引用本文： 何宇涛, 冉江华. DNA 甲基化在肝脏再生中的研究现状与展望. 中国普外基础与临床杂志, 2020, 27(4): 494-498. doi: 10.7507/1007-9424.201907109 复制
肝细胞作为一种稳定细胞，在受到物理或化学损伤后，它能从细胞增殖周期中的静止期（G0）转入 DNA 合成前期（G1）和 DNA 合成期（S 期），从而表现出强大的再生能力来维持肝细胞的生理功能和机体的内在平衡[1]，也正因为如此，肝部分切除术可以作为一种有效的手段治疗肝脏良恶性肿瘤、肝外伤、肝脓肿等疾病。有研究[2]表明，肝脏再生障碍的患者术后并发症（出血、肝功能衰竭、胆汁漏等）发病率和病死率均较高，良好的肝脏再生能力对患者的预后至关重要。肝脏再生是一个涉及多水平、复杂而又精密调控的过程，DNA 甲基化作为表观遗传修饰中的一种调控方式就参与其中，它在肝细胞发育、分化、增殖、癌变中都占有举足轻重的地位。但近年来肝脏再生机制的研究大多集中在转录和翻译水平，DNA 甲基化与肝脏再生关系的研究较为零散。因此，笔者汇总了国内外相关文献，就 DNA 甲基化与肝脏再生关系的研究现状作一综述。
1 基因组甲基化水平与肝脏再生
1.1 肝细胞基因组整体甲基化水平与肝脏再生
DNA 甲基化是生物体内一种重要的表观遗传修饰途径，以启动子甲基化为例，它可以在不改变 DNA 碱基序列的情况下，通过改变 DNA 与转录因子的结合能力和高度螺旋化区域内染色质，抑制基因的转录活性[3]。DNA 甲基化的过程为：在 DNA 甲基化转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化下，S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）为甲基供体，将甲基共价结合在 DNA 中的特定序列上，通常是 CpG 二核苷酸中胞嘧啶上的第 5 位碳原子，其产物为 5-甲基胞嘧啶（5-mC）。CpG 在 DNA 中有两种存在形式，一种是松散地分布在 DNA 中，多呈甲基化状态；另一种则是高度聚集在某一区域，被称作 CpG 岛。60% CpG 岛位于基因启动子上，这部分 CpG 岛大多呈非甲基化状态，允许相关基因转录表达；其余 40% 大多以甲基化状态分布于基因间区和转录区内[4]。
肝癌细胞基因组整体低甲基化，而局部高甲基化现象已成为不争的事实[5]。但是肝脏再生过程中肝细胞基因组整体甲基化水平学术界目前尚无定论。有研究表明，肝脏再生过程中也存在基因组低甲基化现象，但是与肝癌基因组低甲基化不同的是，这是一个短暂且可逆的过程，如 Kanduc 等[6]在对健康大鼠进行 2/3 肝部分切除术时发现，术后残余肝脏 5-mC 和 SAM 的总体水平在再生较为旺盛时间段（24～38 h）有明显降低，之后能恢复到肝切除前水平；在癌变的大鼠肝脏上重复上述实验，也发现了再生过程中的低甲基化现象。DNA 低甲基化存在两种机制：① 主动去甲基化。DNA 甲基化维持基因沉默的作用较为稳定，但是当机体受到外界某些刺激之后，主动去甲基化功能蛋白被激活，使 DNA 中的甲基胞嘧啶被胞嘧啶替换，导致甲基化水平降低。② 被动去甲基化。此也称复制相关的 DNA 去甲基化，这是目前学术界比较认同的去甲基化机制。在 DNA 复制过程中，DNMT1 能够维持 5-mC 的甲基化状态，但是当 DNMT1 基因缺失或沉默时，新生成的子链就不能被甲基化。据此可推测，肝脏再生过程中基因组低甲基化的原因之一可能是：增殖旺盛时期的肝细胞对 DNMT1 的需求较大，导致了 DNMT1 含量相对不足，从而出现基因组低甲基化现象。现有研究只能表明肝脏再生过程中存在肝细胞基因组低甲基化现象，但更加完整的、动态的甲基化改变暂未被揭示，有待进一步阐明。
1.2 各类肝细胞甲基化水平与肝脏再生
