引用本文： 冯宁, 林峰, 张旭, 薛帆, 崔佑刚, 马洋, 刘文志. Lgr5 蛋白和 E-钙黏蛋白在胃癌组织中表达的研究. 中国普外基础与临床杂志, 2020, 27(3): 309-314. doi: 10.7507/1007-9424.201909064 复制
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其预后差，患者早期发现率低，出现症状时发现多为中晚期，其传统治疗方式多采用以手术为主辅以化疗，但其效果仍然较差，肿瘤恶性侵袭、淋巴结转移和远处转移是其预后不良的主要原因，因此，近年来针对胃癌细胞的侵袭及转移相关机制的探索成为研究的热点。目前随着胃癌研究的不断深入，认为与肿瘤发生、发展密切相关的一个假说是癌干细胞（也称肿瘤干细胞），其具有自我更新、抗化疗药物治疗及耐放射线治疗特性，其持续生长、复制能够导致术后肿瘤的复发、化疗后肿瘤再进展以及患者最终死亡。因此，研究的重点已不仅仅是杀死已增殖成熟的肿瘤细胞，还要通过其特定标志物早期检测及特异性靶向治疗消灭肿瘤干细胞。富含亮氨酸重复序列的 G 蛋白偶联受体 5（leucine rich repeat containing G protein coupled receptor 5，Lgr5）作为已知直肠癌肿瘤干细胞的标志物目前在胃癌中被广泛关注[1-4]；同时在建立并维持细胞间连接、细胞极性及组织构架方面起重要作用的E-钙黏蛋白（E-cadherin，E-cad）在胃癌研究中被认为是关键的肿瘤抑制基因。Lgr5 和 E-cad 被许多研究发现其存在基因甲基化而失活现象，可能与肿瘤发生及发展有密切关系。本研究着眼于探索胃癌可能的肿瘤干细胞标志物及可能用于胃癌术后风险评估的标志物，因此，检测肿瘤干细胞标志物 Lgr5 及肿瘤抑制基因 E-cad 蛋白在胃癌组织的表达情况，并分析其与胃癌患者的临床病理特征和生存的关系，同时分析其二者在胃癌发展中是否存在协同作用。
1 资料与方法
1.1 组织标本的收集
收集 2011–2013 年期间大连大学附属中山医院胃肠外科手术切除的胃腺癌标本（69 例）及距离癌组织 5 cm 以远的正常胃黏膜组织（30 例）；同时收集这些患者的性别、年龄、分化程度、浸润深度[5]、淋巴结转移、远处转移及幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，HP）感染情况。所有患者均为首次手术，术前未经过放、化疗，手术切除组织均有病理报告。69 例胃腺癌患者中男 49 例，女 20 例；年龄 36～90 岁、（66±10）岁。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂
一抗：鼠抗人单克隆抗 Lgr5 抗体（购自北京中杉金桥生物技术有限公司）和兔抗人单克隆抗 E-cad 抗体（购自武汉博士德生物工程有限公司），二抗即用型 SABC-POD（小鼠/兔 IgG）试剂盒和 DAB 显色剂（均购自武汉博士德生物技术有限公司），磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）、培养基等实验耗材等（大连大学附属中山医院中心实验室）。
1.2.2 检测方法
手术标本常规经 4% 甲醛溶液固定，行石蜡包埋后连续切片 4 μm，再采用免疫组织化学 SABC 法染色以检测 Lgr5 及 E-cad 蛋白表达情况。严格按照说明书进行操作：脱蜡、脱水、灭活、抗原修复、封闭工作液、加一抗、二抗、DAB 显色、封片等步骤。阳性对照用已知的阳性组织，用 PBS 代替一抗作为阴性对照。采用快速尿素酶法检测HP感染情况。
