引用本文： 王磊, 陈曦, 颜登国, 梁正子, 曹飞龙, 甄运寰, 李国胜, 程海玉. 结直肠癌微环境中细胞因子的表达及其与CD16a mRNA 表达的相关性研究. 中国普外基础与临床杂志, 2020, 27(3): 291-297. doi: 10.7507/1007-9424.201907092 复制
肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）是指肿瘤所处的特殊生活环境，主要包括：肿瘤细胞、间质细胞、免疫细胞、肿瘤外基质、细胞因子等，它们相互作用，通过多种机制形成免疫抑制区域，介导肿瘤逃逸[1]。微环境中肿瘤细胞、基质细胞、免疫细胞等均可释放细胞因子，形成一个细胞因子调节网，协同调节或抑制肿瘤免疫。因此，微环境中细胞因子谱的变化可以反映微环境的免疫情况。
CD16a（FCγRⅢA）为低亲和力的 IgG 受体，是一种表达于多种免疫效应细胞表面的跨膜蛋白，通过与人 IgG1 和 IgG3 的 Fc 段结合，诱导免疫效应细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC）[2]，发挥直接杀伤作用或者促进 γ-干扰素（interferone-γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、基质金属蛋白酶等细胞因子的产生，影响细胞免疫功能的发挥[3-4]。它是细胞免疫的重要结合位点，前期实验[5]发现，CD16a 在有肝转移患者的原发肿瘤组织中的表达水平明显低于无肝转移者，推测局部 CD16a 的表达下调引起了局部免疫功能的减弱，而导致结直肠癌的发生和发展。本研究利用流式细胞术微球阵列法（CBA 法）检验结直肠癌组织中辅助性 T 淋巴细胞（helper T lymphocyte，Th）的细胞因子水平，包括 Th1 细胞因子 ［白细胞介素（interleukin，IL）-2、IL-12 和 IFN-γ］、Th2 细胞因子（IL-4、IL-6 和 IL-10）、TNF-α 和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在内的细胞因子谱的变化，了解微环境的免疫抑制情况；并利用 RT-PCR 技术检测结直肠癌组织中 CD16a mRNA 的表达变化，初步探讨 CD16a mRNA 表达与 TME 变化的关系。
1 材料与方法
1.1 研究材料
纳入标准：① 所选病例术后均经病理学检查确诊为结直肠腺癌（包括黏液腺癌和印戒细胞癌）；② 术前均未行化疗、放疗及生物治疗。排除标准：① 术前接受放化疗及生物治疗者；② 多源性结直肠癌和复发性结直肠癌；③ 患者系未成年人。前瞻性收集贵州医科大学附属医院肛肠外科于 2015 年 6 月至 2016 年 12 月期间收治的 42 例行手术切除的结直肠癌患者的癌组织及癌旁组织（距离癌组织以远 10 cm）进行试验。42 例患者中，男 22 例，女 20 例；年龄 24～89 岁，中位年龄为 63 岁；肿瘤部位：结肠 13 例，直肠 29 例；病理分型：腺癌 38 例，黏液腺癌 3 例，印戒细胞癌 1 例；淋巴结转移阳性 19 例，阴性 23 例；TNM 分期：Ⅰ期 12 例，Ⅱ期 10 例，Ⅲ期 10 例，Ⅳ期 10 例。
1.2 主要试剂及设备
RNA 提取试剂盒（全式金）：TransZol Up Plus RNA Kit；RNA 逆转录试剂盒（全式金）：EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix；荧光定量 PCR 试剂盒（全式金）：TransStart Tip Green qPCR SuperMix；荧光染料：4S Green Plus 无核酸染料；CD16a 及 GAPDH 内参引物。上述产品均购自生工生物工程（上海）有限公司。流式细胞多因子检测试剂盒：LEGEND-plexTM 系美国 BioLegend 公司产品。
1.3 方法
1.3.1 CBA 法测定结直肠癌组织及癌旁组织中细胞因子的表达