参与再生调控的肝细胞种类繁多，并且不同种类肝细胞间基因组甲基化模式存在明显差异，因此，近年来肝脏再生甲基化的研究从肝脏整体水平转入到了细胞水平。Götze 等[7]发现，肝脏星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）的增殖和活化过程相较于肝实质细胞的增殖过程基因组表现出更低的甲基化水平，且具有特异性的 Spon2 基因低甲基化和 Pten、Smad7、IkBa 基因高甲基化模式。在另一项四氯化碳诱导小鼠肝损伤的实验[8]中发现，活化的 HSCs 相较于静止期的 HSCs 的细胞周期中核苷酸代谢相关基因如 Loxl1、Loxl2、Col4a1、Col4a2 等呈现低甲基化且高表达状态，且静止期各类肝细胞甲基化模式也同样具有差异性，如 RNA 代谢相关基因、脂质代谢和转运蛋白相关基因、染色质组装相关基因分别在 HSCs、肝窦内皮细胞、肝实质细胞内特异性高甲基化。
值得一提的是，不同甲基化模式的各类肝细胞在肝脏再生过程中功能各异，分工合作，共同调控着肝脏再生。HSCs 在再生起始和终止阶段发挥着特殊的调控作用，在肝脏再生早期，活化的 HSCs 产生大量的细胞因子和趋化因子促进肝脏再生，其中就有显著促细胞分裂、细胞运动及血管生成作用的肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF），HGF 还能诱导骨髓间充质干细胞向类肝细胞分化[9]；在肝脏再生晚期，参与再生终止和组织结构重塑的转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）也大都由活化的 HSCs 产生；HSCs 还能诱导血小板衍生生长因子 β 的表达，从而对肝细胞起到保护作用[10]。而肝窦内皮细胞作为肝脏中数目最多的非实质细胞，在肝脏再生早期通过上调血管内皮生长因子（VEGF）-A 与其受体 VEGFR-1/flt-1、VEGFR-2/flk-1 的表达，促进肝细胞增殖和新血管生成[11]；在肝脏再生中后期，肝窦内皮细胞还可通过 VEGF-A-VEGFR-2-Idl 通路释放 Wnt2，经 HGF 旁分泌作用介导肝实质细胞的重建[12]。此外，肝脏库普弗细胞[13]、肝卵圆细胞[14]、Pit 细胞[15]、树突状细胞[16]都以不同的调控方式在肝脏再生中发挥作用，但目前对各类肝细胞 DNA 甲基化的研究相对较少。各类肝细胞在肝脏再生中特殊的调控作用与其特异性的甲基化模式之间的联系还有待进一步研究。
1.3 胚胎甲基化模式与肝脏再生
Górnikiewicz 等[17]利用 MRL/MpJ 小鼠对比 C57BL/6J 小鼠探究肝脏再生的表观遗传学基础时发现，再生能力较强的 MRL/MpJ 小鼠肝细胞基因组甲基化模式与胚胎时期的甲基化模式更为相似，FOXC2、INSIG2 等发育相关基因呈现低甲基化且高表达状态[18]，这为肝脏再生甲基化研究提供了一个方向——肝脏再生基因组甲基化模式是否与胚胎时期的甲基化模式相似，换句话说，是否会朝着胚胎时期的甲基化模式转变，目前还暂不知晓。
2 DNA 甲基化调控与肝脏再生
经典理论认为，基因启动子区域 CpG 岛甲基化程度与基因的转录呈负相关，此种调控方式在哺乳动物发育过程中已被充分证实[18]。分布于基因间区的 CpG 岛，可能与该区域非编码 RNA 的转录和转座子的活化有关[19]，其甲基化可抑制非编码 RNA 的转录和转座子的激活；研究[20]还发现，高表达的基因常常在转录区内有广泛的 CpG 位点甲基化，其生物学意义还不太明确。所以目前肝脏再生基因甲基化的研究大多集中在基因启动子上。