1.2.3 结果判断
参照抗体说明书，Lgr5 蛋白表达以细胞浆和（或）细胞膜出现黄色和（或）棕黄色颗粒判断为阳性，根据细胞着色程度和阳性细胞百分比进行半定量评分，按细胞着色程度计分：无色为 0 分、浅黄色为 1 分、黄色为 2 分、棕黄色为 3 分；按阳性细胞百分比计分：阳性细胞数>75% 为 4 分、50%～75% 为 3 分、25%～50% 为 2 分、5%～25% 为 1 分、<5% 为 0 分进行判断赋值。通过细胞着色程度与阳性细胞百分比分值进行相乘为最终表达计分，总分为 0～12 分，其中 0 分为不表达（–）、1～4 分为弱阳性表达（+）、5～8 分为中等阳性表达（++）、9～12 分为强阳性表达（+++）。E-cad 蛋白表达以细胞浆或细胞膜内存在棕黄色颗粒作为阳性标志，阳性细胞数>75% 为强阳性表达（+++）、50%～75% 为中等阳性表达（++）、10%～50% 为弱阳性表达（+）、<10% 为不表达（–）。最终阳性表达结果包括“（+）～（+++）”。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 25.0 软件进行统计分析。计数资料及四格表资料比较采用卡方（χ2）检验。两等级变量相关性分析采用 Spearman 等级相关进行分析。术后 5 年生存分析采用 Kaplan-Meier 分析，采用 log-rank 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 Lgr5 和 E-cad 蛋白在胃癌患者不同组织中的表达情况
Lgr5 蛋白在 60 例（87.0%）胃癌患者的胃癌组织中呈阳性表达，主要表达于细胞质和细胞膜中，呈黄色或棕黄色颗粒弥漫性表达（图 1a），其在 5 例（16.7%）癌旁正常胃黏膜组织中也呈阳性表达（图 1b）；E-cad 蛋白在 30 例（43.5%）胃癌患者的胃癌组织中呈阳性表达，主要表达于细胞膜及细胞浆中，呈棕黄色（图 1c），其在 30 例（100%）癌旁正常胃黏膜组织中均呈阳性表达（图 1d），主要表达于细胞膜及细胞浆中，呈棕黄色。Lgr5 和 E-cad 蛋白在胃癌患者的胃癌组织和癌旁正常胃黏膜组织中的蛋白表达具体情况见表 1。Lgr5 蛋白表达阳性率在胃癌组织中明显高于癌旁正常胃黏膜组织（χ2=45.814，P<0.001）；E-cad 蛋白表达阳性率在胃癌组织中明显低于癌旁正常胃黏膜组织（χ2=11.249，P=0.001）。
图1
免疫组织化学方法检测 Lgr5 和 E-cad 蛋白表达情况（SABC 法 ×400）
a、b：Lgr5 蛋白在胃癌组织（a）及癌旁正常胃黏膜组织（b）中的表达；c、d：E-cad 蛋白在胃癌组织（c）及癌旁正常胃黏膜组织（d）中的表达
表1
Lgr5 和 E-cad 蛋白在胃癌组织及癌旁正常胃黏膜组织中的表达情况（例）
2.2 Lgr5 和 E-cad 蛋白在胃癌组织中的表达与胃癌患者临床病理特征的关系以及其与患者 5 年生存率的关系
结果见表 2。Lgr5 和 E-cad 在胃癌组织中的蛋白表达阳性率均与胃癌患者的性别和远处转移无关（P>0.05），二者的蛋白表达阳性率均与分化程度和浸润深度有关，即 Lgr5 蛋白表达阳性率在 T3+T4 期和低-未分化胃癌组织中明显高于在 T1+T2 期和高-中分化胃癌组织中（P<0.05），在有淋巴结转移和 HP 感染阳性患者中明显高于无淋巴结转移及 HP 感染阴性患者（P<0.05）；E-cad 蛋白表达阳性率在 T3+T4 期和低-未分化胃癌组织中明显低于在 T1+T2 期和高-中分化胃癌组织中（P<0.05），其与淋巴结转移和 HP 感染无关（P<0.05）。Lgr5 蛋白表达阳性患者 5 年生存率为 28.33%（17/60），阴性患者的 5 年生存率为 66.67%（6/9），二者的 5 年总生存时间曲线比较差异无统计学意义（χ2=1.819，P=0.177）；E-cad 蛋白表达阳性患者 5 年生存率为 43.33%（13/30），阴性患者的 5 年生存率为 20.51%（8/39），阳性胃癌患者的 5 年总生存时间明显优于阴性胃癌患者（χ2=5.814，P=0.016），见图 2。
