引用本文： 李学华, 邢玉辉, 刘志恒, 姜小红, 侯旭. miR-141-3p 在肝细胞癌组织中的表达及其靶基因与肝细胞癌恶性特征的关系. 中国普外基础与临床杂志, 2019, 26(10): 1175-1183. doi: 10.7507/1007-9424.201905007 复制
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常见的恶性肿瘤致死病因之一[1]。其发展是一个多步骤、多因素相互作用的复杂过程，涉及许多癌基因和（或）抑癌基因的失调[2]。了解 HCC 发展的潜在机制对于开展新的治疗方法非常重要。高尔基体蛋白 73（Golgi protein 73，GP73）是一种高尔基体糖蛋白，主要在胆管上皮细胞中表达，而在正常肝脏的肝细胞中则很少见[3]。有研究[4-6]表明，GP73 可作为一种新的 HCC 血清标志物。在之前的荟萃分析中，笔者团队[7]发现，GP73 与中国 HCC 患者肝切除术后的预后不良密切相关。然而，GP73 在 HCC 发生、发展及转移中的上下游调控因子尚未完全确定。微小 RNA（miR）是小的非编码 RNA，长度约为 22 个核苷酸，其在多种生理和病理过程中发挥着关键作用[8-9]。越来越多的研究[8-9]表明，异常的 miR 水平与人类各种疾病（如癌症）密切相关，这为开展新的诊断、治疗及预后策略研究提供了新的途径。近年来的大量研究[9-11]发现，HCC 的发生发展与许多 miR 相关，包括 miR-148a、miR-124、miR-203、miR-138、miR-122、miR-30a-5p 等，但 miR 在 HCC 进展和转移中的作用仍未完全了解。鉴于 GP73 在 HCC 的诊断和预后中的重要作用[4-7]，笔者预测了可以靶向调控 GP73 的 miRs；在生物信息学分析中，笔者团队发现，miR-141-3p 可能调节 GP73。因此，本研究选择在 HCC 中进一步研究 miR-141-3p。在这项研究中，笔者团队通过体外研究初步证明，miR-141-3p 抑制 HCC 的发展和转移，且 GP73 过表达可部分逆转此过程。
1 材料与方法
1.1 研究对象
回顾性收集聊城市人民医院肝胆外科于 2008 年 1 月至 2015 年 6 月期间通过手术切除治疗的 56 例 HCC 及其配对的癌旁组织标本（距离肿瘤边缘以远 2 cm）；在切除后 30 min 内，将标本快速冷冻并储存在–80℃液氮中。56 例患者中，男 30 例，女 26 例，男女比为 1.2∶1.0；年龄 33～74 岁，中位年龄为 50 岁。HCC 直径 2～13 cm，中位数为 5.6 cm，其中≤5 cm 14 例；临床 TNM 分期：Ⅰ期 5 例，Ⅱ期 6 例，Ⅲ期 41 例，Ⅳ期 4 例；肿瘤分化等级依据肝癌的 Edmondson-Steiner 病理分级划分：Ⅰ级 4 例，Ⅱ级 20 例，Ⅲ级 24 例，Ⅳ级 8 例；血管侵犯 42 例，HBsAg 阳性 48 例，合并肝硬变 42 例。所有患者术前均未接受放疗和（或）化疗。所有标本均经病理科病理确诊并经患者知情同意后获得。
1.2 主要材料、试剂和设备
各 HCC 细胞系（包括 HepG2、PLC、Huh-7、MHCC-97H 和 HCC-LM3 细胞系）、正常肝细胞细胞系 LO2 和人胚肾（HEK）293T 细胞系来自 ATCC 细胞库（美国）。Trizol 及 Lipofection2000 购于美国 Invitrogen 公司，DMEM 或 RPMI-1640 培养基系美国赛默飞世尔科技公司产品，RT-PCR 试剂盒、Reverse Transcriptase 试剂盒、Q-PCR 荧光染料 SYRR Green 及 miRs PrimeScript RT reagent Kit 购于日本 TaKaRa 公司，hsa-miR-141-3p 引物和内源性 U6 购于广州复能基因公司，Anti-GP73 羊多抗购于美国 Santa 公司，抗 GAPDH 购于美国 Invitrogen 公司，荧光定量 PCR 仪购于美国 ABI 公司，Transwell 小室购于美国康宁公司，噻唑蓝（MTT）试剂盒购于日本西格玛奥德里奇公司，二甲基亚矾（DMSO）购于上海生工公司，荧光素酶报告载体 psiCHECK-2 购于美国 Promega 公司，EdU Apollo®488 体外成像试剂盒系中国 Ribobio 公司产品，Alpha FluorChem E 系统系美国 ProteinSimple 公司产品。
1.3 细胞培养
HCC 细胞系（包括 MHCC-97H、HCC-LM3、HepG2、PLC 和 Huh-7）、正常肝细胞细胞系 LO2 和人胚肾（HEK）293T 细胞系，在 37℃，5% CO2 及补充有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 或 RPMI-1640 培养基中培养。
1.4 RNA 抽提、逆转录反应及 qRT-PCR 检测
参照 Trizol 说明书从冷冻肝组织和培养的细胞中提取总 RNA。在定量 RNA 浓度后，根据制造商的说明书使用 Reverse Transcriptase 试剂盒构建 cDNA 文库。使用 Q-PCR 试剂盒检测 GP73 mRNA 和 miR-141-3p 的表达水平，并使用内源性 U6 进行标准化。GP73 基因的上游引物：5′-CAGCGCTGATTTTGAGATGA-3′，下游引物：5′-ATGATCCGTGTCTGGAGGTC-3′，扩增长度为 156 bp。内参 α-tubulin 的上游引物：5′-CACCCGTCTTCAGGGCTTCTTGGTTT-3′，下游引物：5′-CATTTCACCATCTGGTTGGCTGGCTC-3′，扩增长度为 527 bp。miR-141-3p 引物购于广州复能基因公司，使用专利算法设计并经过实验确证，说明书中未提供。mRNA 的表达水平使用 2–△△CT方法计算。各细胞系中 miR-141-3p 的表达水平的检测均重复检测 3 次。
1.5 Western blot 检测