有研究[21]表明，降低白细胞介素 6（interleukin 6，IL-6）基因启动子甲基化水平能够上调 IL-6 的表达。IL-6 作为一种多效能细胞因子，在细胞增殖、分化和炎症反应中发挥着重要的作用。IL-6 在肝脏再生过程中具有强大的细胞保护和促有丝分裂作用，IL-6 通过与其受体结合，使 gp130 蛋白二聚化，二聚化的 gp130 能够激活胞内磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/Akt、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、JAK/信号转导及转录激活因子 3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）等下游信号，从而调节细胞周期促进肝脏再生。此外，IL-6 还具有强大的促血管生成[22]和抗凋亡作用[23]。因此，IL-6 的表达调控在肝脏再生过程中显得尤为重要。胎盘间充质干细胞由于其强大的抗炎抗衰老能力，被广泛用于肝脏损伤的研究和治疗中，其机制之一就是通过改变 IL-6、gp130、STAT3、细胞因子信号通路抑制因子 3（SOCS3）的甲基化水平而调控肝脏再生[24]。胎盘间充质干细胞治疗肝损伤时，能引起肝细胞 IL-6 和 gp130 基因启动子甲基化水平明显降低而 IL-6 和 gp130 表达上调，从而激活下游信号通路，促进肝脏再生；然而，肝脏再生过程中细胞因子信号抑制物 SOCS3 似乎不受启动子甲基化的调控[25]。STAT3 是 SOCS3 基因的转录激活因子，当 JAK/STAT3 信号通路被激活时，SOCS3 也相应地表达增加。SOCS3 通过与活化的 JAK 结合和降解 gp130 而抑制信号通路的下传，负反馈调控肝脏再生。Guo 等[25]发现，在大鼠 2/3 肝部分切除术后，SOCS3 的表达量会随着细胞周期的改变而规律地增减，但 SOCS3 基因启动子甲基化水平却在整个再生过程中无序地上下波动。除了 SOCS3 不受启动子甲基化调控能解释上述现象以外，还有一种理论可以解释，即 STAT3 和 SOCS3 之间的强大的负反馈环路调控机制掩盖了潜在的 DNA 甲基化对 SOCS3 的调控。需特别指出的是，在肝癌[26]、食管癌[27]、肺癌[28]和头颈部恶性肿瘤[29]中均发现了由 SOCS3 基因过度甲基化引起的 SOCS3 表达沉默。因此，在肝脏再生过程中 DNA 甲基化是否调控 SOCS3 的表达还需进一步验证。
此外，IgG 受体 Fc 部分ⅡA（Fc fragment of IgG receptor ⅡA，FCGR2A）、RAS 相关结构域蛋白 1A 基因（RAS associated domain family 1A gene，RASSF1A）[30]和表皮生长因子[31]基因在肝脏再生过程中高甲基化，c-myc、p53 和 H-RAS 基因低甲基化[32]现象均有文献报道，其中有启动子区域 CpG 岛甲基化程度与基因转录呈负相关的研究[31]；也有启动子区域单个 CpG 位点与基因转录呈正相关的研究[32]。保守估计，肝脏再生过程中大约有 5 000 多个基因出现高甲基化或低甲基化改变，涉及真核起始因子 2B（eukaryotic initiation factor 2B，EIF2）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、整合素、PI3K/Akt 等 40 多种信号通路参与了凋亡、坏死、细胞迁移、增殖等多种病理生理活动[33]。由此可见，DNA 甲基化广泛地参与到肝脏再生的多个环节中。
3 DNA 甲基化相关蛋白与肝脏再生
3.1 DNMT1 与肝脏再生
DNMT 作为 DNA 甲基化的关键酶，存在三种亚型：DNMT1、DNMT3a 和 DNMT3b。DNMT1 对半甲基化的 DNA 具有较高的酶活性，参与维持 DNA 甲基化状态，在哺乳动物基因组内，其主要定位在细胞分裂周期 S 期的 DNA 复制叉上，将复制产生的半甲基化子链进一步甲基化，维持基因组的表观遗传；而 DNMT3a 和 DNMT3b 对未甲基化的 DNA 具有较高的酶活性，参与形成新的 DNA 甲基化模式。三类 DNMT 在胚胎发育和细胞增殖过程中均受到细胞周期的严密调控[34]。任何改变 DNMT 功能的行为都会影响机体发育并加速其死亡。