表2
Lgr5 和 E-cad 蛋白在胃癌组织中的表达与胃癌患者的临床病理特征的关系［例（%）］
图2
Lgr5（a）和 E-cad（b）蛋白在胃癌组织中表达阳性和阴性患者的总生存曲线比较
2.3 胃癌组织中 Lgr5 蛋白表达与 E-cad 蛋白表达的相关性
经 Spearman 相关性分析显示，Lgr5 蛋白表达与 E-cad 表达呈明显的负相关（rs=–0.355，P=0.003），见表 3。
表3
胃癌组织中 Lgr5 蛋白表达与 E-cad 蛋白表达的相关性分析结果（例）
3 讨论
目前 Lgr5 蛋白在胃癌中被广泛关注，同时作为抑癌基因的 E-cad 蛋白表达在胃癌发生及发展中的作用机制目前尚不明确。本研究对此进行了探索，并且探讨了二者在胃癌发生及发展中是否具有协同作用。
3.1 Lgr5 蛋白表达与胃癌患者临床病理特征的关系
Lgr5 蛋白是 G 蛋白偶联受体家族的成员之一，其广泛分布于人体各种组织中，如在毛囊、大脑、胃肠道、乳腺、生殖器官等均有表达，它的结构特点为其多肽链的细胞外区有 17 个富含亮氨酸的重复序列，N 端和 C 端富含半胱氨酸序列以及高度保守的 7 次 α 螺旋跨膜区。Lgr5 蛋白广泛表达于结直肠癌小肠和结肠黏膜的腺隐窝基底部的柱状细胞中[1-8]，还发现下调其 mRNA 水平成功诱导了结直肠癌细胞的凋亡现象，因此认为其在恶性肿瘤的发生过程中可能起着潜在的促进作用；Lgr5 作为 Wnt 信号通路下游的靶向基因，其能够增强 Wnt/β-catenin 信号通路的作用[9-16]。Lgr5 作为结肠癌肿瘤干细胞标志物在结肠癌组织中大量表达且与结肠癌的发生、复发、转移、患者的生存预后等指标密切相关。目前也有研究者发现 Lgr5 在胃癌组织中呈高表达并怀疑其与胃癌的增殖、侵袭和转移有关。本研究中结果发现，Lgr5 在胃癌组织中的蛋白表达阳性率较癌旁正常胃黏膜组织中明显升高，并且发现 Lgr5 蛋白表达阳性率在 T3+T4 期、N1～N3 期及低-未分化胃癌组织中均较 T1+T2、N0 和高-中分化胃癌中明显升高（P<0.05），结果提示，Lgr5 蛋白表达可能参与了肿瘤组织局部浸润、淋巴转移过程并与肿瘤分化程度较低密切相关，具有在结肠癌中类似的促肿瘤作用，但其具体机制仍需进一步的研究揭示；本研究中未发现 Lgr5 蛋白表达阳性率与肿瘤远处转移有关（P=0.486），分析其原因可能与纳入样本量有关，M1 期病例数仅有 5 例，客观上可能会造成统计学上的偏差，后期的研究还需增大 M1 期患者的样本量以明确 Lgr5 蛋白表达与肿瘤远处转移的确切相关性；本研究进一步分析了 Lgr5 蛋白阳性和阴性表达胃癌患者的术后 5 年生存情况，其结果未发现二者的术后 5 年生存率比较差异有统计学意义（P=0.117），还需增加样本量及延长随访时间进一步分析才能得出明确结论。本实验中还发现 HP 感染阳性患者具有较高的 Lgr5 蛋白表达阳性率，尚不明确二者是否具有协同作用，还需进一步的大样本分析明确 HP 感染与 Lgr5 蛋白在胃癌进展中的联系及具体机制。
3.2 E-cad 蛋白表达与胃癌患者临床病理特征的关系