取待测标本组织，称重（精确到 0.01 g），漂洗拭干，按质量体积比 1∶4 取 pH=7.4 的 PBS 缓冲液匀浆，低温 3 000 r/min 离心 10～15 min（r=208 mm），取上清液，弃下面沉淀。全程低温环境操作。严格按照流式细胞因子检测试剂盒说明书进行标准品制备及后续实验。标准品最高浓度 C7 的理论浓度为 10 000 pg/mL，后以 1∶4 的比例稀释到 C1，C1 的理论浓度为 2.4 pg/mL。缓冲液作为最低浓度的标准品 C0，为 0 pg/mL。
1.3.2 RT-PCR 法测定结直肠癌组织中 CD16a mRNA 的表达
设计的 CD16a 引物扩增产物长度为 74 bp，引物序列为：上游引物，5′-TCCAAAAGCCACACTCAAAGAC-3′；下游引物，5′-CTGAAGACACATTTTTACTCCCAAAC-3′。内参基因选择 GAPDH，GAPDH 引物扩增产物长度为 138 bp，引物序列为：上游引物，5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′；下游引物，5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′。两种引物的设计及合成均由生工生物工程（上海）有限公司完成。
按试剂盒说明提取总 RNA，进行电泳鉴定后，逆转录合成 cDNA，按 RT-PCR 试剂盒说明书进行 RT-PCR 扩增。PCR 反应条件：① 变性：94 ℃30 s；② 94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，重复 45 个循环。PCR 反应体系见试剂盒说明书。PCR 后进行溶解分析，温度为 60～95 ℃。每个样本重复检测 3 次，取平均值。
1.4 统计学方法
CD16a mRNA 的相对表达水平采用 2–△△CT[6]方法计算，因此与细胞因子进行相关性分析时，利用癌旁组织的细胞因子表达水平将癌组织中细胞因子的表达进行转化：细胞因子的相对表达水平=癌组织中的表达水平/癌旁组织中的表达水平。采用 SPSS 24.0 统计软件进行分析，对数据进行正态分布检验，如果符合正态分布，采用配对或成组 t 检验；如果不符合正态分布或不满足参数检验条件，采用非参数 Wilcoxon 符号秩和检验、Mann-Whitney U 检验和 Kruskal-wallis H 检验进行差异性分析。相关性分析采用 Spearman 秩相关分析。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 结直肠癌组织中 8 种细胞因子的表达水平
2.1.1 标准绘制
测得 C7～C0 中 8 种细胞因子的实际标准浓度后绘制标准曲线如图 1。结果可见，8 种细胞因子的标准曲线拟合优度 R2值范围为 0.988～0.998，表明标准曲线的拟合优度佳。
图1
示 8 种细胞因子的标准曲线图
a：IL-2；b：IL-4；c：IL-6；d：IL-10；e：IL-12；f：TNF-α；g：IFN-γ；h：VEGF；
2.1.2 结直肠癌组织及癌旁组织 8 种细胞因子的表达水平
结直肠癌组织中 IL-6、TNF-α 和 VEGF 的表达水平高于癌旁组织（P<0.05），而 IL-2、IL-4、IL-10、IL-12 和 IFN-γ 在 2 种组织中的表达差异均无统计学意义（P>0.05），见表 1。
表1
结直肠癌组织与癌旁组织中 8 种细胞因子的表达水平（
，pg/mL，n=42）
2.1.3 结直肠癌组织中 8 种细胞因子的表达水平与临床病理学特征的关系
不同年龄、性别、肿瘤部位、N 分期、TNM 分期和分化程度患者的 8 种细胞因子的表达水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）；此外，不同 CEA 水平组患者 IL-6 和 VEGF 的表达水平不同，CEA<5.0 ng/mL 组的 IL-6 和 VEGF 水平较高，但其他 6 项指标的差异均无统计学意义（P>0.05），具体结果见表 2。
