结直肠癌患者外周血及其癌组织中 CD19⁺IL-10⁺B 细胞及其亚群含量的差异及意义. 中国普外基础与临床杂志, 2019, 26(7): 808-813. doi: 10.7507/1007-9424.201903070 复制

结直肠癌是严重危害人们健康的主要消化道肿瘤之一，除手术治疗外，免疫治疗也成为结直肠癌综合治疗的重要组成部分。Sakaguchi 等^[1]首次发现了具有免疫抑制功能的调节性 T 细胞（regulatory T cell，Treg）的存在，在肿瘤免疫、自身性免疫、移植免疫等疾病中具有调节作用^[2-3]。是否具有调节功能的 B 细胞存在呢？最近一些研究^[4-6]揭示了一类特殊的 B 细胞即调节性 B 细胞（regulatory B cell，Breg），其与 Treg 相似，也具有免疫调节功能，在自身免疫性疾病^[7-9]、病毒感染^[10-11]、血液系统疾病^[12-13]、移植排斥反应^[14-15]及肿瘤免疫^[16-17]中发挥着重要作用。Breg 产生 IL-10 被认为是 Breg 的最重要特征。有研究^[18-21]发现，IL-10 与多种肿瘤的进展有关，具有免疫抑制作用。在胃癌研究^[19]中发现，CD19⁺IL-10⁺ B 细胞具有免疫抑制作用，且主要是 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 细胞发挥免疫抑制功能，其他两种亚群细胞（CD19⁺IL-10⁺CD24^intCD38^int B 细胞、CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^– B 细胞）虽然能分泌 IL-10，但不具有免疫抑制功能。目前关于 CD19⁺IL-10⁺B 细胞及亚群研究相对较少，其所有亚群在结直肠癌中是否都具有免疫调节功能在国内外研究中未见报道。本研究中将以 CD19⁺IL-10⁺ B 细胞为基础，探讨结直肠癌患者的外周血和癌组织中 CD19⁺IL-10⁺ B 细胞及其亚群含量的变化及可能的临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集 2017 年 11 月至 2018 年 11 月期间在西南医科大学附属医院（简称“我院”）首次入院并行手术治疗的结直肠癌患者作为研究组，另选择同期在我院体检的健康自愿者作为对照组。

纳入标准及排除标准：① 研究组：术前经病理检查确诊为结直肠癌；术前未做过手术、化放疗、免疫治疗、靶向治疗、生物治疗等；术后均取得肿瘤组织及其相应的癌旁组织并经我院病理学专家确诊并明确病理分期。② 对照组：选择与研究组年龄在同一范围内未做过手术、化放疗、免疫治疗、靶向治疗、生物治疗等健康体检者。2 组均排除了过敏、炎症、感染、自身免疫性等病史者。临床分期按 AJCC/UICC 公布的第 8 版结直肠癌 TNM 分期进行分类。所有参加者均同意并签署知情同意书，经我院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 标本采集

① 收集 2 组受试者清晨空腹外周血 5 mL，加入淋巴细胞分离液，以 510 ×g 离心25 min，分离并提取外周血单个核细胞（peripheral blood monouclear cell，PBMC）备用。② 收集研究组手术切除的新鲜肿瘤组织及其相应的距肿瘤组织边缘 5 cm 远时的癌旁组织（术后证实无癌），分别切成 2～3 mm³见方的组织块，加入组织消化液进行振荡消化，用 70 目尼龙网进行过滤，获得细胞离心重悬，再按照外周血中 PBMC 的分离法进行操作，获得癌组织中提取的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）和癌旁组织中提取的非肿瘤浸润淋巴细胞（NIL）。

1.2.2 标记抗体、流式细胞术检测

用单克隆抗体标记 PBMC、TIL 和 NIL 的表面抗原 CD19（PE-Cy™7）、CD24（FITC）、CD38（PE-Cy™5），室温下摇动避光孵育 30 min 后行破膜固定，再加入胞内抗 IL-10 的单抗（PE）标记 IL-10⁺细胞（抗体均来自 BD 公司，破膜固定剂 FIX&PERM Kit 联科生物公司提供）。孵育完成后用流式细胞仪完成测定。以 CD19⁺ B 细胞为总 B 细胞，以 CD19⁺IL-10⁺ B 细胞设门，再根据 CD24 和 CD38 的表达情况，按 Carsetti 等^[22]的方法将 CD19⁺IL-10⁺ B 细胞分为 3 种亚群，即 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 细胞（Q2）、CD19⁺IL-10⁺CD24^intCD38^intB 细胞（Q3）、CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^– B 细胞（Q1），见图 1。