将组织或培养的细胞在 RIPA 缓冲液中裂解并离心以收集上清液（4℃，12 000 r/min 离心 5 min，r=9.5 cm）。使用标准 Western blot 方案分离蛋白。杂交一抗，包括抗 GP73 及抗 GAPDH，然后与相应的二抗孵育，最后使用 Alpha FluorChem E 系统使结合的蛋白可视化。
1.6 选择调节 GP73 的 miR
miR 是 HCC 发展中的重要调节因子。为了寻找在 HCC 中调节 GP73 的潜在 miR，本研究通过 microRNA.org 数据库、TargetScanHuman 7.1 及 MIRDB 来预测靶向 GP73 的 miR。使用 DIANA-TarBase v7.0 和 KEGG pathway 数据库对上述 miR 进一步分析，以探索调节 GP73 的 miR。
1.7 双荧光素酶报告基因实验
为了验证上述选择的 miR 与 GP73 的靶向调节关系，本研究扩增并克隆了 GP73 野生型 3′UTR（UTR 为非翻译区），包括 miR-141-3p 的预测结合位点和两个突变体，并将上述 DNA 片段克隆至荧光素酶报告载体 psiCHECK-2。将 293T 细胞以 1×106 个/孔的密度接种在 24 孔板中，在 37℃、5% CO2 条件下培养 24 h。在细胞生长至细胞密度达到 50% 时，混匀 1.5 μg Lipofectamine 2000、GP73-WT（GP73 野生型）/GP73-MT1（GP73 突变型 1）/GP73-MT2（GP73 突变型 2）和 50 mmol/L miR-141-3p 模拟物（mimics）、空载体或阴性对照（miR-NC）后共转染细胞，即分为 7 组：空载体+mimics 组、GP73-WT+mimics 组、GP73-WT+miR-NC 组、GP73-MT1+miR-NC 组、GP73-MT1+mimics 组、GP73-MT2+miR-NC 组和 GP73-MT2+mimics 组。转染后 48 h，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞，并在 Passive Lysis 缓冲液中裂解 15 min，然后在 4℃下以 12 000 r/min 离心 2 min（r=9.5 cm）。每组 3 个复孔。根据双荧光素酶报告载体制造商的说明书收集细胞上清液用于荧光素酶测定。
1.8 细胞增殖试验
为了检测 miR-141-3p 对 HCC 细胞活力和增殖速率的影响，分别进行 MTT 和 EdU 测定。在 MTT 测定中，将 Huh-7 和 MHCC-97H 细胞（在肝癌细胞系中，Huh-7 及 MHCC-97H 细胞侵袭性相对较高，具有代表性）以 2×103 个细胞/孔的密度接种在 96 孔板中，每种细胞系分为 3 组，每组 5 个复孔，在培养 24 h 后转染。空白对照组不加入任何试剂、miR-NC 组加入 100 μL 的阴性对照 miR，miR-141-3p 组加入 100 μL 的 miR-141-3p 慢病毒载体。转染 1 d 后检测细胞中 miR-141-3p 的表达水平。根据试剂盒说明书在转染第 1、2、3 和 4 天测量 Huh-7 细胞的吸光度（A）值，以反映细胞增殖率。
在 EdU 测定中，细胞分组同 MTT 测定，分别用 miR-141-3p 和阴性对照 miR 转染 Huh-7 和 MHCC-97H 细胞。温育 24 h 后，将细胞以 6×103个/孔的密度接种在 96 孔板中，并向每个孔中加入新鲜制备的 50 μmol EdU 100 μL。在 EdU 标记 3 h 后，洗涤细胞，固定并用 Hoechst 33342 复染。使用 EdU Apollo®488 体外成像试剂盒获得图像。细胞增殖率为增殖细胞（EdU 阳性细胞）占视野下细胞总数的百分比（1 个视野，200 倍）。将没有慢病毒转染的细胞作为空白对照组。每组 5 个复孔，每种条件复测 3 次（取均值）。
1.9 Transwell 侵袭迁移实验
Transwell 侵袭迁移实验时，MHCC-97H 细胞分组及转染操作同 MTT 实验部分（MHCC-97H 细胞侵袭性较 Huh-7 更强，更具有代表性，故本部分实验选择该类型细胞系），每组 5 个复孔。转染 24 h后，将细胞以 1×105 个/孔接种在涂有基质胶的 Transwell 的上室中，将其插入 24 孔板中用于侵袭实验。下室含有补充有 5% FBS 的培养基。培养 24 h后，将迁移的细胞用 0.1% 结晶紫染色 20 min 后，以 PBS 清洗 2 次，在 400 倍显微镜下随机选取观察 3 个不同视野的细胞数计数，取均值。
迁移实验步骤与以上侵袭实验基本一致，但本部分实验中，笔者团队在未涂基质胶的 Transwell 上室接种 1×106 个细胞/孔并向下室添加含有 2.5% FBS 的培养基。
在细胞功能学回复实验部分，笔者团队在阴性对照 miR 模拟物组（加入 mimic NC）、空白对照组（未加入任何试剂）及 miR-141-3p 组（加入 miR-141-3p 慢病毒载体）基础上，又增加 miR-141-3p+GP73-NC 组（miR-141-3p 慢病毒载体+空质粒）及 miR-141-3p+GP73 组（miR-141-3p 慢病毒载体+GP73 质粒）。转染 24 h 后，将细胞以 1×105 个/孔接种在 Transwell 上室中，具体步骤与以上实验基本一致。
1.10 统计学方法
使用 SPSS 18.0 软件进行统计分析。以均值±标准差（
±s）表示计量资料。HCC 组及其癌旁组织标志物表达水平的比较采用配对 t 检验；多组比较采用方差分析（两两比较采用 LSD-t 检验方法）；两参数间的关系应用 Pearson 简单相关进行分析。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 GP73 mRNA 及其蛋白在 HCC 组织中的表达显著上调
在本研究中，笔者团队首先检测了 1 组 HCC 癌组织及其配对的癌旁组织中 GP73 mRNA 的表达，qRT-PCR 结果显示，HCC 组织中 GP73 mRNA 的表达水平与邻近的癌旁组织相比，GP73 mRNA 的表达显著上调（P<0.05）），见图 1a。Western blot（图 1b）结果证实，GP73 蛋白的表达水平在 HCC 组织中也显著上调。