体外研究表明，细胞在增殖过程中，DNMT1 基因表达下调或沉默能够引起基因组甲基化的水平和稳定性降低[35]，导致 DNA 损伤基因、p53 基因、IAP 转座子的激活和多梳抑制复合物 2（polycomb repressive complex 2，PRC2）蛋白的下调，这些因素的共同作用使细胞出现 DNA 损伤、细胞周期阻滞、衰老和细胞死亡[36-39]。Kaji 等[40]利用 DNMT1 基因敲除的小鼠进行肝部分切除实验时发现，术后只有少量肝细胞增殖，其余的肝细胞对增殖刺激因子无应答从而转向衰老和死亡，最终大量的肝祖细胞被激活，取代衰老死亡的肝细胞，术后抑癌基因 p53、TGFβ 和细胞周期抑制物 p16、p21、p27 在 DNMT1 缺陷小鼠肝脏中表达上调，导致了细胞周期停滞和肝细胞凋亡，但在另一方面，这也是一种避免严重 DNA 损伤引起肝功能恶化的保护机制；研究还发现，肝祖细胞不受 DNMT1 缺陷的影响，因此肝脏再生后期大量的肝祖细胞能够取代死亡的肝细胞维持机体自稳。总体上看，DNMT1 缺陷导致了肝脏再生障碍，但这是机体以最佳方式维持肝细胞稳态而导致的结果。
3.2 含植物同源结构域和环指结构域泛素样蛋白 1（ubiquitin-like plant homeodomain and ring finger domain 1，UHRF1）与肝脏再生
DNMT1 募集到 DNA 复制叉和识别半甲基化 DNA 的过程中，需要 UHRF1 的参与，UHRF1 缺乏将导致 DNMT1 不能有效识别半甲基化 DNA 从而使基因组低甲基化。研究[41]发现，UHRF1 是机体胚胎发育过程中不可或缺的调控蛋白，UHRF1 缺陷的小鼠大多在胚胎发育早期就会死亡。Jacob等[42]还发现，UHRF1 突变的斑马鱼在肝脏发育过程中出现了细胞周期停滞、过度凋亡等增殖抑制现象。Wang 等[43]在小鼠出生之后进行特异性的肝细胞 UHRF1 基因敲除（Uhrf1hepKO）实验发现，与野生型相比，Uhrf1hepKO 小鼠静止期肝细胞的基因组表现出低甲基化状态，但基因的表达水平却没有明显增加，这表明 UHRF1 并不是抑制静止期肝细胞基因表达的主要原因；在对 Uhrf1hepKO 小鼠进行部分肝切除后，研究人员惊奇地发现，小鼠肝脏再生过程启动较早，且再生持续时间较长。分析其原因为：UHRF1 缺陷导致基因间区的转座子过度低甲基化，但表达并不上调，这是由于转座子存在一种补偿性的抑制机制，即当转座子过度低甲基化时，其他基因启动子区域的 H3K27me3 会被补偿性的转移到转座子上抑制其表达 ，H3K27me3 是三甲基化的组蛋白 H3，具有基因沉默作用[44]。也正因如此，其他基因启动子上的 H3K27me3 相对较少，某些增殖相关的转录因子如 E2F[45]才能够有效地结合到启动子上促进肝脏再生。UHRF1 缺陷促进肝脏再生揭示了一种全新的 H3K27me3 介导的 DNA 甲基化调控模式，也为研究肝脏再生障碍的治疗方法提供了崭新的思路。
4 小结与展望
DNA 甲基化是目前研究最深入的表观遗传调控机制之一，但在肝脏再生领域，DNA 甲基化的研究还只是起步阶段。虽然 DNA 甲基化的调控机制尚未阐明，但越来越多的实验已表明 DNA 甲基化对肝脏再生是至关重要的。随着近年来表观遗传学研究的进一步深入以及相关治疗药物的不断涌现，DNA 甲基化水平的干预治疗有望给实施肝部分切除术、肝移植等肝脏手术患者带来良好的预后。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们无相互竞争的利益。
