引用本文： 于婧, 王凤琴, 姚文娟, 吴冬梅, 刘大鹏. BRAFV600E 基因突变在 FNAB 易漏诊的高危甲状腺结节中的诊断价值. 中国普外基础与临床杂志, 2019, 26(9): 1083-1086. doi: 10.7507/1007-9424.201904098 复制
临床可触及或超声检查发现的甲状腺结节的发病率逐年升高，大多数甲状腺结节是良性的，恶性甲状腺肿瘤占 5%～15%[1]。医生面临的挑战是如何区分良性和恶性甲状腺病变，以确保每位患者得到及时和适当的治疗，同时尽量减少不必要的干预风险。超声引导下细针穿刺活检（fine-needle aspiration biopsy，FNAB）是目前最可靠的方法，已被应用于国内临床诊断工作中，然而其局限性包括无法诊断的样本、意义不明的非典型病变及存在假阴性和假阳性结果，占全部 FNAB 结果的 10%～40%[2]。FNAB 样本的分子检测已成为补充常规细胞学检查的重要工具[3]。鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌基因同源体 B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）V600E 基因突变作为甲状腺乳头状癌的特异性标志物，具有较高的阳性预测值（95.5%～100.0%）[4-5]。本研究拟检测 FNAB 易漏诊的具有高危超声特征的甲状腺结节中的 BRAFV600E 基因突变情况，对比联合 FNAB 和 BRAFV600E 基因突变检测与单独 FNAB 的术后病理符合率，以分析 BRAFV600E 基因突变检测的诊断价值。
1 资料与方法
1.1 临床资料
回顾性收集河北中石油中心医院于 2017 年1 月至 2018 年 12 月期间收治的术前进行超声检查且 FNAB 检测非阳性结果的甲状腺结节病例 122 例。纳入标准：① FNAB 为非阳性细胞学结果（包括无法诊断或不满意标本、良性病变及意义不明的非典型病变）；② 超声高危结果：甲状腺影像报告和数据系统（thyroid imaging reporting and data system，TI-RADS）分级 Ⅳ～Ⅴ 级，即提示至少1 项恶性征象（如实性结节、低回声、边界不清、微钙化、富于血供、纵横比≥1 等）；③ 为初治病例，术前未行射频消融、外照射、131I 治疗、化学治疗等其他辅助治疗；④ 可追踪到术后病理结果。排除标准：① 双盲法复阅 FNAB 薄片结果有争议的；② 临床病理资料不完整者。122 例患者的年龄为 17～66 岁、（40±14）岁；男 43 例，女 79 例；单一结节 105 例，多结节 17 例；结节直径 2～18 mm、（9.68±4.47）mm；FNAB 结果：无法诊断或不满意标本 25 例，良性病变 20 例，意义不明的非典型病变 77 例；超声 TI-RADS 分级：ⅣA 级 91 例，ⅣB 级 21 例，Ⅴ级 10 例；术后病理学类型：良性病变 85 例，甲状腺乳头状癌 37 例（其中包括微小甲状腺乳头状癌 12 例，滤泡亚型 2 例）。
1.2 FNAB
患者取仰卧位，头后仰，颈部垫高，充分暴露甲状腺，采用超声确定穿刺结节的部位及深度后消毒，在超声引导下用负压穿刺器反复不同角度抽吸 3～5 次，穿刺物立即置入液基保存液中，由康柏氏自动薄层液基细胞制片系统制成薄层细胞片，行巴氏染色，经两名病理医生以双盲法阅片。FNAB 细胞学诊断参照 Bethesda 报告系统标准[6]，分为：无法诊断或不满意标本、良性病变、意义不明的非典型病变、滤泡性肿瘤或可疑滤泡性肿瘤、可疑恶性肿瘤及恶性肿瘤。
1.3 BRAF 基因检测