图1
示 HCC 组织及其癌旁组织中 GP73 mRNA 及其蛋白的表达、3 类数据库均可预测到的共同交叉 miR、miR-141-3p 模拟物或阴性对照的共转染结果、HCC 细胞系和临床标本中 miR-141-3p 的表达水平、HCC 组织中 miR-141-3p 与 GP73 mRNA 表达关系的散点图、转染后 HCC 细胞中 miR-141-3p 的表达及 miR-141-3p 对 Huh-7 细胞增殖能力的影响
a 和 b：HCC 组织及其癌旁组织中 GP73 mRNA（a）及其蛋白（b）的表达，T 表示 HCC 组织，A 表示癌旁组织；c：3 类数据库预测的 miR 结果；d：miR-141-3p 模拟物或阴性对照的共转染结果，与其他组别比较，*
2.2 miR-141-3p 靶向 GP73 且与 HCC 组织中 GP73 mRNA 的表达水平呈负相关
microRNA.org 数据库、TargetScanHuman 7.1 及 MIRDB 均可预测到的 miR 有 5 种，分别是 miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-342-3p、miR-141-3p 及 miR-143-3p，其预测结果见图 1c。使用 DIANA-TarBase v7.0 和 KEGG pathway 数据库对上述 miR 进一步分析，结果显示，miR-141-3p 具有最高的调节 GP73 的潜力。因此，本研究选择在 HCC 中研究 miR-141-3p 靶向 GP73 的调节作用。miR-141-3p 模拟物或阴性对照的共转染结果显示（图 1d），GP73-WT+mimics 组的相对荧光素酶活性低于其余 6 组（P<0.05），但其余 6 组比较差异无统计学意义（P>0.05），表明 GP73-WT 的 3´UTR 活性被 miR-141-3p 模拟物影响后显著降低，然而对突变体的 3´UTR 并未发现显著影响，这表明 miR-141-3p 通过与 3´UTR 结合直接调节 GP73。
2.3 HCC 细胞系和临床标本中 miR-141-3p 的表达水平
2.3.1 不同 HCC 细胞系、HCC 组织及其癌旁组织中 miR-141-3p 的表达水平
为了评估 miR-141-3p 在 HCC 进展中的变化，本研究首先检测了不同 HCC 细胞系中 miR-141-3p 的表达水平。本研究以 miR-141-3p 在 LO2 中的表达水平作为对照，设定其相对表达量为 1。结果表明，与正常肝细胞系 LO2 相比，各 HCC 细胞系中 miR-141-3p 的表达水平均降低（图 1e）。有趣的是，即使在 HCC 细胞系中，miR-141-3p 的表达水平也存在统计学上的差异：在高侵袭性 HCC 细胞系（MHCC-97H、HCC-LM3 和 Huh-7）中，其 miR-141-3p 的表达水平低于 HepG2 和 PLC 细胞系（P<0.05），且 Huh-7、MHCC-97H 和 HCC-LM3 的表达水平依次降低，两两比较差异均有统计学意义（P<0.05），但 HepG2 和 PLC 细胞系比较差异无统计学意义（P>0.05）。这与临床获取的 HCC 标本中的 miR-141-3p 表达水平的检测结果相一致：HCC 组织中 miR-141-3p mRNA 的表达水平低于匹配的相邻癌旁组织中的表达水平（图 1f），显示出与 GP73 mRNA 截然相反的表达模式（图 1a）。Pearson 简单相关分析结果表明，在 HCC 肿瘤标本中，miR-141-3p 的表达水平和 GP73 mRNA 的表达水平之间存在负相关（r=0.673，P<0.01），见图 1g。
2.3.2 miR-141-3p 的表达与 HCC 临床病理学特征的关系
本研究进一步分析 HCC 组织中 miR-141-3p表达与 HCC 进展之间的关系，包括 miR-141-3p 表达与患者年龄、性别、临床 TNM 分期、肿瘤分化等级、血管侵犯、肿瘤直径、HBsAg、AFP 等不同临床病理学特征或参数的关系，以 HCC 组织中 miR-141-3p 的相对表达水平的均数为基线，分为 miR-141-3p 高表达及低表达组。结果表明，miR-141-3p 低表达与较晚的临床 TNM 分期（P=0.006），低分化的肿瘤（P=0.002）和血管浸润性肿瘤（P=0.003）相关，而与其他临床病理学因素，包括年龄、性别、肿瘤直径、HBsAg、AFP 水平和肝硬变均无关（P>0.05），具体见表 1。
表1
HCC 组织中 miR-141-3p 的表达与其临床病理学特征的关系（例）
2.4 miR-141-3p 的过表达抑制 HCC 细胞的增殖、侵袭和迁移
为了深入了解 miR-141-3p 在 HCC 进展中的作用，接下来，我们利用 miR-141-3p 慢病毒转染了 Huh-7 和 MHCC-97H 细胞。qRT-PCR 结果显示，不管是在 Huh-7 细胞还是在 MHCC-97H 细胞中，与空白对照组和 miR-NC 组相比，miR-141-3p 组的 miR-141-3p 的表达水平均较高（P<0.05），但空白对照组与 miR-NC 组比较差异无统计学意义（P>0.05），提示 2 种细胞系在诱导后其 miR-141-3p 水平明显升高（图 1h），这也证实了 miR-141-3p 慢病毒的转染效率。
在 Huh-7 细胞的 MTT 实验中，从第 2 天开始，与空白对照组和 miR-NC 组相比，miR-141-3p 组的细胞增殖率均较低（P<0.05），且在第 4 天观察到最强的抑制（图 1i），但同时点空白对照组与 miR-NC 组比较差异无统计学意义（P>0.05）。
EdU 实验结果显示，不管是在 Huh-7 细胞还是在 MHCC-97H 细胞中，与空白对照组和 miR-NC 组相比，miR-141-3p 组的 EdU 阳性细胞比例均较低（P<0.05），但空白对照组与 miR-NC 组比较差异无统计学意义（P>0.05），提示在 Huh-7 和 MHCC-97H 细胞中观察到 miR-141-3p 过表达后的一致抑制作用（图 2a–2h）。