作者贡献声明：何宇涛起草文章；冉江华采集数据及对论文进行指导。
肝细胞作为一种稳定细胞，在受到物理或化学损伤后，它能从细胞增殖周期中的静止期（G0）转入 DNA 合成前期（G1）和 DNA 合成期（S 期），从而表现出强大的再生能力来维持肝细胞的生理功能和机体的内在平衡[1]，也正因为如此，肝部分切除术可以作为一种有效的手段治疗肝脏良恶性肿瘤、肝外伤、肝脓肿等疾病。有研究[2]表明，肝脏再生障碍的患者术后并发症（出血、肝功能衰竭、胆汁漏等）发病率和病死率均较高，良好的肝脏再生能力对患者的预后至关重要。肝脏再生是一个涉及多水平、复杂而又精密调控的过程，DNA 甲基化作为表观遗传修饰中的一种调控方式就参与其中，它在肝细胞发育、分化、增殖、癌变中都占有举足轻重的地位。但近年来肝脏再生机制的研究大多集中在转录和翻译水平，DNA 甲基化与肝脏再生关系的研究较为零散。因此，笔者汇总了国内外相关文献，就 DNA 甲基化与肝脏再生关系的研究现状作一综述。
1 基因组甲基化水平与肝脏再生
1.1 肝细胞基因组整体甲基化水平与肝脏再生
DNA 甲基化是生物体内一种重要的表观遗传修饰途径，以启动子甲基化为例，它可以在不改变 DNA 碱基序列的情况下，通过改变 DNA 与转录因子的结合能力和高度螺旋化区域内染色质，抑制基因的转录活性[3]。DNA 甲基化的过程为：在 DNA 甲基化转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化下，S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）为甲基供体，将甲基共价结合在 DNA 中的特定序列上，通常是 CpG 二核苷酸中胞嘧啶上的第 5 位碳原子，其产物为 5-甲基胞嘧啶（5-mC）。CpG 在 DNA 中有两种存在形式，一种是松散地分布在 DNA 中，多呈甲基化状态；另一种则是高度聚集在某一区域，被称作 CpG 岛。60% CpG 岛位于基因启动子上，这部分 CpG 岛大多呈非甲基化状态，允许相关基因转录表达；其余 40% 大多以甲基化状态分布于基因间区和转录区内[4]。
肝癌细胞基因组整体低甲基化，而局部高甲基化现象已成为不争的事实[5]。但是肝脏再生过程中肝细胞基因组整体甲基化水平学术界目前尚无定论。有研究表明，肝脏再生过程中也存在基因组低甲基化现象，但是与肝癌基因组低甲基化不同的是，这是一个短暂且可逆的过程，如 Kanduc 等[6]在对健康大鼠进行 2/3 肝部分切除术时发现，术后残余肝脏 5-mC 和 SAM 的总体水平在再生较为旺盛时间段（24～38 h）有明显降低，之后能恢复到肝切除前水平；在癌变的大鼠肝脏上重复上述实验，也发现了再生过程中的低甲基化现象。DNA 低甲基化存在两种机制：① 主动去甲基化。DNA 甲基化维持基因沉默的作用较为稳定，但是当机体受到外界某些刺激之后，主动去甲基化功能蛋白被激活，使 DNA 中的甲基胞嘧啶被胞嘧啶替换，导致甲基化水平降低。② 被动去甲基化。此也称复制相关的 DNA 去甲基化，这是目前学术界比较认同的去甲基化机制。在 DNA 复制过程中，DNMT1 能够维持 5-mC 的甲基化状态，但是当 DNMT1 基因缺失或沉默时，新生成的子链就不能被甲基化。据此可推测，肝脏再生过程中基因组低甲基化的原因之一可能是：增殖旺盛时期的肝细胞对 DNMT1 的需求较大，导致了 DNMT1 含量相对不足，从而出现基因组低甲基化现象。现有研究只能表明肝脏再生过程中存在肝细胞基因组低甲基化现象，但更加完整的、动态的甲基化改变暂未被揭示，有待进一步阐明。
1.2 各类肝细胞甲基化水平与肝脏再生