按照上海凯杰（QIAGEN）公司的 DNA 提取试剂盒说明书提取液基保存液中剩余标本的 DNA，立即进行 PCR 检测。按照上海源奇生物医药科技有限公司的肿瘤相关基因突变检测人 BRAF 试剂盒说明（PCR 荧光探针法），行 PCR 扩增，再利用实时荧光 Taqman 探针法，通过荧光信号的变化，检测标本的 BRAFV600E 基因突变。每次试验必须同时进行阳性对照和阴性对照检测。
1.4 统计学方法
采用 SPSS 17.0 统计软件包行统计学处理。定量资料比较采用成组 t 检验，计数资料比较采用成组 χ2 检验、配对 χ2 检验或连续性校正的 χ2 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 BRAFV600E 基因突变检测结果
122 例甲状腺结节病例中，BRAFV600E 基因突变率为 27.0%（33/122）。BRAFV600E 基因突变阳性率随着超声 TI-RADS 分级的增高而增高（P<0.05），而与患者年龄、性别、结节数目、结节直径及 FNAB 结果均无关（P>0.05），见表 1。
表1
122 例甲状腺结节的 BRAFV600E基因突变检测结果
2.2 FNAB 联合 BRAFV600E 基因突变检测对术后病理符合率的影响
122 例甲状腺结节的术后病理结果：良性病变 85 例，甲状腺乳头状癌 37 例（包括微小甲状腺乳头状癌 12 例，滤泡亚型 2 例）。FNAB 检测参照 Bethesda 报告系统标准全部为非阳性结果：无法诊断或不满意标准 25 例，良性病变 20 例，意义不明的非典型病变 77 例。术后病理为良性者判定为符合，符合率为 69.7%（85/122）；术后病理为癌者判定为不符合，即假阴性结果，假阴性率为 100%（37/37）。具体见表 2。
表2
单独 FNAB 检测与术后病理检查结果
FNAB 联合 BRAFV600E 基因突变检测时，二者至少 1 项阳性者为阳性结果，其术后病理诊断为甲状腺癌者判定为符合，否则为不符合；FNAB 检测结果为非阳性且 BRAFV600E 基因突变阴性时为阴性结果，若其术后病理为良性则判定为符合，否则不符合。本研究结果显示，FNAB 联合 BRAFV600E 基因突变检测结果与术后病理的符合率为 86.9%（106/122），假阴性率为 27.0%（10/37），假阳性率为 7.1%（6/85），具体见表 3。6 例假阳性样本的术后病理：2 例慢性淋巴细胞性甲状腺炎，3 例结节性甲状腺肿，1 例伴乳头状核特征的非浸润性滤泡性肿瘤；10 例假阴性样本经其他机构检测出 2 例 RAS 基因突变，没有发现 RET/PTC 基因重排。FNAB 联合 BRAFV600E 基因突变检测的符合率高于单独 FNAB 检测，差异有统计学意义（χ2=10.630，P=0.001）。
表3
FNAB 联合 BRAFV600E 基因突变检测与术后病理检查结果
3 讨论
根据 2016 年美国临床内分泌学会、美国内分泌学院和美国医学会的内分泌指南，具有高度可疑超声特征的甲状腺结节，恶性肿瘤的风险为 50%～90%[7]。FNAB 是目前甲状腺结节诊断中可靠的非手术方法，然而它并不是一种精准的检测方法，部分病例无法明确诊断，假阴性率为 3.6%～10.2%[8]，这些不明确或假阴性的诊断会使随后的临床治疗复杂化。当超声学和细胞学检测结果不一致时，以往的方法是超声随诊、重复 FNAB 或诊断性切除[9]。
文献[10-12]报道，BRAF 基因 V600E 点突变是甲状腺乳头状癌最常见的分子遗传学事件，其突变率为 69%～85.3%。BRAF 基因突变模式涵盖 65 余种，大部分位于 15 外显子的催化激酶区，即 V600E 点突变。BRAFV600E 基因突变导致 BRAF 蛋白激酶过度表达，异常激活有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路[13]，进而影响多种复杂途径，导致肿瘤细胞增生，如抑制钠/碘共转运蛋白（NIS）的表达和放射性碘的摄取[14]，诱导炎症介质的表达[15-16]，改变细胞外基质蛋白骨桥蛋白的表达水平及影响细胞膜整合素受体的表达[17]。BRAFV600E 基因突变甲状腺乳头状癌具有高侵袭潜能及淋巴结转移的风险[18]，成为近年来靶向治疗研究的靶点[19-20]。因此，BRAFV600E 基因突变检测对甲状腺乳头状病变的良恶性鉴别诊断具有良好的应用价值，同时可作为独立的预后因子提示不良预后[21]。