图2
示 EdU 检测结果（ ×200）、Transwell 侵袭迁移实验及细胞功能学回复实验结果
a–h：Huh-7 细胞和 MHCC-97H 细胞中，空白对照组（Huh-7 细胞：a；MHCC-97H 细胞：e）、miR-NC 组（Huh-7 细胞：b；MHCC-97H 细胞：f）和 miR-143-3p 组（Huh-7 细胞：c；MHCC-97H 细胞：g）的 EdU 阳性细胞染色结果和计数结果（Huh-7 细胞：d；MHCC-97H 细胞：h），与其余 2 组比较，*
2.5 miR-141-3p 过表达抑制 HCC 细胞的侵袭和迁移
通过以上不同方法，本研究证明了 miR-141-3p抑制 HCC 细胞的增殖。本研究进一步分析了 miR-141-3p 过表达对 HCC 细胞侵袭和迁移潜能的影响。Transwell 侵袭迁移实验结果（图 2i 和 2j）表明，与空白对照组和 miR-NC 组比较，miR-141-3p 组的细胞计数均较低（P<0.05），但空白对照组与 miR-NC 组比较差异无统计学意义（P>0.05）。该结果表明，体外 miR-141-3p 过表达显著抑制 HCC 细胞的侵袭和迁移潜力。
2.6 GP73 蛋白可部分逆转 miR-141-3p 在 HCC 细胞中的抑制作用
在前面的研究中，本研究首先探讨了 GP73 是否是 miR-141-3p 的靶标，并发现 GP73 和 miR-141-3p在 HCC 进展中的表达呈负相关。为了更好地理解 2 种基因在 HCC 进展中的机制作用，本研究用 miR-141-3p 慢病毒和表达 GP73 的质粒或空载体共转染 MHCC-97H 细胞。细胞功能学回复实验结果表明，在侵袭迁移实验中，与空白对照组和 miR-NC 组比较，miR-141-3p 组、miR-141-3p+GP73-NC 组及 miR-141-3p+GP73 组的细胞计数均较低（P<0.05），但空白对照组与 miR-NC 组比较、miR-141-3p 组和 miR-141-3p+GP73-NC 组比较差异均无统计学意义（P>0.05）；miR-141-3p 组及miR-141-3p+GP73-NC 组分别与miR-141-3p+GP73 组比较差异具有统计学意义（侵袭实验 P<0.001，迁移实验 P<0.05）。这说明，表达 GP73 的质粒可导致 miR-141-3p 抑制细胞侵袭和迁移的潜力部分丧失（图 2k 和图 2l）。
3 讨论
鉴于 GP73 是 HCC 诊断和预后的特异性血清标志物，在本研究中，笔者团队选择了 GP73 作为靶基因来预测参与 HCC 发展的上游 miR。通过搜索不同的数据库，本研究发现，miR-141-3p 具有调节 GP73 表达和影响 HCC 进展的最大潜力。qRT-PCR 结果显示，miR-141-3p 的表达水平与 GP73 mRNA 的表达呈负相关。此外，通过分析临床病理学特征，本研究发现，miR-141-3p 低表达与 HCC 进展显著相关，这与最近的报道[12]一致，即 miR-141-3p 的表达下调可能是 HCC 高侵袭性的原因。miR-141 与 miR-200c 一起形成簇，均属于 miR-200 家族[13]。既往研究[14]发现，血液循环中 miR-141 及 miR-200c 的水平在 HCC 患者中显著升高。因此，本研究结果与之前的研究结果共同揭示了 miR-141-3p 在 HCC 患者的诊断和复发监测中的明确意义；同时，miR-141-3p 也可能被认为是未来 HCC 患者的治疗靶标。
miR 在转录水平上可以通过与靶基因启动子结合，激活或抑制靶基因[15]；而在转录后水平上 miR 可以抑制靶基因翻译或通过结合其 3´UTR 区域引起靶 mRNA 降解[16]。在本研究中，荧光素酶测定结果显示，miR-141-3p 模拟物显著抑制 GP73 野生型的 3′UTR 活性，然而对突变型却未发现明显影响，这表明 miR-141-3p 在转录后水平上靶向调控 GP73。
既往的研究[17-19]表明，miR-141 在多种恶性肿瘤中的作用是有争议的。在晚期肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）中，miR-141-3p 与 miR-145-5p 的表达均下调；当过表达这 2 种 miR 时，则可明显抑制 RCC 细胞的迁移能力[17]。在另一项胃癌的研究[18]中，miR-141 通过靶向转录共激活因子与 PDZ 结合基序，从而抑制肿瘤生长和转移。然而，另外一项研究[19]发现，miR-141-3p 作为致癌基因促进前列腺癌细胞的增殖。这些研究表明，了解 miR-141-3p 功能最好的方法是研究其在特定肿瘤中的作用。在本研究中，笔者团队发现，体外实验中过表达 miR-141-3p 可抑制 HCC 细胞的增殖、侵袭及迁移，这表明 miR-141-3p 在 HCC 进展中作为抑癌基因发挥功能。
本研究的体外实验结果表明，GP73 部分但不完全逆转 miR-141-3p 对 HCC 的抑制作用。这与之前有关 miR-141-3p 通过多种不同基因调控 HCC 进展的研究[20-23]结果相一致。miR-141-3p 下调精子相关抗原 9（SPAG9）的表达后，再通过抑制 c-Jun 氨基末端激酶（JNK）通路而抑制 HCC 细胞的侵袭和转移[24]。另一项研究[25]表明，miR-141-3p 下调 T 淋巴瘤侵袭转移诱导因子 1（Tiam1）蛋白的表达并抑制 HCC 细胞的侵袭和迁移。这提示，进一步对其他基因的调控及分子途径激活的研究将有助于更深入了解 miR-141-3p 在 HCC 进展中的重要作用。
总之，本研究发现，miR-141-3p 作为抑癌基因，通过靶向调控 GP73 进而抑制 HCC 的进展。miR-141-3p-GP73 通路有希望成为 HCC 治疗的新靶点。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：李学华、邢玉辉及刘志恒涉及实验的具体操作及实施，并撰写论文；姜小红和侯旭，负责实验设计、数据统计、整理及论文撰写。