E-cad 是一种由染色体 16q22.1 上的 CDH1 基因编码的嗜同种跨膜细胞黏附蛋白，其主要表达于上皮细胞内，该蛋白在建立并维持细胞间连接、细胞极性以及组织构架方面均起重要作用。CDH1 基因被认为在人类肿瘤中是关键的肿瘤抑制基因。E-cad 的异常表达已经被发现存在于多种肿瘤如结直肠癌、胃腺癌、乳腺癌及妇科肿瘤组织中。有研究[17-20]发现，CDH1 基因表达下调或失活与肿瘤的浸润和远处转移有关，同时由于 E-cad 是一种位于上皮细胞内的钙依赖性细胞黏附分子，其表达程度的改变可能造成肿瘤结构的改变。同时已有研究[1-4]证实其在结肠癌中失活或下调与肿瘤的浸润生长和转移潜能有关。本研究中发现，E-cad 在胃癌组织中的蛋白表达阳性率较癌旁正常胃黏膜组织中明显下调，并且发现 E-cad 表达在 T3+T4 期及低-未分化胃癌组织的表达阳性率均较 T1+T2 和高中分化明显降低（P<0.05），结果提示，E-cad 蛋白表达阳性率低可能与肿瘤浸润、组织分化较低等生物学特性有关，分析其机理可能是由于 E-cad 与细胞膜细胞骨架的良好锚合及其维持正常生物屏障功能密切相关，因此，E-cad 的表达异常、功能缺失或其细胞膜锚合结构中某些分子的缺损，都可能导致癌细胞脱离肿瘤组织而向周围侵犯[20-25]；此外，本研究结果未发现胃癌组织中 E-cad 蛋白表达阳性率与患者性别、淋巴结转移、远处转移及 HP 感染情况有关（P>0.05），还需要进一步探索；本研究进一步分析了 E-cad 蛋白阳性和阴性表达胃癌患者的术后 5 年生存情况，其结果显示，E-cad 阳性表达患者的术后生存情况明显优于阴性表达患者（P=0.016），结果提示，E-cad 不仅在肿瘤的浸润及分化过程中发挥着重要作用，还与预后有关，未来 E-cad 检测可作为判断胃癌患者预后的重要指标之一。
3.3 Lgr5 蛋白与 E-cad 蛋白的关联
Lgr5 作为肿瘤干细胞标志物在肿瘤发生及进展中起到重要作用，在胃癌中其表达上调是否会被其他抑癌基因所抑制目前尚不明确，如作为抑癌因子的 E-cad 蛋白是否对 Lgr5 有一定影响成为关注焦点。在本研究中发现，Lgr5 在胃癌组织中的蛋白表达阳性率明显高于癌旁正常胃黏膜组织，而 E-cad 蛋白表达阳性率情况与此相反且呈明显的负相关关系（rs=–0.355，P=0.003），并且发现 E-cad 蛋白和 Lgr5 蛋白表达均与胃癌的局部浸润和分化程度有关，结果提示，二者可能在胃癌的发生及发展过程中起到某种协同作用，但其具体机制还不清楚，需要进一步探索。
总之，从本研究初步结果提示，Lgr5 蛋白和E-cad 蛋白在胃癌组织中的表达阳性率相对于癌旁正常胃黏膜组织分别上升和下降，且二者与肿瘤的分化程度和淋巴结转移有密切的关系，二者可能共同参与了胃癌的发生、发展及转移过程；同时还发现 Lgr5 蛋白可能与 HP 感染具有协同作用，但其具体机制尚不清楚。本研究结论仍需大样本的随机对照研究证实并进一步发掘其在胃癌中的相互关系和作用机制。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：冯宁完成课题设计、课题实施及论文撰写工作；刘文志、林峰完成论文设计、实验指导；张旭、薛帆、崔佑刚、马洋参与病例收集、部分免疫组化实验、术后随访等工作。
伦理声明：本研究通过了大连大学附属中山医院伦理委员会审批（伦理编号：2016004）。