经 FNAB 不能确诊的甲状腺结节，补充 BRAFV600E 基因突变检测能提高诊断的敏感性[22-23]，且有助于预测甲状腺乳头状癌淋巴结转移，便于制定手术方案[24-25]。Chen 等[26]的一项前瞻性研究中，292 例具有高危超声特征的良性细胞学结果的甲状腺结节中，检测出 36 例 BRAFV600E 突变阳性，术后 31 例为甲状腺癌，故 BRAFV600E 基因检测降低了细胞学的假阴性率。本研究对 122 例 FNAB 为非阳性细胞学结果且具有高危超声特征的甲状腺结节进行了 BRAFV600E 基因突变检测，与术后病理对比发现，FNAB 联合 BRAFV600E 基因突变检测的符合率（86.9%）高于单独 FNAB 检测的符合率（69.7%），BRAFV600E 基因突变检测可发现 FNAB 可能漏诊的甲状腺乳头状癌，这与文献[26]报道一致。
笔者建议，在具有超声高危特征的甲状腺结节中，常规行 FNAB 检测的同时进行 BRAFV600E 基因突变检测，并积极分析甲状腺癌相关的其他基因，如 RAS 基因突变和 RET/PTC 重排，有助于提高检测的准确性。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：于婧负责论文撰写和试验数据分析，王凤琴和姚文娟负责论文审修，吴冬梅协助试验设计及查阅文献，刘大鹏负责收集患者资料。
伦理声明：本研究已通过河北中石油中心医院的伦理审核批准。
志谢：感谢河北中石油中心医院病理科所有技师在制片和试验中给予的帮助。
临床可触及或超声检查发现的甲状腺结节的发病率逐年升高，大多数甲状腺结节是良性的，恶性甲状腺肿瘤占 5%～15%[1]。医生面临的挑战是如何区分良性和恶性甲状腺病变，以确保每位患者得到及时和适当的治疗，同时尽量减少不必要的干预风险。超声引导下细针穿刺活检（fine-needle aspiration biopsy，FNAB）是目前最可靠的方法，已被应用于国内临床诊断工作中，然而其局限性包括无法诊断的样本、意义不明的非典型病变及存在假阴性和假阳性结果，占全部 FNAB 结果的 10%～40%[2]。FNAB 样本的分子检测已成为补充常规细胞学检查的重要工具[3]。鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌基因同源体 B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）V600E 基因突变作为甲状腺乳头状癌的特异性标志物，具有较高的阳性预测值（95.5%～100.0%）[4-5]。本研究拟检测 FNAB 易漏诊的具有高危超声特征的甲状腺结节中的 BRAFV600E 基因突变情况，对比联合 FNAB 和 BRAFV600E 基因突变检测与单独 FNAB 的术后病理符合率，以分析 BRAFV600E 基因突变检测的诊断价值。
1 资料与方法
1.1 临床资料