伦理声明：本研究已通过聊城市人民医院的伦理审核批准（批准文号：2016031）。
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常见的恶性肿瘤致死病因之一[1]。其发展是一个多步骤、多因素相互作用的复杂过程，涉及许多癌基因和（或）抑癌基因的失调[2]。了解 HCC 发展的潜在机制对于开展新的治疗方法非常重要。高尔基体蛋白 73（Golgi protein 73，GP73）是一种高尔基体糖蛋白，主要在胆管上皮细胞中表达，而在正常肝脏的肝细胞中则很少见[3]。有研究[4-6]表明，GP73 可作为一种新的 HCC 血清标志物。在之前的荟萃分析中，笔者团队[7]发现，GP73 与中国 HCC 患者肝切除术后的预后不良密切相关。然而，GP73 在 HCC 发生、发展及转移中的上下游调控因子尚未完全确定。微小 RNA（miR）是小的非编码 RNA，长度约为 22 个核苷酸，其在多种生理和病理过程中发挥着关键作用[8-9]。越来越多的研究[8-9]表明，异常的 miR 水平与人类各种疾病（如癌症）密切相关，这为开展新的诊断、治疗及预后策略研究提供了新的途径。近年来的大量研究[9-11]发现，HCC 的发生发展与许多 miR 相关，包括 miR-148a、miR-124、miR-203、miR-138、miR-122、miR-30a-5p 等，但 miR 在 HCC 进展和转移中的作用仍未完全了解。鉴于 GP73 在 HCC 的诊断和预后中的重要作用[4-7]，笔者预测了可以靶向调控 GP73 的 miRs；在生物信息学分析中，笔者团队发现，miR-141-3p 可能调节 GP73。因此，本研究选择在 HCC 中进一步研究 miR-141-3p。在这项研究中，笔者团队通过体外研究初步证明，miR-141-3p 抑制 HCC 的发展和转移，且 GP73 过表达可部分逆转此过程。
1 材料与方法
1.1 研究对象
回顾性收集聊城市人民医院肝胆外科于 2008 年 1 月至 2015 年 6 月期间通过手术切除治疗的 56 例 HCC 及其配对的癌旁组织标本（距离肿瘤边缘以远 2 cm）；在切除后 30 min 内，将标本快速冷冻并储存在–80℃液氮中。56 例患者中，男 30 例，女 26 例，男女比为 1.2∶1.0；年龄 33～74 岁，中位年龄为 50 岁。HCC 直径 2～13 cm，中位数为 5.6 cm，其中≤5 cm 14 例；临床 TNM 分期：Ⅰ期 5 例，Ⅱ期 6 例，Ⅲ期 41 例，Ⅳ期 4 例；肿瘤分化等级依据肝癌的 Edmondson-Steiner 病理分级划分：Ⅰ级 4 例，Ⅱ级 20 例，Ⅲ级 24 例，Ⅳ级 8 例；血管侵犯 42 例，HBsAg 阳性 48 例，合并肝硬变 42 例。所有患者术前均未接受放疗和（或）化疗。所有标本均经病理科病理确诊并经患者知情同意后获得。
1.2 主要材料、试剂和设备
各 HCC 细胞系（包括 HepG2、PLC、Huh-7、MHCC-97H 和 HCC-LM3 细胞系）、正常肝细胞细胞系 LO2 和人胚肾（HEK）293T 细胞系来自 ATCC 细胞库（美国）。Trizol 及 Lipofection2000 购于美国 Invitrogen 公司，DMEM 或 RPMI-1640 培养基系美国赛默飞世尔科技公司产品，RT-PCR 试剂盒、Reverse Transcriptase 试剂盒、Q-PCR 荧光染料 SYRR Green 及 miRs PrimeScript RT reagent Kit 购于日本 TaKaRa 公司，hsa-miR-141-3p 引物和内源性 U6 购于广州复能基因公司，Anti-GP73 羊多抗购于美国 Santa 公司，抗 GAPDH 购于美国 Invitrogen 公司，荧光定量 PCR 仪购于美国 ABI 公司，Transwell 小室购于美国康宁公司，噻唑蓝（MTT）试剂盒购于日本西格玛奥德里奇公司，二甲基亚矾（DMSO）购于上海生工公司，荧光素酶报告载体 psiCHECK-2 购于美国 Promega 公司，EdU Apollo®488 体外成像试剂盒系中国 Ribobio 公司产品，Alpha FluorChem E 系统系美国 ProteinSimple 公司产品。
1.3 细胞培养
HCC 细胞系（包括 MHCC-97H、HCC-LM3、HepG2、PLC 和 Huh-7）、正常肝细胞细胞系 LO2 和人胚肾（HEK）293T 细胞系，在 37℃，5% CO2 及补充有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 或 RPMI-1640 培养基中培养。
1.4 RNA 抽提、逆转录反应及 qRT-PCR 检测
参照 Trizol 说明书从冷冻肝组织和培养的细胞中提取总 RNA。在定量 RNA 浓度后，根据制造商的说明书使用 Reverse Transcriptase 试剂盒构建 cDNA 文库。使用 Q-PCR 试剂盒检测 GP73 mRNA 和 miR-141-3p 的表达水平，并使用内源性 U6 进行标准化。GP73 基因的上游引物：5′-CAGCGCTGATTTTGAGATGA-3′，下游引物：5′-ATGATCCGTGTCTGGAGGTC-3′，扩增长度为 156 bp。内参 α-tubulin 的上游引物：5′-CACCCGTCTTCAGGGCTTCTTGGTTT-3′，下游引物：5′-CATTTCACCATCTGGTTGGCTGGCTC-3′，扩增长度为 527 bp。miR-141-3p 引物购于广州复能基因公司，使用专利算法设计并经过实验确证，说明书中未提供。mRNA 的表达水平使用 2–△△CT方法计算。各细胞系中 miR-141-3p 的表达水平的检测均重复检测 3 次。
1.5 Western blot 检测
将组织或培养的细胞在 RIPA 缓冲液中裂解并离心以收集上清液（4℃，12 000 r/min 离心 5 min，r=9.5 cm）。使用标准 Western blot 方案分离蛋白。杂交一抗，包括抗 GP73 及抗 GAPDH，然后与相应的二抗孵育，最后使用 Alpha FluorChem E 系统使结合的蛋白可视化。