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其预后差，患者早期发现率低，出现症状时发现多为中晚期，其传统治疗方式多采用以手术为主辅以化疗，但其效果仍然较差，肿瘤恶性侵袭、淋巴结转移和远处转移是其预后不良的主要原因，因此，近年来针对胃癌细胞的侵袭及转移相关机制的探索成为研究的热点。目前随着胃癌研究的不断深入，认为与肿瘤发生、发展密切相关的一个假说是癌干细胞（也称肿瘤干细胞），其具有自我更新、抗化疗药物治疗及耐放射线治疗特性，其持续生长、复制能够导致术后肿瘤的复发、化疗后肿瘤再进展以及患者最终死亡。因此，研究的重点已不仅仅是杀死已增殖成熟的肿瘤细胞，还要通过其特定标志物早期检测及特异性靶向治疗消灭肿瘤干细胞。富含亮氨酸重复序列的 G 蛋白偶联受体 5（leucine rich repeat containing G protein coupled receptor 5，Lgr5）作为已知直肠癌肿瘤干细胞的标志物目前在胃癌中被广泛关注[1-4]；同时在建立并维持细胞间连接、细胞极性及组织构架方面起重要作用的E-钙黏蛋白（E-cadherin，E-cad）在胃癌研究中被认为是关键的肿瘤抑制基因。Lgr5 和 E-cad 被许多研究发现其存在基因甲基化而失活现象，可能与肿瘤发生及发展有密切关系。本研究着眼于探索胃癌可能的肿瘤干细胞标志物及可能用于胃癌术后风险评估的标志物，因此，检测肿瘤干细胞标志物 Lgr5 及肿瘤抑制基因 E-cad 蛋白在胃癌组织的表达情况，并分析其与胃癌患者的临床病理特征和生存的关系，同时分析其二者在胃癌发展中是否存在协同作用。
1 资料与方法
1.1 组织标本的收集
收集 2011–2013 年期间大连大学附属中山医院胃肠外科手术切除的胃腺癌标本（69 例）及距离癌组织 5 cm 以远的正常胃黏膜组织（30 例）；同时收集这些患者的性别、年龄、分化程度、浸润深度[5]、淋巴结转移、远处转移及幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，HP）感染情况。所有患者均为首次手术，术前未经过放、化疗，手术切除组织均有病理报告。69 例胃腺癌患者中男 49 例，女 20 例；年龄 36～90 岁、（66±10）岁。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂
一抗：鼠抗人单克隆抗 Lgr5 抗体（购自北京中杉金桥生物技术有限公司）和兔抗人单克隆抗 E-cad 抗体（购自武汉博士德生物工程有限公司），二抗即用型 SABC-POD（小鼠/兔 IgG）试剂盒和 DAB 显色剂（均购自武汉博士德生物技术有限公司），磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）、培养基等实验耗材等（大连大学附属中山医院中心实验室）。
1.2.2 检测方法
手术标本常规经 4% 甲醛溶液固定，行石蜡包埋后连续切片 4 μm，再采用免疫组织化学 SABC 法染色以检测 Lgr5 及 E-cad 蛋白表达情况。严格按照说明书进行操作：脱蜡、脱水、灭活、抗原修复、封闭工作液、加一抗、二抗、DAB 显色、封片等步骤。阳性对照用已知的阳性组织，用 PBS 代替一抗作为阴性对照。采用快速尿素酶法检测HP感染情况。
1.2.3 结果判断
参照抗体说明书，Lgr5 蛋白表达以细胞浆和（或）细胞膜出现黄色和（或）棕黄色颗粒判断为阳性，根据细胞着色程度和阳性细胞百分比进行半定量评分，按细胞着色程度计分：无色为 0 分、浅黄色为 1 分、黄色为 2 分、棕黄色为 3 分；按阳性细胞百分比计分：阳性细胞数>75% 为 4 分、50%～75% 为 3 分、25%～50% 为 2 分、5%～25% 为 1 分、<5% 为 0 分进行判断赋值。通过细胞着色程度与阳性细胞百分比分值进行相乘为最终表达计分，总分为 0～12 分，其中 0 分为不表达（–）、1～4 分为弱阳性表达（+）、5～8 分为中等阳性表达（++）、9～12 分为强阳性表达（+++）。