表2
结直肠癌组织中 8 种细胞因子的表达水平与临床病理学特征的关系（
，pg/mL）
2.2 结直肠癌组织中 CD16a mRNA 的表达水平
CD16a 和 GAPDH 基因的扩增曲线呈倒 S 型，扩增曲线拐点清楚，曲线指数期的斜率两者基本一致，斜率大，扩增效率高（图 2a）。溶解曲线为单一峰，溶解温度均一，未见第二峰，提示无非特异性扩增（图 2b 和2c）。RNA 提取物的电泳结果表明，28S 和 18S 条带清晰，28S 条带亮度约是 18S 条带的 2 倍（图 2d），表明RNA 提取基本完整，无明显降解。PCR 扩增产物电泳图结果表明，GAPDH 和 CD16a mRNA 的条带清晰；CD16a 基因片段约为2 000 bp，GAPDH 片段在 1 200～2 000 bp 之间（图 2e），与预期片段大小相符，表示无非特异性扩增。结直肠癌组织中 CD16a mRNA 的相对表达水平为 3.48±1.0。
图2
示 CD16a 和 GAPDH 基因的扩增曲线、溶解曲线和琼脂凝胶电泳结果
a：扩增曲线，Rn 表示荧光强度，ΔRn 表示每个测量点相对基础荧光的荧光强度；b 和 c：CD16a（b）和 GAPDH（c）的溶解曲线；d：RNA 提取物的电泳图；e：PCR 扩增产物的电泳图
2.3 结直肠癌组织中 CD16a mRNA 的表达水平与细胞因子表达水平的相关性分析
结直肠癌组织中 IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α 和 VEGF 的表达水平与 CD16a mRNA 的表达水平无明显相关性（P>0.05），但 IL-6 的表达水平与 CD16a mRNA 的表达水平呈负相关（P<0.05）。具体见表 3。
表3
结直肠癌组织中 8 种细胞因子的表达水平与 CD16a mRNA 表达水平的相关性分析（n=42）
3 讨论
正常情况下，机体免疫功能处于稳定状态，不会过强或者过弱而导致疾病的发生，辅助性 T 细胞在其中起着重要作用。初始 Th0 细胞经过诱导分化形成 Th1 细胞及 Th2 细胞，它们通过不同的细胞因子，介导不同的免疫应答。Th1 细胞因子（IL-2、IFN-γ 和 IL-12）可以增强免疫细胞的细胞毒作用，介导细胞免疫应答，增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力；Th2 细胞因子（IL-4、IL-6 和 IL-10）主要促进抗体产生，介导体液免疫。在肿瘤免疫方面，可以直接抑制 Th1 细胞因子的产生来下调肿瘤的特异性免疫应答，从而抑制免疫效应细胞的活化[7]。Th1 细胞及 Th2 细胞在免疫过程中相互调节和制约，形成动态平衡，机体的抗肿瘤免疫以 Th1 细胞介导的细胞免疫为主，当 Th1/Th2 平衡失调、Th1 向 Th2 细胞偏移，则会导致机体细胞免疫功能严重减弱，促使肿瘤细胞能逃避机体免疫系统的攻击，出现肿瘤逃逸现象，导致肿瘤细胞大量增殖。
本研究中，虽然 IL-6 在结直肠癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织（P<0.05），但 Th1 细胞和 Th2 细胞的主要细胞因子，包括 IL-2、IL-12、IFN-γ、IL-4 及 IL-10 在结直肠癌组织与癌旁组织间的差异并无统计学意义（P>0.05）。总体来看，在 TME 中未发现明显的 Th1/Th2 细胞偏移现象，这与之前的研究结果[8]有所出入。这可能与微环境中肿瘤浸润细胞及癌细胞同样分泌相关细胞因子有关。