图1 示 CD19⁺ IL-10⁺ B 细胞及亚群检测

a：标记淋巴细胞；b：标记 CD19⁺ B 淋巴细胞；c：标记 CD19⁺IL-10⁺ B 淋巴细胞；d：CD19⁺IL-10⁺ B 淋巴细胞 3 种亚群分布。 FSC-A：前向角散射；SSC-A：侧向角散射。CD19 PE-Cy7-A、CD24 FITC-A、CD38 PE-Cy5.5-A 分别为 CD19、CD24、CD38 的抗体标记荧光染料

图选项

下载全尺寸图像

下载幻灯片

1.3 统计学方法

使用 SPSS 23.0 进行统计分析，计量资料经检验符合正态分布时用均数 ± 标准差（±s）表示，方差齐性采用 t 检验，方差不齐时用校正的 t 检验（即 t′检验）；分类变量采用卡方（ χ² ）检验。检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 纳入研究对象的基本情况

纳入 2017 年 11 月至 2018 年 11 月期间在我院首次入院并行手术治疗的结直肠癌患者 38 例（研究组），男 24 例，女 14 例；年龄 49～73 岁、（60±7）岁；结肠癌 26 例，直肠癌 12 例；TNM 分期Ⅰ期 3 例、Ⅱ期 12 例、Ⅲ期 10 例、Ⅳ期 13 例，癌胚抗原（CEA）水平<5 μg/L 者 14 例，≥5 μg/L 者 24 例。对照组共纳入 37 例，男 20 例，女 17 例；年龄 49～73 岁、（62±7）岁。2 组性别和年龄均匹配，差异无统计学意义（性别：χ²=0.64，P=0.42；年龄：t=1.44，P=0.16）。

2.2 CD19⁺IL-10⁺ B 细胞及其亚群在研究组和对照组中的表达情况

结果见表 1。①在 PBMC 中，CD19⁺IL-10⁺ B 细胞和 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 细胞含量在研究组中均明显高于对照组（分别为：t=9.09，P<0.01；t=9.36，P<0.01）、CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^– B 细胞含量在研究组中明显低于对照组（t=6.15，P<0.01），而 CD19⁺IL-10⁺CD24^intCD38^int B 细胞含量在 2 组间比较差异无统计学意义（t=1.78，P=0.08）。② CD19⁺IL-10⁺B 细胞和 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 细胞含量在 TIL中的含量明显高于在 NIL 中（分别为：t=11.67，P<0.01；t=19.64，P<0.01），而 CD19⁺IL-10⁺CD24^intCD38^intB 细胞和 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^– B 细胞含量在 TIL 中和 NIL 中比较差异无统计学意义（t=1.72，P=0.09；t=1.57，P=0.12）。

表1 CD19⁺ IL-10⁺ B 细胞及其亚群在研究组和对照组中的表达情况（%，

）

表选项

下载CSV

组别	n	CD19⁺IL-10⁺ B 细胞	CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 细胞	CD19⁺IL-10⁺CD24^intCD38^int B 细胞	CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^– B 细胞
研究组
PMBC	38	8.04±3.01^*	2.79±0.95^*	0.87±0.30	1.13±0.40^*
TIL	38	6.02±2.33^△	1.11±0.31^△	0.84±0.36	0.86±0.22
NIL	38	3.07±0.92	0.56±0.18	0.77±0.27	0.90±0.23
对照组
PMBC	37	3.31±1.09	1.13±0.53	0.77±0.21	1.75±0.48
与对照组 PMBC 比较，*P<0.01；与 NIL 比较，△P<0.01

2.3 CD19⁺IL-10⁺ B 细胞及其亚群与结直肠癌患者临床病理特征的相关性

结果见表 2。从表 2 可见，结直肠癌患者外周血中 CD19⁺IL-10⁺ B 细胞及亚群与患者性别、肿瘤位置及血清 CEA 浓度均无关，CD19⁺IL-10⁺ B 细胞及亚群 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 细胞均与肿瘤临床分期有关，即在中晚期（Ⅲ+Ⅳ期）结直肠癌中明显高于早期（Ⅰ+Ⅱ期）者（t=5.39，P<0.01；t=3.13，P<0.01），但未发现 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^– B 细胞和 CD19⁺IL-10⁺CD24^intCD38^int B 细胞与肿瘤临床分期有关（P>0.05）。