参与再生调控的肝细胞种类繁多，并且不同种类肝细胞间基因组甲基化模式存在明显差异，因此，近年来肝脏再生甲基化的研究从肝脏整体水平转入到了细胞水平。Götze 等[7]发现，肝脏星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）的增殖和活化过程相较于肝实质细胞的增殖过程基因组表现出更低的甲基化水平，且具有特异性的 Spon2 基因低甲基化和 Pten、Smad7、IkBa 基因高甲基化模式。在另一项四氯化碳诱导小鼠肝损伤的实验[8]中发现，活化的 HSCs 相较于静止期的 HSCs 的细胞周期中核苷酸代谢相关基因如 Loxl1、Loxl2、Col4a1、Col4a2 等呈现低甲基化且高表达状态，且静止期各类肝细胞甲基化模式也同样具有差异性，如 RNA 代谢相关基因、脂质代谢和转运蛋白相关基因、染色质组装相关基因分别在 HSCs、肝窦内皮细胞、肝实质细胞内特异性高甲基化。
值得一提的是，不同甲基化模式的各类肝细胞在肝脏再生过程中功能各异，分工合作，共同调控着肝脏再生。HSCs 在再生起始和终止阶段发挥着特殊的调控作用，在肝脏再生早期，活化的 HSCs 产生大量的细胞因子和趋化因子促进肝脏再生，其中就有显著促细胞分裂、细胞运动及血管生成作用的肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF），HGF 还能诱导骨髓间充质干细胞向类肝细胞分化[9]；在肝脏再生晚期，参与再生终止和组织结构重塑的转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）也大都由活化的 HSCs 产生；HSCs 还能诱导血小板衍生生长因子 β 的表达，从而对肝细胞起到保护作用[10]。而肝窦内皮细胞作为肝脏中数目最多的非实质细胞，在肝脏再生早期通过上调血管内皮生长因子（VEGF）-A 与其受体 VEGFR-1/flt-1、VEGFR-2/flk-1 的表达，促进肝细胞增殖和新血管生成[11]；在肝脏再生中后期，肝窦内皮细胞还可通过 VEGF-A-VEGFR-2-Idl 通路释放 Wnt2，经 HGF 旁分泌作用介导肝实质细胞的重建[12]。此外，肝脏库普弗细胞[13]、肝卵圆细胞[14]、Pit 细胞[15]、树突状细胞[16]都以不同的调控方式在肝脏再生中发挥作用，但目前对各类肝细胞 DNA 甲基化的研究相对较少。各类肝细胞在肝脏再生中特殊的调控作用与其特异性的甲基化模式之间的联系还有待进一步研究。
1.3 胚胎甲基化模式与肝脏再生
Górnikiewicz 等[17]利用 MRL/MpJ 小鼠对比 C57BL/6J 小鼠探究肝脏再生的表观遗传学基础时发现，再生能力较强的 MRL/MpJ 小鼠肝细胞基因组甲基化模式与胚胎时期的甲基化模式更为相似，FOXC2、INSIG2 等发育相关基因呈现低甲基化且高表达状态[18]，这为肝脏再生甲基化研究提供了一个方向——肝脏再生基因组甲基化模式是否与胚胎时期的甲基化模式相似，换句话说，是否会朝着胚胎时期的甲基化模式转变，目前还暂不知晓。
2 DNA 甲基化调控与肝脏再生
经典理论认为，基因启动子区域 CpG 岛甲基化程度与基因的转录呈负相关，此种调控方式在哺乳动物发育过程中已被充分证实[18]。分布于基因间区的 CpG 岛，可能与该区域非编码 RNA 的转录和转座子的活化有关[19]，其甲基化可抑制非编码 RNA 的转录和转座子的激活；研究[20]还发现，高表达的基因常常在转录区内有广泛的 CpG 位点甲基化，其生物学意义还不太明确。所以目前肝脏再生基因甲基化的研究大多集中在基因启动子上。