TNF-α 是典型的炎性细胞因子，主要由巨噬细胞和肿瘤细胞产生，其生物学活性较为广泛，既可诱导肿瘤细胞凋亡，被认为是肿瘤抑制性细胞因子[9]，同时可使肿瘤细胞增殖和分化。很多研究[10-12]发现，TNF-α 是将炎症与癌症进行关联的肿瘤促进剂，能够激活癌基因，导致细胞 DNA 损伤和肿瘤转移，在结直肠癌的侵袭转移中起主要作用，晚期结直肠癌中无论血浆还是肿瘤组织其局部 TNF-α 的表达水平均显著升高。VEGF 在微环境中因缺氧环境而被诱导表达上调，与血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）—VEGFR-1 和 VEGFR-2 结合而促进血管网络形成，来促进肿瘤的形成和转移[13]；并且在 TME 中，VEGF 还能诱导髓源性抑制细胞（MDSC）增殖，从而抑制免疫功能[14]。IL-6 除了可以促进肿瘤细胞的增殖外，它还可以通过促进血管生成[15]、促进 DNA 错配修复缺陷[16]、促进 MDSC 蓄积[17]、限制 CD4+Th1 细胞发育[18]等机制促进肿瘤的发生和发展，IL-6 通过调节促凋亡因子 Bcl 相关 X 蛋白和 DNA 修复蛋白 Ku70/86 的表达，以及分子间的相互作用而促进结肠癌细胞的增殖。总的来说，IL-6、TNF-α 和 VEGF 的表达情况反映了 TME 中的免疫抑制现象。本研究结果显示，结直肠癌组织中 IL-6、TNF-α 和 VEGF 的表达水平高于癌旁组织，说明结直肠癌肿瘤局部微环境中存在免疫抑制现象。
目前的研究结果并未发现免疫抑制的严重程度与肿瘤的进展如肿瘤分期以及有无淋巴结转移有关。临床病理因素对微环境中细胞因子的影响分析结果显示，除了 IL-6 与 VEGF 的表达水平在不同水平 CEA 组中表现出差异性外，其余均未见显著差异。CEA 作为一种胚胎性抗原，与肿瘤细胞免疫、黏附及凋亡有关，且与肿瘤的分期等有关，在低分化及Ⅲ/Ⅳ期结直肠癌患者的外周血中其表达水平明显升高；肿瘤局部 CEA 表达有导致肿瘤细胞浸润脉管、发生淋巴及血液转移的危险[19-20]。本研究结果显示，术前血清 CEA 正常组患者的 IL-6 和 VEGF 的表达水平高于 CEA 升高组。但鉴于结直肠癌局部肿瘤组织中均有 CEA 表达而仅有 40%～50% 的结直肠癌患者血清 CEA 升高[21-22]，且对于肿瘤局部 CEA 释放进入血循环中的机制目前不是很清楚，因此，血清 CEA 与肿瘤局部微环境中细胞因子表达之间的相互作用机制还不明确。有研究[23-24]显示，肿瘤局部 VEGF 的表达水平与血清 CEA 水平无明显相关性，而血清 CEA 水平与 IL-6 的表达水平呈正相关。另外，单独的 CEA 水平并不能描述肿瘤的进展状态，而需要通过连续的检测来判断，部分 CEA 水平正常的结直肠癌可能具有快速进展的倾向。
CD16a 作为表达于免疫效应细胞表面的重要结合位点，在细胞免疫上起积极作用。体外研究[25-26]表明，高表达 CD16a 的免疫细胞联合单克隆抗体比普通免疫细胞联合单克隆抗体，其 ADCC 作用、肿瘤杀伤能力及 IFN-γ 的释放水平均有增强。利用糖工程增加单克隆抗体对 CD16a 的亲和力后，免疫细胞产生 IFN-γ 的能力也增加[27]。也有研究[28]表明，在肝 Kupffer 细胞中下调 CD16a 的表达以后，Kupffer 细胞对肝癌细胞的杀伤能力明显下降。笔者团队的前期实验[5]发现，CD16a 在有肝转移的结直肠癌患者的原发肿瘤组织中的表达水平明显低于无肝转移者。由此可以看出，CD16a 的局部表达下调会导致细胞免疫功能减弱，导致肿瘤进展。本实验结果表明，结直肠癌组织中 CD16a mRNA 的表达水平与 IL-6 的表达水平呈负相关；IL-6 在微环境中主要表现出免疫抑制作用，且结直肠癌组织中 IL-6 的表达水平也明显高于癌旁组织。可以认为，从细胞因子角度看，TME 中 CD16a mRNA 的表达变化与免疫抑制形成有关，但是并未表明因果关系。它们可能相互影响、共同作用，导致微环境中免疫抑制逐渐加深，加速肿瘤进展。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：王磊，负责流式细胞术微球阵列法检测；陈曦，负责实时荧光定量 PCR 法检测；颜登国，负责课题设计；梁正子，负责标本及临床资料整理；曹飞龙，负责结果的统计处理；甄运寰，负责流式细胞术实验准备；李国胜，负责实时荧光定量 PCR 的实验准备；程海玉，负责临床资料收集。