1.6 选择调节 GP73 的 miR
miR 是 HCC 发展中的重要调节因子。为了寻找在 HCC 中调节 GP73 的潜在 miR，本研究通过 microRNA.org 数据库、TargetScanHuman 7.1 及 MIRDB 来预测靶向 GP73 的 miR。使用 DIANA-TarBase v7.0 和 KEGG pathway 数据库对上述 miR 进一步分析，以探索调节 GP73 的 miR。
1.7 双荧光素酶报告基因实验
为了验证上述选择的 miR 与 GP73 的靶向调节关系，本研究扩增并克隆了 GP73 野生型 3′UTR（UTR 为非翻译区），包括 miR-141-3p 的预测结合位点和两个突变体，并将上述 DNA 片段克隆至荧光素酶报告载体 psiCHECK-2。将 293T 细胞以 1×106 个/孔的密度接种在 24 孔板中，在 37℃、5% CO2 条件下培养 24 h。在细胞生长至细胞密度达到 50% 时，混匀 1.5 μg Lipofectamine 2000、GP73-WT（GP73 野生型）/GP73-MT1（GP73 突变型 1）/GP73-MT2（GP73 突变型 2）和 50 mmol/L miR-141-3p 模拟物（mimics）、空载体或阴性对照（miR-NC）后共转染细胞，即分为 7 组：空载体+mimics 组、GP73-WT+mimics 组、GP73-WT+miR-NC 组、GP73-MT1+miR-NC 组、GP73-MT1+mimics 组、GP73-MT2+miR-NC 组和 GP73-MT2+mimics 组。转染后 48 h，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞，并在 Passive Lysis 缓冲液中裂解 15 min，然后在 4℃下以 12 000 r/min 离心 2 min（r=9.5 cm）。每组 3 个复孔。根据双荧光素酶报告载体制造商的说明书收集细胞上清液用于荧光素酶测定。
1.8 细胞增殖试验
为了检测 miR-141-3p 对 HCC 细胞活力和增殖速率的影响，分别进行 MTT 和 EdU 测定。在 MTT 测定中，将 Huh-7 和 MHCC-97H 细胞（在肝癌细胞系中，Huh-7 及 MHCC-97H 细胞侵袭性相对较高，具有代表性）以 2×103 个细胞/孔的密度接种在 96 孔板中，每种细胞系分为 3 组，每组 5 个复孔，在培养 24 h 后转染。空白对照组不加入任何试剂、miR-NC 组加入 100 μL 的阴性对照 miR，miR-141-3p 组加入 100 μL 的 miR-141-3p 慢病毒载体。转染 1 d 后检测细胞中 miR-141-3p 的表达水平。根据试剂盒说明书在转染第 1、2、3 和 4 天测量 Huh-7 细胞的吸光度（A）值，以反映细胞增殖率。
在 EdU 测定中，细胞分组同 MTT 测定，分别用 miR-141-3p 和阴性对照 miR 转染 Huh-7 和 MHCC-97H 细胞。温育 24 h 后，将细胞以 6×103个/孔的密度接种在 96 孔板中，并向每个孔中加入新鲜制备的 50 μmol EdU 100 μL。在 EdU 标记 3 h 后，洗涤细胞，固定并用 Hoechst 33342 复染。使用 EdU Apollo®488 体外成像试剂盒获得图像。细胞增殖率为增殖细胞（EdU 阳性细胞）占视野下细胞总数的百分比（1 个视野，200 倍）。将没有慢病毒转染的细胞作为空白对照组。每组 5 个复孔，每种条件复测 3 次（取均值）。
1.9 Transwell 侵袭迁移实验
Transwell 侵袭迁移实验时，MHCC-97H 细胞分组及转染操作同 MTT 实验部分（MHCC-97H 细胞侵袭性较 Huh-7 更强，更具有代表性，故本部分实验选择该类型细胞系），每组 5 个复孔。转染 24 h后，将细胞以 1×105 个/孔接种在涂有基质胶的 Transwell 的上室中，将其插入 24 孔板中用于侵袭实验。下室含有补充有 5% FBS 的培养基。培养 24 h后，将迁移的细胞用 0.1% 结晶紫染色 20 min 后，以 PBS 清洗 2 次，在 400 倍显微镜下随机选取观察 3 个不同视野的细胞数计数，取均值。
迁移实验步骤与以上侵袭实验基本一致，但本部分实验中，笔者团队在未涂基质胶的 Transwell 上室接种 1×106 个细胞/孔并向下室添加含有 2.5% FBS 的培养基。
在细胞功能学回复实验部分，笔者团队在阴性对照 miR 模拟物组（加入 mimic NC）、空白对照组（未加入任何试剂）及 miR-141-3p 组（加入 miR-141-3p 慢病毒载体）基础上，又增加 miR-141-3p+GP73-NC 组（miR-141-3p 慢病毒载体+空质粒）及 miR-141-3p+GP73 组（miR-141-3p 慢病毒载体+GP73 质粒）。转染 24 h 后，将细胞以 1×105 个/孔接种在 Transwell 上室中，具体步骤与以上实验基本一致。
1.10 统计学方法
使用 SPSS 18.0 软件进行统计分析。以均值±标准差（±s）表示计量资料。HCC 组及其癌旁组织标志物表达水平的比较采用配对 t 检验；多组比较采用方差分析（两两比较采用 LSD-t 检验方法）；两参数间的关系应用 Pearson 简单相关进行分析。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 GP73 mRNA 及其蛋白在 HCC 组织中的表达显著上调
在本研究中，笔者团队首先检测了 1 组 HCC 癌组织及其配对的癌旁组织中 GP73 mRNA 的表达，qRT-PCR 结果显示，HCC 组织中 GP73 mRNA 的表达水平与邻近的癌旁组织相比，GP73 mRNA 的表达显著上调（P<0.05）），见图 1a。Western blot（图 1b）结果证实，GP73 蛋白的表达水平在 HCC 组织中也显著上调。