回顾性收集河北中石油中心医院于 2017 年1 月至 2018 年 12 月期间收治的术前进行超声检查且 FNAB 检测非阳性结果的甲状腺结节病例 122 例。纳入标准：① FNAB 为非阳性细胞学结果（包括无法诊断或不满意标本、良性病变及意义不明的非典型病变）；② 超声高危结果：甲状腺影像报告和数据系统（thyroid imaging reporting and data system，TI-RADS）分级 Ⅳ～Ⅴ 级，即提示至少1 项恶性征象（如实性结节、低回声、边界不清、微钙化、富于血供、纵横比≥1 等）；③ 为初治病例，术前未行射频消融、外照射、131I 治疗、化学治疗等其他辅助治疗；④ 可追踪到术后病理结果。排除标准：① 双盲法复阅 FNAB 薄片结果有争议的；② 临床病理资料不完整者。122 例患者的年龄为 17～66 岁、（40±14）岁；男 43 例，女 79 例；单一结节 105 例，多结节 17 例；结节直径 2～18 mm、（9.68±4.47）mm；FNAB 结果：无法诊断或不满意标本 25 例，良性病变 20 例，意义不明的非典型病变 77 例；超声 TI-RADS 分级：ⅣA 级 91 例，ⅣB 级 21 例，Ⅴ级 10 例；术后病理学类型：良性病变 85 例，甲状腺乳头状癌 37 例（其中包括微小甲状腺乳头状癌 12 例，滤泡亚型 2 例）。
1.2 FNAB
患者取仰卧位，头后仰，颈部垫高，充分暴露甲状腺，采用超声确定穿刺结节的部位及深度后消毒，在超声引导下用负压穿刺器反复不同角度抽吸 3～5 次，穿刺物立即置入液基保存液中，由康柏氏自动薄层液基细胞制片系统制成薄层细胞片，行巴氏染色，经两名病理医生以双盲法阅片。FNAB 细胞学诊断参照 Bethesda 报告系统标准[6]，分为：无法诊断或不满意标本、良性病变、意义不明的非典型病变、滤泡性肿瘤或可疑滤泡性肿瘤、可疑恶性肿瘤及恶性肿瘤。
1.3 BRAF 基因检测
按照上海凯杰（QIAGEN）公司的 DNA 提取试剂盒说明书提取液基保存液中剩余标本的 DNA，立即进行 PCR 检测。按照上海源奇生物医药科技有限公司的肿瘤相关基因突变检测人 BRAF 试剂盒说明（PCR 荧光探针法），行 PCR 扩增，再利用实时荧光 Taqman 探针法，通过荧光信号的变化，检测标本的 BRAFV600E 基因突变。每次试验必须同时进行阳性对照和阴性对照检测。
1.4 统计学方法
采用 SPSS 17.0 统计软件包行统计学处理。定量资料比较采用成组 t 检验，计数资料比较采用成组 χ2 检验、配对 χ2 检验或连续性校正的 χ2 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 BRAFV600E 基因突变检测结果
122 例甲状腺结节病例中，BRAFV600E 基因突变率为 27.0%（33/122）。BRAFV600E 基因突变阳性率随着超声 TI-RADS 分级的增高而增高（P<0.05），而与患者年龄、性别、结节数目、结节直径及 FNAB 结果均无关（P>0.05），见表 1。
表1
122 例甲状腺结节的 BRAFV600E基因突变检测结果
2.2 FNAB 联合 BRAFV600E 基因突变检测对术后病理符合率的影响
122 例甲状腺结节的术后病理结果：良性病变 85 例，甲状腺乳头状癌 37 例（包括微小甲状腺乳头状癌 12 例，滤泡亚型 2 例）。FNAB 检测参照 Bethesda 报告系统标准全部为非阳性结果：无法诊断或不满意标准 25 例，良性病变 20 例，意义不明的非典型病变 77 例。术后病理为良性者判定为符合，符合率为 69.7%（85/122）；术后病理为癌者判定为不符合，即假阴性结果，假阴性率为 100%（37/37）。具体见表 2。
表2
单独 FNAB 检测与术后病理检查结果