E-cad 蛋白表达以细胞浆或细胞膜内存在棕黄色颗粒作为阳性标志，阳性细胞数>75% 为强阳性表达（+++）、50%～75% 为中等阳性表达（++）、10%～50% 为弱阳性表达（+）、<10% 为不表达（–）。最终阳性表达结果包括“（+）～（+++）”。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 25.0 软件进行统计分析。计数资料及四格表资料比较采用卡方（χ2）检验。两等级变量相关性分析采用 Spearman 等级相关进行分析。术后 5 年生存分析采用 Kaplan-Meier 分析，采用 log-rank 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 Lgr5 和 E-cad 蛋白在胃癌患者不同组织中的表达情况
Lgr5 蛋白在 60 例（87.0%）胃癌患者的胃癌组织中呈阳性表达，主要表达于细胞质和细胞膜中，呈黄色或棕黄色颗粒弥漫性表达（图 1a），其在 5 例（16.7%）癌旁正常胃黏膜组织中也呈阳性表达（图 1b）；E-cad 蛋白在 30 例（43.5%）胃癌患者的胃癌组织中呈阳性表达，主要表达于细胞膜及细胞浆中，呈棕黄色（图 1c），其在 30 例（100%）癌旁正常胃黏膜组织中均呈阳性表达（图 1d），主要表达于细胞膜及细胞浆中，呈棕黄色。Lgr5 和 E-cad 蛋白在胃癌患者的胃癌组织和癌旁正常胃黏膜组织中的蛋白表达具体情况见表 1。Lgr5 蛋白表达阳性率在胃癌组织中明显高于癌旁正常胃黏膜组织（χ2=45.814，P<0.001）；E-cad 蛋白表达阳性率在胃癌组织中明显低于癌旁正常胃黏膜组织（χ2=11.249，P=0.001）。
图1
免疫组织化学方法检测 Lgr5 和 E-cad 蛋白表达情况（SABC 法 ×400）
a、b：Lgr5 蛋白在胃癌组织（a）及癌旁正常胃黏膜组织（b）中的表达；c、d：E-cad 蛋白在胃癌组织（c）及癌旁正常胃黏膜组织（d）中的表达
表1
Lgr5 和 E-cad 蛋白在胃癌组织及癌旁正常胃黏膜组织中的表达情况（例）
2.2 Lgr5 和 E-cad 蛋白在胃癌组织中的表达与胃癌患者临床病理特征的关系以及其与患者 5 年生存率的关系
结果见表 2。Lgr5 和 E-cad 在胃癌组织中的蛋白表达阳性率均与胃癌患者的性别和远处转移无关（P>0.05），二者的蛋白表达阳性率均与分化程度和浸润深度有关，即 Lgr5 蛋白表达阳性率在 T3+T4 期和低-未分化胃癌组织中明显高于在 T1+T2 期和高-中分化胃癌组织中（P<0.05），在有淋巴结转移和 HP 感染阳性患者中明显高于无淋巴结转移及 HP 感染阴性患者（P<0.05）；E-cad 蛋白表达阳性率在 T3+T4 期和低-未分化胃癌组织中明显低于在 T1+T2 期和高-中分化胃癌组织中（P<0.05），其与淋巴结转移和 HP 感染无关（P<0.05）。Lgr5 蛋白表达阳性患者 5 年生存率为 28.33%（17/60），阴性患者的 5 年生存率为 66.67%（6/9），二者的 5 年总生存时间曲线比较差异无统计学意义（χ2=1.819，P=0.177）；E-cad 蛋白表达阳性患者 5 年生存率为 43.33%（13/30），阴性患者的 5 年生存率为 20.51%（8/39），阳性胃癌患者的 5 年总生存时间明显优于阴性胃癌患者（χ2=5.814，P=0.016），见图 2。
表2
Lgr5 和 E-cad 蛋白在胃癌组织中的表达与胃癌患者的临床病理特征的关系［例（%）］
图2