表2 外周血中各细胞亚群占 CD19⁺ B 总细胞的比例与结直肠癌患者临床病理特征的关系（%）

表选项

下载CSV

临床病理特征	n	CD19⁺IL-10⁺ B 细胞		CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^– B 细胞		CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 细胞		CD19⁺IL-10⁺CD24^intCD38^int B 细胞
性别
男	24	7.99±3.17	0.15	0.88	1.21±0.40	1.62	0.11	2.81±0.80	0.77	0.45	0.91±0.28	1.19	0.24
女	14	8.14±2.83	1.00±0.38	2.58±1.04	0.80±0.31
肿瘤位置
结肠	26	8.40±2.69	1.10	0.28	1.14±0.42	0.21	0.84	2.87±0.86	0.77	0.45	0.85±0.33	0.69	0.49
直肠	12	7.26±3.61	1.11±0.37	2.61±1.16	0.92±0.20
肿瘤分期
Ⅰ+Ⅱ	15	5.58±2.02	5.39	<0.01	1.00±0.33	1.67	0.10	2.25±1.06	3.13	<0.01	0.85±0.28	0.28	0.78
Ⅲ+Ⅳ	23	9.65±2.42	1.22±0.43	3.14±0.70	0.88±0.31
CEA
≥5 μg/L	24	8.28±3.19	0.63	0.53	1.18±0.41	1.03	0.31	2.98±0.90	1.68	0.10	0.90±0.28	0.70	0.49
<5 μg/L	14	7.64±2.76	1.05±0.39	2.46±0.99	0.83±0.33

3 讨论

Breg 是具有免疫调节或免疫抑制特性的 B 细胞的特殊亚群。但 Breg 自发现以来，未发现类似于 Treg 中的作为标志的核转录因子 FoxP3 那样的特定表面标志物^[23]，但 Breg 分泌的各种细胞因子与抑制肿瘤免疫效应有关，主要有 IL-10、IL-35、IL-6 和转化生长因子-β，其调节功能主要由 IL-10 发挥，因此，IL-10 仍然是定义人 Breg 的最佳表型标志物^[24-25]。CD19 是鉴定 B 细胞最好的标志，CD24 是鉴定 B 细胞等成熟与否的标志，在外周血中 CD38 表达于 T 和 B 细胞。Carsetti 等^[22]将 CD19⁺ B 细胞分为 3 种不同的 B 细胞亚群即 CD19⁺CD24^hiCD38^hi B 细胞（包含未成熟 B 细胞）、CD19⁺CD24^intCD38^int B 细胞（主要是成熟 B 细胞）和 CD19⁺CD24^hiCD38^– B 细胞（主要是记忆 B 细胞），各亚群分泌 IL-10 能力不同，在免疫方面具有不同的功能^{[19, 26]}。在胃癌^[19]研究中，CD19⁺IL-10⁺ B 细胞具有免疫抑制功能，其中主要是 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 细胞具有免疫调节功能，促进了肿瘤的进展，而 CD19⁺IL-10⁺CD24^intCD38^int B 细胞和 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^– B 细胞都能表达 IL-10，但未发现其免疫抑制功能，具体原因不明，猜测可能原因是该两种细胞 IL-10 表达量低于 CD19⁺IL-10⁺CD24 ^hiCD38^hi B 细胞有关。因此，这 3 种亚群细胞虽然都能表达 IL-10，但不是都具有免疫抑制功能，是否与 CD24 与 CD38 的高表达情况有关还需要进一步探讨。

Shimabukuro-Vornhagen 等^[27]在结直肠癌研究中提出 CD19⁺CD20⁺CD24^hiCD38^hi B 细胞具有免疫调节功能，但该细胞亚群在结直肠癌患者和健康人外周血中并无明显差别，可能是研究中未分析与 IL-10之间的免疫关系。目前关于 CD19⁺IL-10⁺ B 细胞与结直肠癌之间的研究较少，CD19⁺IL-10⁺ B 细胞的所有亚群是否在结直肠癌中都具有免疫调节功能在国内外研究中未见报道。因此，本研究探讨了 CD19⁺IL-10⁺ B 细胞亚群含量在结直肠癌中的变化及其可能临床意义。

在本研究中发现，在结直肠癌患者外周血中 CD19⁺IL-10⁺ B 细胞含量明显高于健康自愿者、在结直肠癌患者的癌组织中明显高于其相应的癌旁组织，这与在其他研究^{[19, 21]}结果基本一致。结果提示，结直肠癌中 CD19⁺IL-10⁺ B 细胞具有免疫调节功能，促进了肿瘤的进展，其中可能主要是 IL-10 发挥了免疫抑制功能并参与了肿瘤微环境的免疫调节。