FNAB 联合 BRAFV600E 基因突变检测时，二者至少 1 项阳性者为阳性结果，其术后病理诊断为甲状腺癌者判定为符合，否则为不符合；FNAB 检测结果为非阳性且 BRAFV600E 基因突变阴性时为阴性结果，若其术后病理为良性则判定为符合，否则不符合。本研究结果显示，FNAB 联合 BRAFV600E 基因突变检测结果与术后病理的符合率为 86.9%（106/122），假阴性率为 27.0%（10/37），假阳性率为 7.1%（6/85），具体见表 3。6 例假阳性样本的术后病理：2 例慢性淋巴细胞性甲状腺炎，3 例结节性甲状腺肿，1 例伴乳头状核特征的非浸润性滤泡性肿瘤；10 例假阴性样本经其他机构检测出 2 例 RAS 基因突变，没有发现 RET/PTC 基因重排。FNAB 联合 BRAFV600E 基因突变检测的符合率高于单独 FNAB 检测，差异有统计学意义（χ2=10.630，P=0.001）。
表3
FNAB 联合 BRAFV600E 基因突变检测与术后病理检查结果
3 讨论
根据 2016 年美国临床内分泌学会、美国内分泌学院和美国医学会的内分泌指南，具有高度可疑超声特征的甲状腺结节，恶性肿瘤的风险为 50%～90%[7]。FNAB 是目前甲状腺结节诊断中可靠的非手术方法，然而它并不是一种精准的检测方法，部分病例无法明确诊断，假阴性率为 3.6%～10.2%[8]，这些不明确或假阴性的诊断会使随后的临床治疗复杂化。当超声学和细胞学检测结果不一致时，以往的方法是超声随诊、重复 FNAB 或诊断性切除[9]。
文献[10-12]报道，BRAF 基因 V600E 点突变是甲状腺乳头状癌最常见的分子遗传学事件，其突变率为 69%～85.3%。BRAF 基因突变模式涵盖 65 余种，大部分位于 15 外显子的催化激酶区，即 V600E 点突变。BRAFV600E 基因突变导致 BRAF 蛋白激酶过度表达，异常激活有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路[13]，进而影响多种复杂途径，导致肿瘤细胞增生，如抑制钠/碘共转运蛋白（NIS）的表达和放射性碘的摄取[14]，诱导炎症介质的表达[15-16]，改变细胞外基质蛋白骨桥蛋白的表达水平及影响细胞膜整合素受体的表达[17]。BRAFV600E 基因突变甲状腺乳头状癌具有高侵袭潜能及淋巴结转移的风险[18]，成为近年来靶向治疗研究的靶点[19-20]。因此，BRAFV600E 基因突变检测对甲状腺乳头状病变的良恶性鉴别诊断具有良好的应用价值，同时可作为独立的预后因子提示不良预后[21]。
经 FNAB 不能确诊的甲状腺结节，补充 BRAFV600E 基因突变检测能提高诊断的敏感性[22-23]，且有助于预测甲状腺乳头状癌淋巴结转移，便于制定手术方案[24-25]。Chen 等[26]的一项前瞻性研究中，292 例具有高危超声特征的良性细胞学结果的甲状腺结节中，检测出 36 例 BRAFV600E 突变阳性，术后 31 例为甲状腺癌，故 BRAFV600E 基因检测降低了细胞学的假阴性率。本研究对 122 例 FNAB 为非阳性细胞学结果且具有高危超声特征的甲状腺结节进行了 BRAFV600E 基因突变检测，与术后病理对比发现，FNAB 联合 BRAFV600E 基因突变检测的符合率（86.9%）高于单独 FNAB 检测的符合率（69.7%），BRAFV600E 基因突变检测可发现 FNAB 可能漏诊的甲状腺乳头状癌，这与文献[26]报道一致。
笔者建议，在具有超声高危特征的甲状腺结节中，常规行 FNAB 检测的同时进行 BRAFV600E 基因突变检测，并积极分析甲状腺癌相关的其他基因，如 RAS 基因突变和 RET/PTC 重排，有助于提高检测的准确性。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：于婧负责论文撰写和试验数据分析，王凤琴和姚文娟负责论文审修，吴冬梅协助试验设计及查阅文献，刘大鹏负责收集患者资料。
伦理声明：本研究已通过河北中石油中心医院的伦理审核批准。
志谢：感谢河北中石油中心医院病理科所有技师在制片和试验中给予的帮助。