伦理声明：本研究已通过贵州医科大学附属医院的伦理审核批准 ［批准文号：2016 伦审第（26）号］。
肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）是指肿瘤所处的特殊生活环境，主要包括：肿瘤细胞、间质细胞、免疫细胞、肿瘤外基质、细胞因子等，它们相互作用，通过多种机制形成免疫抑制区域，介导肿瘤逃逸[1]。微环境中肿瘤细胞、基质细胞、免疫细胞等均可释放细胞因子，形成一个细胞因子调节网，协同调节或抑制肿瘤免疫。因此，微环境中细胞因子谱的变化可以反映微环境的免疫情况。
CD16a（FCγRⅢA）为低亲和力的 IgG 受体，是一种表达于多种免疫效应细胞表面的跨膜蛋白，通过与人 IgG1 和 IgG3 的 Fc 段结合，诱导免疫效应细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC）[2]，发挥直接杀伤作用或者促进 γ-干扰素（interferone-γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、基质金属蛋白酶等细胞因子的产生，影响细胞免疫功能的发挥[3-4]。它是细胞免疫的重要结合位点，前期实验[5]发现，CD16a 在有肝转移患者的原发肿瘤组织中的表达水平明显低于无肝转移者，推测局部 CD16a 的表达下调引起了局部免疫功能的减弱，而导致结直肠癌的发生和发展。本研究利用流式细胞术微球阵列法（CBA 法）检验结直肠癌组织中辅助性 T 淋巴细胞（helper T lymphocyte，Th）的细胞因子水平，包括 Th1 细胞因子 ［白细胞介素（interleukin，IL）-2、IL-12 和 IFN-γ］、Th2 细胞因子（IL-4、IL-6 和 IL-10）、TNF-α 和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在内的细胞因子谱的变化，了解微环境的免疫抑制情况；并利用 RT-PCR 技术检测结直肠癌组织中 CD16a mRNA 的表达变化，初步探讨 CD16a mRNA 表达与 TME 变化的关系。
1 材料与方法
1.1 研究材料
纳入标准：① 所选病例术后均经病理学检查确诊为结直肠腺癌（包括黏液腺癌和印戒细胞癌）；② 术前均未行化疗、放疗及生物治疗。排除标准：① 术前接受放化疗及生物治疗者；② 多源性结直肠癌和复发性结直肠癌；③ 患者系未成年人。前瞻性收集贵州医科大学附属医院肛肠外科于 2015 年 6 月至 2016 年 12 月期间收治的 42 例行手术切除的结直肠癌患者的癌组织及癌旁组织（距离癌组织以远 10 cm）进行试验。42 例患者中，男 22 例，女 20 例；年龄 24～89 岁，中位年龄为 63 岁；肿瘤部位：结肠 13 例，直肠 29 例；病理分型：腺癌 38 例，黏液腺癌 3 例，印戒细胞癌 1 例；淋巴结转移阳性 19 例，阴性 23 例；TNM 分期：Ⅰ期 12 例，Ⅱ期 10 例，Ⅲ期 10 例，Ⅳ期 10 例。
1.2 主要试剂及设备
RNA 提取试剂盒（全式金）：TransZol Up Plus RNA Kit；RNA 逆转录试剂盒（全式金）：EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix；荧光定量 PCR 试剂盒（全式金）：TransStart Tip Green qPCR SuperMix；荧光染料：4S Green Plus 无核酸染料；CD16a 及 GAPDH 内参引物。上述产品均购自生工生物工程（上海）有限公司。流式细胞多因子检测试剂盒：LEGEND-plexTM 系美国 BioLegend 公司产品。
1.3 方法
1.3.1 CBA 法测定结直肠癌组织及癌旁组织中细胞因子的表达