CD19⁺IL-10⁺ B 细胞各亚群是否都具有免疫调节功能目前尚不清楚，因此，本研究对此进行了研究。结果发现，CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 细胞亚群在结直肠癌患者的外周血中明显高于健康对照组，且在结直肠癌患者的癌组织中明显高于癌旁组织，结果提示，该亚群发挥了免疫抑制功能，这与其他研究^{[19, 28]}结论较一致，但这与 Shimabukuro-Vornhagen 等^[27]的研究结果不同，可能原因是该研究中并没有包括 IL-10，且以 CD19⁺CD20⁺ B 淋巴细胞进行设门，门控策略方式不同，导致在结直肠癌患者和健康人外周血中并没有明显的区别。

CD19⁺IL-10⁺CD24^intCD38^int B 细胞亚群在结直肠癌与健康对照组患者的外周血以及结直肠癌患者的癌组织及其相应的癌旁组织之间均无明显差别，这与胃癌的结论不一致^[19]，具体原因还需更多的研究进行分析。CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^– B 细胞含量在结直肠癌患者的外周血中低于健康对照组，这与其他研究^{[19, 26]}结论相似，但在结直肠癌患者的癌组织与其相应的癌旁组织之间无明显差别，结果提示，该亚群可能具有促进肿瘤免疫的功能，但在肿瘤微环境中却无明显变化，这需要更多的研究来探讨该亚群在全身和局部微环境之间的表现差异以及可能的免疫机制。

本研究还分析了结直肠癌患者的外周血中 CD19⁺IL-10⁺ B 细胞及其亚群与不同临床病理因素的关系，结果发现，CD19⁺IL-10⁺ B 细胞及其亚群与结直肠癌患者的性别、肿瘤位置及 CEA 浓度之间无明显关系，但发现了 CD19⁺IL-10⁺ B 细胞及 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 细胞与结直肠癌的临床分期有关，即在中晚期（Ⅲ+Ⅳ期）结直肠癌中的含量是明显高于早期（Ⅰ+Ⅱ期）者，这在其他消化道肿瘤中也有类似结论，如在胃癌研究中也发现 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 细胞含量随着 TNM 分期增加是明显增高的^[19]。结果提示，CD19⁺IL-10⁺ B 细胞及 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 细胞亚群可能与结直肠癌发生及进展有关。

总之，在结直肠癌患者外周血中 CD19⁺IL-10⁺ B 细胞含量明显高于健康自愿者、在结直肠癌患者的癌组织中明显高于其相应的癌旁组织的结果提示，CD19⁺IL-10⁺ B 细胞在肿瘤微环境中具有免疫抑制功能；但在其 3 种亚群中仅发现 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 细胞亚群在其中有明显差别，可见 IL-10 免疫抑制作用可能与 CD24 和 CD38 高表达有关，同样也说明该亚群可能具有抑制肿瘤局部免疫的特性，若能局部消除该亚群细胞或许可为结直肠癌靶向治疗提供新的方向。另外，结直肠癌患者外周血中 CD19⁺IL-10⁺ B 细胞和 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hiB 细胞含量在Ⅲ+Ⅳ期结直肠癌的含量均明显高于Ⅰ+Ⅱ期，而在其他两种亚群细胞中未见这种规律，结果提示，结直肠癌中 CD19⁺IL-10⁺ B 细胞可能具促进肿瘤进展的作用，并且其中主要是 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 细胞发挥作用的，而其他两种亚群细胞可能并没有发挥免疫调节功能，可见，并不是所有 CD19⁺IL-10⁺ B 细胞亚群都发挥免疫抑制功能，所以可选择性地消除 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 细胞而非所有的 CD19⁺IL-10⁺ B 细胞，可能为结直肠癌靶向治疗提供了新的方向。但是由于本研究条件有限，未能进一步分选出 CD19⁺IL-10⁺ B 细胞亚群进行更多体外实验的功能和机制的探讨，且目前 Breg 特异性表型及转录因子并不明确，还需要更多研究探讨 Breg 免疫调控机制。

重要声明

利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。

作者贡献声明：许杰负责实验及文章的撰写及投稿，陈小龙、胡欣雨、左宗林和陈鹏负责资料的收集，冯立波和邹庆伟负责文章的指导，夏冬负责研究的设计和指导。

伦理声明：本研究通过了西南医科大学附属医院伦理委员会审批（伦理编号：KY2017129）。