图1
示 HCC 组织及其癌旁组织中 GP73 mRNA 及其蛋白的表达、3 类数据库均可预测到的共同交叉 miR、miR-141-3p 模拟物或阴性对照的共转染结果、HCC 细胞系和临床标本中 miR-141-3p 的表达水平、HCC 组织中 miR-141-3p 与 GP73 mRNA 表达关系的散点图、转染后 HCC 细胞中 miR-141-3p 的表达及 miR-141-3p 对 Huh-7 细胞增殖能力的影响
a 和 b：HCC 组织及其癌旁组织中 GP73 mRNA（a）及其蛋白（b）的表达，T 表示 HCC 组织，A 表示癌旁组织；c：3 类数据库预测的 miR 结果；d：miR-141-3p 模拟物或阴性对照的共转染结果，与其他组别比较，*
2.2 miR-141-3p 靶向 GP73 且与 HCC 组织中 GP73 mRNA 的表达水平呈负相关
microRNA.org 数据库、TargetScanHuman 7.1 及 MIRDB 均可预测到的 miR 有 5 种，分别是 miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-342-3p、miR-141-3p 及 miR-143-3p，其预测结果见图 1c。使用 DIANA-TarBase v7.0 和 KEGG pathway 数据库对上述 miR 进一步分析，结果显示，miR-141-3p 具有最高的调节 GP73 的潜力。因此，本研究选择在 HCC 中研究 miR-141-3p 靶向 GP73 的调节作用。miR-141-3p 模拟物或阴性对照的共转染结果显示（图 1d），GP73-WT+mimics 组的相对荧光素酶活性低于其余 6 组（P<0.05），但其余 6 组比较差异无统计学意义（P>0.05），表明 GP73-WT 的 3´UTR 活性被 miR-141-3p 模拟物影响后显著降低，然而对突变体的 3´UTR 并未发现显著影响，这表明 miR-141-3p 通过与 3´UTR 结合直接调节 GP73。
2.3 HCC 细胞系和临床标本中 miR-141-3p 的表达水平
2.3.1 不同 HCC 细胞系、HCC 组织及其癌旁组织中 miR-141-3p 的表达水平
为了评估 miR-141-3p 在 HCC 进展中的变化，本研究首先检测了不同 HCC 细胞系中 miR-141-3p 的表达水平。本研究以 miR-141-3p 在 LO2 中的表达水平作为对照，设定其相对表达量为 1。结果表明，与正常肝细胞系 LO2 相比，各 HCC 细胞系中 miR-141-3p 的表达水平均降低（图 1e）。有趣的是，即使在 HCC 细胞系中，miR-141-3p 的表达水平也存在统计学上的差异：在高侵袭性 HCC 细胞系（MHCC-97H、HCC-LM3 和 Huh-7）中，其 miR-141-3p 的表达水平低于 HepG2 和 PLC 细胞系（P<0.05），且 Huh-7、MHCC-97H 和 HCC-LM3 的表达水平依次降低，两两比较差异均有统计学意义（P<0.05），但 HepG2 和 PLC 细胞系比较差异无统计学意义（P>0.05）。这与临床获取的 HCC 标本中的 miR-141-3p 表达水平的检测结果相一致：HCC 组织中 miR-141-3p mRNA 的表达水平低于匹配的相邻癌旁组织中的表达水平（图 1f），显示出与 GP73 mRNA 截然相反的表达模式（图 1a）。Pearson 简单相关分析结果表明，在 HCC 肿瘤标本中，miR-141-3p 的表达水平和 GP73 mRNA 的表达水平之间存在负相关（r=0.673，P<0.01），见图 1g。
2.3.2 miR-141-3p 的表达与 HCC 临床病理学特征的关系
本研究进一步分析 HCC 组织中 miR-141-3p表达与 HCC 进展之间的关系，包括 miR-141-3p 表达与患者年龄、性别、临床 TNM 分期、肿瘤分化等级、血管侵犯、肿瘤直径、HBsAg、AFP 等不同临床病理学特征或参数的关系，以 HCC 组织中 miR-141-3p 的相对表达水平的均数为基线，分为 miR-141-3p 高表达及低表达组。结果表明，miR-141-3p 低表达与较晚的临床 TNM 分期（P=0.006），低分化的肿瘤（P=0.002）和血管浸润性肿瘤（P=0.003）相关，而与其他临床病理学因素，包括年龄、性别、肿瘤直径、HBsAg、AFP 水平和肝硬变均无关（P>0.05），具体见表 1。
表1
HCC 组织中 miR-141-3p 的表达与其临床病理学特征的关系（例）
2.4 miR-141-3p 的过表达抑制 HCC 细胞的增殖、侵袭和迁移
为了深入了解 miR-141-3p 在 HCC 进展中的作用，接下来，我们利用 miR-141-3p 慢病毒转染了 Huh-7 和 MHCC-97H 细胞。qRT-PCR 结果显示，不管是在 Huh-7 细胞还是在 MHCC-97H 细胞中，与空白对照组和 miR-NC 组相比，miR-141-3p 组的 miR-141-3p 的表达水平均较高（P<0.05），但空白对照组与 miR-NC 组比较差异无统计学意义（P>0.05），提示 2 种细胞系在诱导后其 miR-141-3p 水平明显升高（图 1h），这也证实了 miR-141-3p 慢病毒的转染效率。
在 Huh-7 细胞的 MTT 实验中，从第 2 天开始，与空白对照组和 miR-NC 组相比，miR-141-3p 组的细胞增殖率均较低（P<0.05），且在第 4 天观察到最强的抑制（图 1i），但同时点空白对照组与 miR-NC 组比较差异无统计学意义（P>0.05）。
EdU 实验结果显示，不管是在 Huh-7 细胞还是在 MHCC-97H 细胞中，与空白对照组和 miR-NC 组相比，miR-141-3p 组的 EdU 阳性细胞比例均较低（P<0.05），但空白对照组与 miR-NC 组比较差异无统计学意义（P>0.05），提示在 Huh-7 和 MHCC-97H 细胞中观察到 miR-141-3p 过表达后的一致抑制作用（图 2a–2h）。
图2