取待测标本组织，称重（精确到 0.01 g），漂洗拭干，按质量体积比 1∶4 取 pH=7.4 的 PBS 缓冲液匀浆，低温 3 000 r/min 离心 10～15 min（r=208 mm），取上清液，弃下面沉淀。全程低温环境操作。严格按照流式细胞因子检测试剂盒说明书进行标准品制备及后续实验。标准品最高浓度 C7 的理论浓度为 10 000 pg/mL，后以 1∶4 的比例稀释到 C1，C1 的理论浓度为 2.4 pg/mL。缓冲液作为最低浓度的标准品 C0，为 0 pg/mL。
1.3.2 RT-PCR 法测定结直肠癌组织中 CD16a mRNA 的表达
设计的 CD16a 引物扩增产物长度为 74 bp，引物序列为：上游引物，5′-TCCAAAAGCCACACTCAAAGAC-3′；下游引物，5′-CTGAAGACACATTTTTACTCCCAAAC-3′。内参基因选择 GAPDH，GAPDH 引物扩增产物长度为 138 bp，引物序列为：上游引物，5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′；下游引物，5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′。两种引物的设计及合成均由生工生物工程（上海）有限公司完成。
按试剂盒说明提取总 RNA，进行电泳鉴定后，逆转录合成 cDNA，按 RT-PCR 试剂盒说明书进行 RT-PCR 扩增。PCR 反应条件：① 变性：94 ℃30 s；② 94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，重复 45 个循环。PCR 反应体系见试剂盒说明书。PCR 后进行溶解分析，温度为 60～95 ℃。每个样本重复检测 3 次，取平均值。
1.4 统计学方法
CD16a mRNA 的相对表达水平采用 2–△△CT[6]方法计算，因此与细胞因子进行相关性分析时，利用癌旁组织的细胞因子表达水平将癌组织中细胞因子的表达进行转化：细胞因子的相对表达水平=癌组织中的表达水平/癌旁组织中的表达水平。采用 SPSS 24.0 统计软件进行分析，对数据进行正态分布检验，如果符合正态分布，采用配对或成组 t 检验；如果不符合正态分布或不满足参数检验条件，采用非参数 Wilcoxon 符号秩和检验、Mann-Whitney U 检验和 Kruskal-wallis H 检验进行差异性分析。相关性分析采用 Spearman 秩相关分析。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 结直肠癌组织中 8 种细胞因子的表达水平
2.1.1 标准绘制
测得 C7～C0 中 8 种细胞因子的实际标准浓度后绘制标准曲线如图 1。结果可见，8 种细胞因子的标准曲线拟合优度 R2值范围为 0.988～0.998，表明标准曲线的拟合优度佳。
图1
示 8 种细胞因子的标准曲线图
a：IL-2；b：IL-4；c：IL-6；d：IL-10；e：IL-12；f：TNF-α；g：IFN-γ；h：VEGF；
2.1.2 结直肠癌组织及癌旁组织 8 种细胞因子的表达水平
结直肠癌组织中 IL-6、TNF-α 和 VEGF 的表达水平高于癌旁组织（P<0.05），而 IL-2、IL-4、IL-10、IL-12 和 IFN-γ 在 2 种组织中的表达差异均无统计学意义（P>0.05），见表 1。
表1
结直肠癌组织与癌旁组织中 8 种细胞因子的表达水平（，pg/mL，n=42）
2.1.3 结直肠癌组织中 8 种细胞因子的表达水平与临床病理学特征的关系
不同年龄、性别、肿瘤部位、N 分期、TNM 分期和分化程度患者的 8 种细胞因子的表达水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）；此外，不同 CEA 水平组患者 IL-6 和 VEGF 的表达水平不同，CEA<5.0 ng/mL 组的 IL-6 和 VEGF 水平较高，但其他 6 项指标的差异均无统计学意义（P>0.05），具体结果见表 2。
表2
结直肠癌组织中 8 种细胞因子的表达水平与临床病理学特征的关系（，pg/mL）