有研究[21]表明，降低白细胞介素 6（interleukin 6，IL-6）基因启动子甲基化水平能够上调 IL-6 的表达。IL-6 作为一种多效能细胞因子，在细胞增殖、分化和炎症反应中发挥着重要的作用。IL-6 在肝脏再生过程中具有强大的细胞保护和促有丝分裂作用，IL-6 通过与其受体结合，使 gp130 蛋白二聚化，二聚化的 gp130 能够激活胞内磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/Akt、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、JAK/信号转导及转录激活因子 3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）等下游信号，从而调节细胞周期促进肝脏再生。此外，IL-6 还具有强大的促血管生成[22]和抗凋亡作用[23]。因此，IL-6 的表达调控在肝脏再生过程中显得尤为重要。胎盘间充质干细胞由于其强大的抗炎抗衰老能力，被广泛用于肝脏损伤的研究和治疗中，其机制之一就是通过改变 IL-6、gp130、STAT3、细胞因子信号通路抑制因子 3（SOCS3）的甲基化水平而调控肝脏再生[24]。胎盘间充质干细胞治疗肝损伤时，能引起肝细胞 IL-6 和 gp130 基因启动子甲基化水平明显降低而 IL-6 和 gp130 表达上调，从而激活下游信号通路，促进肝脏再生；然而，肝脏再生过程中细胞因子信号抑制物 SOCS3 似乎不受启动子甲基化的调控[25]。STAT3 是 SOCS3 基因的转录激活因子，当 JAK/STAT3 信号通路被激活时，SOCS3 也相应地表达增加。SOCS3 通过与活化的 JAK 结合和降解 gp130 而抑制信号通路的下传，负反馈调控肝脏再生。Guo 等[25]发现，在大鼠 2/3 肝部分切除术后，SOCS3 的表达量会随着细胞周期的改变而规律地增减，但 SOCS3 基因启动子甲基化水平却在整个再生过程中无序地上下波动。除了 SOCS3 不受启动子甲基化调控能解释上述现象以外，还有一种理论可以解释，即 STAT3 和 SOCS3 之间的强大的负反馈环路调控机制掩盖了潜在的 DNA 甲基化对 SOCS3 的调控。需特别指出的是，在肝癌[26]、食管癌[27]、肺癌[28]和头颈部恶性肿瘤[29]中均发现了由 SOCS3 基因过度甲基化引起的 SOCS3 表达沉默。因此，在肝脏再生过程中 DNA 甲基化是否调控 SOCS3 的表达还需进一步验证。
此外，IgG 受体 Fc 部分ⅡA（Fc fragment of IgG receptor ⅡA，FCGR2A）、RAS 相关结构域蛋白 1A 基因（RAS associated domain family 1A gene，RASSF1A）[30]和表皮生长因子[31]基因在肝脏再生过程中高甲基化，c-myc、p53 和 H-RAS 基因低甲基化[32]现象均有文献报道，其中有启动子区域 CpG 岛甲基化程度与基因转录呈负相关的研究[31]；也有启动子区域单个 CpG 位点与基因转录呈正相关的研究[32]。保守估计，肝脏再生过程中大约有 5 000 多个基因出现高甲基化或低甲基化改变，涉及真核起始因子 2B（eukaryotic initiation factor 2B，EIF2）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、整合素、PI3K/Akt 等 40 多种信号通路参与了凋亡、坏死、细胞迁移、增殖等多种病理生理活动[33]。由此可见，DNA 甲基化广泛地参与到肝脏再生的多个环节中。
3 DNA 甲基化相关蛋白与肝脏再生
3.1 DNMT1 与肝脏再生
DNMT 作为 DNA 甲基化的关键酶，存在三种亚型：DNMT1、DNMT3a 和 DNMT3b。DNMT1 对半甲基化的 DNA 具有较高的酶活性，参与维持 DNA 甲基化状态，在哺乳动物基因组内，其主要定位在细胞分裂周期 S 期的 DNA 复制叉上，将复制产生的半甲基化子链进一步甲基化，维持基因组的表观遗传；而 DNMT3a 和 DNMT3b 对未甲基化的 DNA 具有较高的酶活性，参与形成新的 DNA 甲基化模式。三类 DNMT 在胚胎发育和细胞增殖过程中均受到细胞周期的严密调控[34]。任何改变 DNMT 功能的行为都会影响机体发育并加速其死亡。