示 EdU 检测结果（ ×200）、Transwell 侵袭迁移实验及细胞功能学回复实验结果
a–h：Huh-7 细胞和 MHCC-97H 细胞中，空白对照组（Huh-7 细胞：a；MHCC-97H 细胞：e）、miR-NC 组（Huh-7 细胞：b；MHCC-97H 细胞：f）和 miR-143-3p 组（Huh-7 细胞：c；MHCC-97H 细胞：g）的 EdU 阳性细胞染色结果和计数结果（Huh-7 细胞：d；MHCC-97H 细胞：h），与其余 2 组比较，*
2.5 miR-141-3p 过表达抑制 HCC 细胞的侵袭和迁移
通过以上不同方法，本研究证明了 miR-141-3p抑制 HCC 细胞的增殖。本研究进一步分析了 miR-141-3p 过表达对 HCC 细胞侵袭和迁移潜能的影响。Transwell 侵袭迁移实验结果（图 2i 和 2j）表明，与空白对照组和 miR-NC 组比较，miR-141-3p 组的细胞计数均较低（P<0.05），但空白对照组与 miR-NC 组比较差异无统计学意义（P>0.05）。该结果表明，体外 miR-141-3p 过表达显著抑制 HCC 细胞的侵袭和迁移潜力。
2.6 GP73 蛋白可部分逆转 miR-141-3p 在 HCC 细胞中的抑制作用
在前面的研究中，本研究首先探讨了 GP73 是否是 miR-141-3p 的靶标，并发现 GP73 和 miR-141-3p在 HCC 进展中的表达呈负相关。为了更好地理解 2 种基因在 HCC 进展中的机制作用，本研究用 miR-141-3p 慢病毒和表达 GP73 的质粒或空载体共转染 MHCC-97H 细胞。细胞功能学回复实验结果表明，在侵袭迁移实验中，与空白对照组和 miR-NC 组比较，miR-141-3p 组、miR-141-3p+GP73-NC 组及 miR-141-3p+GP73 组的细胞计数均较低（P<0.05），但空白对照组与 miR-NC 组比较、miR-141-3p 组和 miR-141-3p+GP73-NC 组比较差异均无统计学意义（P>0.05）；miR-141-3p 组及miR-141-3p+GP73-NC 组分别与miR-141-3p+GP73 组比较差异具有统计学意义（侵袭实验 P<0.001，迁移实验 P<0.05）。这说明，表达 GP73 的质粒可导致 miR-141-3p 抑制细胞侵袭和迁移的潜力部分丧失（图 2k 和图 2l）。
3 讨论
鉴于 GP73 是 HCC 诊断和预后的特异性血清标志物，在本研究中，笔者团队选择了 GP73 作为靶基因来预测参与 HCC 发展的上游 miR。通过搜索不同的数据库，本研究发现，miR-141-3p 具有调节 GP73 表达和影响 HCC 进展的最大潜力。qRT-PCR 结果显示，miR-141-3p 的表达水平与 GP73 mRNA 的表达呈负相关。此外，通过分析临床病理学特征，本研究发现，miR-141-3p 低表达与 HCC 进展显著相关，这与最近的报道[12]一致，即 miR-141-3p 的表达下调可能是 HCC 高侵袭性的原因。miR-141 与 miR-200c 一起形成簇，均属于 miR-200 家族[13]。既往研究[14]发现，血液循环中 miR-141 及 miR-200c 的水平在 HCC 患者中显著升高。因此，本研究结果与之前的研究结果共同揭示了 miR-141-3p 在 HCC 患者的诊断和复发监测中的明确意义；同时，miR-141-3p 也可能被认为是未来 HCC 患者的治疗靶标。
miR 在转录水平上可以通过与靶基因启动子结合，激活或抑制靶基因[15]；而在转录后水平上 miR 可以抑制靶基因翻译或通过结合其 3´UTR 区域引起靶 mRNA 降解[16]。在本研究中，荧光素酶测定结果显示，miR-141-3p 模拟物显著抑制 GP73 野生型的 3′UTR 活性，然而对突变型却未发现明显影响，这表明 miR-141-3p 在转录后水平上靶向调控 GP73。
既往的研究[17-19]表明，miR-141 在多种恶性肿瘤中的作用是有争议的。在晚期肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）中，miR-141-3p 与 miR-145-5p 的表达均下调；当过表达这 2 种 miR 时，则可明显抑制 RCC 细胞的迁移能力[17]。在另一项胃癌的研究[18]中，miR-141 通过靶向转录共激活因子与 PDZ 结合基序，从而抑制肿瘤生长和转移。然而，另外一项研究[19]发现，miR-141-3p 作为致癌基因促进前列腺癌细胞的增殖。这些研究表明，了解 miR-141-3p 功能最好的方法是研究其在特定肿瘤中的作用。在本研究中，笔者团队发现，体外实验中过表达 miR-141-3p 可抑制 HCC 细胞的增殖、侵袭及迁移，这表明 miR-141-3p 在 HCC 进展中作为抑癌基因发挥功能。
本研究的体外实验结果表明，GP73 部分但不完全逆转 miR-141-3p 对 HCC 的抑制作用。这与之前有关 miR-141-3p 通过多种不同基因调控 HCC 进展的研究[20-23]结果相一致。miR-141-3p 下调精子相关抗原 9（SPAG9）的表达后，再通过抑制 c-Jun 氨基末端激酶（JNK）通路而抑制 HCC 细胞的侵袭和转移[24]。另一项研究[25]表明，miR-141-3p 下调 T 淋巴瘤侵袭转移诱导因子 1（Tiam1）蛋白的表达并抑制 HCC 细胞的侵袭和迁移。这提示，进一步对其他基因的调控及分子途径激活的研究将有助于更深入了解 miR-141-3p 在 HCC 进展中的重要作用。
总之，本研究发现，miR-141-3p 作为抑癌基因，通过靶向调控 GP73 进而抑制 HCC 的进展。miR-141-3p-GP73 通路有希望成为 HCC 治疗的新靶点。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：李学华、邢玉辉及刘志恒涉及实验的具体操作及实施，并撰写论文；姜小红和侯旭，负责实验设计、数据统计、整理及论文撰写。
伦理声明：本研究已通过聊城市人民医院的伦理审核批准（批准文号：2016031）。