2.2 结直肠癌组织中 CD16a mRNA 的表达水平
CD16a 和 GAPDH 基因的扩增曲线呈倒 S 型，扩增曲线拐点清楚，曲线指数期的斜率两者基本一致，斜率大，扩增效率高（图 2a）。溶解曲线为单一峰，溶解温度均一，未见第二峰，提示无非特异性扩增（图 2b 和2c）。RNA 提取物的电泳结果表明，28S 和 18S 条带清晰，28S 条带亮度约是 18S 条带的 2 倍（图 2d），表明RNA 提取基本完整，无明显降解。PCR 扩增产物电泳图结果表明，GAPDH 和 CD16a mRNA 的条带清晰；CD16a 基因片段约为2 000 bp，GAPDH 片段在 1 200～2 000 bp 之间（图 2e），与预期片段大小相符，表示无非特异性扩增。结直肠癌组织中 CD16a mRNA 的相对表达水平为 3.48±1.0。
图2
示 CD16a 和 GAPDH 基因的扩增曲线、溶解曲线和琼脂凝胶电泳结果
a：扩增曲线，Rn 表示荧光强度，ΔRn 表示每个测量点相对基础荧光的荧光强度；b 和 c：CD16a（b）和 GAPDH（c）的溶解曲线；d：RNA 提取物的电泳图；e：PCR 扩增产物的电泳图
2.3 结直肠癌组织中 CD16a mRNA 的表达水平与细胞因子表达水平的相关性分析
结直肠癌组织中 IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α 和 VEGF 的表达水平与 CD16a mRNA 的表达水平无明显相关性（P>0.05），但 IL-6 的表达水平与 CD16a mRNA 的表达水平呈负相关（P<0.05）。具体见表 3。
表3
结直肠癌组织中 8 种细胞因子的表达水平与 CD16a mRNA 表达水平的相关性分析（n=42）
3 讨论
正常情况下，机体免疫功能处于稳定状态，不会过强或者过弱而导致疾病的发生，辅助性 T 细胞在其中起着重要作用。初始 Th0 细胞经过诱导分化形成 Th1 细胞及 Th2 细胞，它们通过不同的细胞因子，介导不同的免疫应答。Th1 细胞因子（IL-2、IFN-γ 和 IL-12）可以增强免疫细胞的细胞毒作用，介导细胞免疫应答，增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力；Th2 细胞因子（IL-4、IL-6 和 IL-10）主要促进抗体产生，介导体液免疫。在肿瘤免疫方面，可以直接抑制 Th1 细胞因子的产生来下调肿瘤的特异性免疫应答，从而抑制免疫效应细胞的活化[7]。Th1 细胞及 Th2 细胞在免疫过程中相互调节和制约，形成动态平衡，机体的抗肿瘤免疫以 Th1 细胞介导的细胞免疫为主，当 Th1/Th2 平衡失调、Th1 向 Th2 细胞偏移，则会导致机体细胞免疫功能严重减弱，促使肿瘤细胞能逃避机体免疫系统的攻击，出现肿瘤逃逸现象，导致肿瘤细胞大量增殖。
本研究中，虽然 IL-6 在结直肠癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织（P<0.05），但 Th1 细胞和 Th2 细胞的主要细胞因子，包括 IL-2、IL-12、IFN-γ、IL-4 及 IL-10 在结直肠癌组织与癌旁组织间的差异并无统计学意义（P>0.05）。总体来看，在 TME 中未发现明显的 Th1/Th2 细胞偏移现象，这与之前的研究结果[8]有所出入。这可能与微环境中肿瘤浸润细胞及癌细胞同样分泌相关细胞因子有关。