体外研究表明，细胞在增殖过程中，DNMT1 基因表达下调或沉默能够引起基因组甲基化的水平和稳定性降低[35]，导致 DNA 损伤基因、p53 基因、IAP 转座子的激活和多梳抑制复合物 2（polycomb repressive complex 2，PRC2）蛋白的下调，这些因素的共同作用使细胞出现 DNA 损伤、细胞周期阻滞、衰老和细胞死亡[36-39]。Kaji 等[40]利用 DNMT1 基因敲除的小鼠进行肝部分切除实验时发现，术后只有少量肝细胞增殖，其余的肝细胞对增殖刺激因子无应答从而转向衰老和死亡，最终大量的肝祖细胞被激活，取代衰老死亡的肝细胞，术后抑癌基因 p53、TGFβ 和细胞周期抑制物 p16、p21、p27 在 DNMT1 缺陷小鼠肝脏中表达上调，导致了细胞周期停滞和肝细胞凋亡，但在另一方面，这也是一种避免严重 DNA 损伤引起肝功能恶化的保护机制；研究还发现，肝祖细胞不受 DNMT1 缺陷的影响，因此肝脏再生后期大量的肝祖细胞能够取代死亡的肝细胞维持机体自稳。总体上看，DNMT1 缺陷导致了肝脏再生障碍，但这是机体以最佳方式维持肝细胞稳态而导致的结果。
3.2 含植物同源结构域和环指结构域泛素样蛋白 1（ubiquitin-like plant homeodomain and ring finger domain 1，UHRF1）与肝脏再生
DNMT1 募集到 DNA 复制叉和识别半甲基化 DNA 的过程中，需要 UHRF1 的参与，UHRF1 缺乏将导致 DNMT1 不能有效识别半甲基化 DNA 从而使基因组低甲基化。研究[41]发现，UHRF1 是机体胚胎发育过程中不可或缺的调控蛋白，UHRF1 缺陷的小鼠大多在胚胎发育早期就会死亡。Jacob等[42]还发现，UHRF1 突变的斑马鱼在肝脏发育过程中出现了细胞周期停滞、过度凋亡等增殖抑制现象。Wang 等[43]在小鼠出生之后进行特异性的肝细胞 UHRF1 基因敲除（Uhrf1hepKO）实验发现，与野生型相比，Uhrf1hepKO 小鼠静止期肝细胞的基因组表现出低甲基化状态，但基因的表达水平却没有明显增加，这表明 UHRF1 并不是抑制静止期肝细胞基因表达的主要原因；在对 Uhrf1hepKO 小鼠进行部分肝切除后，研究人员惊奇地发现，小鼠肝脏再生过程启动较早，且再生持续时间较长。分析其原因为：UHRF1 缺陷导致基因间区的转座子过度低甲基化，但表达并不上调，这是由于转座子存在一种补偿性的抑制机制，即当转座子过度低甲基化时，其他基因启动子区域的 H3K27me3 会被补偿性的转移到转座子上抑制其表达 ，H3K27me3 是三甲基化的组蛋白 H3，具有基因沉默作用[44]。也正因如此，其他基因启动子上的 H3K27me3 相对较少，某些增殖相关的转录因子如 E2F[45]才能够有效地结合到启动子上促进肝脏再生。UHRF1 缺陷促进肝脏再生揭示了一种全新的 H3K27me3 介导的 DNA 甲基化调控模式，也为研究肝脏再生障碍的治疗方法提供了崭新的思路。
4 小结与展望
DNA 甲基化是目前研究最深入的表观遗传调控机制之一，但在肝脏再生领域，DNA 甲基化的研究还只是起步阶段。虽然 DNA 甲基化的调控机制尚未阐明，但越来越多的实验已表明 DNA 甲基化对肝脏再生是至关重要的。随着近年来表观遗传学研究的进一步深入以及相关治疗药物的不断涌现，DNA 甲基化水平的干预治疗有望给实施肝部分切除术、肝移植等肝脏手术患者带来良好的预后。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们无相互竞争的利益。
作者贡献声明：何宇涛起草文章；冉江华采集数据及对论文进行指导。