TNF-α 是典型的炎性细胞因子，主要由巨噬细胞和肿瘤细胞产生，其生物学活性较为广泛，既可诱导肿瘤细胞凋亡，被认为是肿瘤抑制性细胞因子[9]，同时可使肿瘤细胞增殖和分化。很多研究[10-12]发现，TNF-α 是将炎症与癌症进行关联的肿瘤促进剂，能够激活癌基因，导致细胞 DNA 损伤和肿瘤转移，在结直肠癌的侵袭转移中起主要作用，晚期结直肠癌中无论血浆还是肿瘤组织其局部 TNF-α 的表达水平均显著升高。VEGF 在微环境中因缺氧环境而被诱导表达上调，与血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）—VEGFR-1 和 VEGFR-2 结合而促进血管网络形成，来促进肿瘤的形成和转移[13]；并且在 TME 中，VEGF 还能诱导髓源性抑制细胞（MDSC）增殖，从而抑制免疫功能[14]。IL-6 除了可以促进肿瘤细胞的增殖外，它还可以通过促进血管生成[15]、促进 DNA 错配修复缺陷[16]、促进 MDSC 蓄积[17]、限制 CD4+Th1 细胞发育[18]等机制促进肿瘤的发生和发展，IL-6 通过调节促凋亡因子 Bcl 相关 X 蛋白和 DNA 修复蛋白 Ku70/86 的表达，以及分子间的相互作用而促进结肠癌细胞的增殖。总的来说，IL-6、TNF-α 和 VEGF 的表达情况反映了 TME 中的免疫抑制现象。本研究结果显示，结直肠癌组织中 IL-6、TNF-α 和 VEGF 的表达水平高于癌旁组织，说明结直肠癌肿瘤局部微环境中存在免疫抑制现象。
目前的研究结果并未发现免疫抑制的严重程度与肿瘤的进展如肿瘤分期以及有无淋巴结转移有关。临床病理因素对微环境中细胞因子的影响分析结果显示，除了 IL-6 与 VEGF 的表达水平在不同水平 CEA 组中表现出差异性外，其余均未见显著差异。CEA 作为一种胚胎性抗原，与肿瘤细胞免疫、黏附及凋亡有关，且与肿瘤的分期等有关，在低分化及Ⅲ/Ⅳ期结直肠癌患者的外周血中其表达水平明显升高；肿瘤局部 CEA 表达有导致肿瘤细胞浸润脉管、发生淋巴及血液转移的危险[19-20]。本研究结果显示，术前血清 CEA 正常组患者的 IL-6 和 VEGF 的表达水平高于 CEA 升高组。但鉴于结直肠癌局部肿瘤组织中均有 CEA 表达而仅有 40%～50% 的结直肠癌患者血清 CEA 升高[21-22]，且对于肿瘤局部 CEA 释放进入血循环中的机制目前不是很清楚，因此，血清 CEA 与肿瘤局部微环境中细胞因子表达之间的相互作用机制还不明确。有研究[23-24]显示，肿瘤局部 VEGF 的表达水平与血清 CEA 水平无明显相关性，而血清 CEA 水平与 IL-6 的表达水平呈正相关。另外，单独的 CEA 水平并不能描述肿瘤的进展状态，而需要通过连续的检测来判断，部分 CEA 水平正常的结直肠癌可能具有快速进展的倾向。
CD16a 作为表达于免疫效应细胞表面的重要结合位点，在细胞免疫上起积极作用。体外研究[25-26]表明，高表达 CD16a 的免疫细胞联合单克隆抗体比普通免疫细胞联合单克隆抗体，其 ADCC 作用、肿瘤杀伤能力及 IFN-γ 的释放水平均有增强。利用糖工程增加单克隆抗体对 CD16a 的亲和力后，免疫细胞产生 IFN-γ 的能力也增加[27]。也有研究[28]表明，在肝 Kupffer 细胞中下调 CD16a 的表达以后，Kupffer 细胞对肝癌细胞的杀伤能力明显下降。笔者团队的前期实验[5]发现，CD16a 在有肝转移的结直肠癌患者的原发肿瘤组织中的表达水平明显低于无肝转移者。由此可以看出，CD16a 的局部表达下调会导致细胞免疫功能减弱，导致肿瘤进展。本实验结果表明，结直肠癌组织中 CD16a mRNA 的表达水平与 IL-6 的表达水平呈负相关；IL-6 在微环境中主要表现出免疫抑制作用，且结直肠癌组织中 IL-6 的表达水平也明显高于癌旁组织。可以认为，从细胞因子角度看，TME 中 CD16a mRNA 的表达变化与免疫抑制形成有关，但是并未表明因果关系。它们可能相互影响、共同作用，导致微环境中免疫抑制逐渐加深，加速肿瘤进展。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：王磊，负责流式细胞术微球阵列法检测；陈曦，负责实时荧光定量 PCR 法检测；颜登国，负责课题设计；梁正子，负责标本及临床资料整理；曹飞龙，负责结果的统计处理；甄运寰，负责流式细胞术实验准备；李国胜，负责实时荧光定量 PCR 的实验准备；程海玉，负责临床资料收集。
伦理声明：本研究已通过贵州医科大学附属医院的伦理审核批准 ［批准文号：2016 伦审第（26）号］。