Lgr5（a）和 E-cad（b）蛋白在胃癌组织中表达阳性和阴性患者的总生存曲线比较
2.3 胃癌组织中 Lgr5 蛋白表达与 E-cad 蛋白表达的相关性
经 Spearman 相关性分析显示，Lgr5 蛋白表达与 E-cad 表达呈明显的负相关（rs=–0.355，P=0.003），见表 3。
表3
胃癌组织中 Lgr5 蛋白表达与 E-cad 蛋白表达的相关性分析结果（例）
3 讨论
目前 Lgr5 蛋白在胃癌中被广泛关注，同时作为抑癌基因的 E-cad 蛋白表达在胃癌发生及发展中的作用机制目前尚不明确。本研究对此进行了探索，并且探讨了二者在胃癌发生及发展中是否具有协同作用。
3.1 Lgr5 蛋白表达与胃癌患者临床病理特征的关系
Lgr5 蛋白是 G 蛋白偶联受体家族的成员之一，其广泛分布于人体各种组织中，如在毛囊、大脑、胃肠道、乳腺、生殖器官等均有表达，它的结构特点为其多肽链的细胞外区有 17 个富含亮氨酸的重复序列，N 端和 C 端富含半胱氨酸序列以及高度保守的 7 次 α 螺旋跨膜区。Lgr5 蛋白广泛表达于结直肠癌小肠和结肠黏膜的腺隐窝基底部的柱状细胞中[1-8]，还发现下调其 mRNA 水平成功诱导了结直肠癌细胞的凋亡现象，因此认为其在恶性肿瘤的发生过程中可能起着潜在的促进作用；Lgr5 作为 Wnt 信号通路下游的靶向基因，其能够增强 Wnt/β-catenin 信号通路的作用[9-16]。Lgr5 作为结肠癌肿瘤干细胞标志物在结肠癌组织中大量表达且与结肠癌的发生、复发、转移、患者的生存预后等指标密切相关。目前也有研究者发现 Lgr5 在胃癌组织中呈高表达并怀疑其与胃癌的增殖、侵袭和转移有关。本研究中结果发现，Lgr5 在胃癌组织中的蛋白表达阳性率较癌旁正常胃黏膜组织中明显升高，并且发现 Lgr5 蛋白表达阳性率在 T3+T4 期、N1～N3 期及低-未分化胃癌组织中均较 T1+T2、N0 和高-中分化胃癌中明显升高（P<0.05），结果提示，Lgr5 蛋白表达可能参与了肿瘤组织局部浸润、淋巴转移过程并与肿瘤分化程度较低密切相关，具有在结肠癌中类似的促肿瘤作用，但其具体机制仍需进一步的研究揭示；本研究中未发现 Lgr5 蛋白表达阳性率与肿瘤远处转移有关（P=0.486），分析其原因可能与纳入样本量有关，M1 期病例数仅有 5 例，客观上可能会造成统计学上的偏差，后期的研究还需增大 M1 期患者的样本量以明确 Lgr5 蛋白表达与肿瘤远处转移的确切相关性；本研究进一步分析了 Lgr5 蛋白阳性和阴性表达胃癌患者的术后 5 年生存情况，其结果未发现二者的术后 5 年生存率比较差异有统计学意义（P=0.117），还需增加样本量及延长随访时间进一步分析才能得出明确结论。本实验中还发现 HP 感染阳性患者具有较高的 Lgr5 蛋白表达阳性率，尚不明确二者是否具有协同作用，还需进一步的大样本分析明确 HP 感染与 Lgr5 蛋白在胃癌进展中的联系及具体机制。
3.2 E-cad 蛋白表达与胃癌患者临床病理特征的关系
E-cad 是一种由染色体 16q22.1 上的 CDH1 基因编码的嗜同种跨膜细胞黏附蛋白，其主要表达于上皮细胞内，该蛋白在建立并维持细胞间连接、细胞极性以及组织构架方面均起重要作用。CDH1 基因被认为在人类肿瘤中是关键的肿瘤抑制基因。E-cad 的异常表达已经被发现存在于多种肿瘤如结直肠癌、胃腺癌、乳腺癌及妇科肿瘤组织中。有研究[17-20]发现，CDH1 基因表达下调或失活与肿瘤的浸润和远处转移有关，同时由于 E-cad 是一种位于上皮细胞内的钙依赖性细胞黏附分子，其表达程度的改变可能造成肿瘤结构的改变。同时已有研究[1-4]证实其在结肠癌中失活或下调与肿瘤的浸润生长和转移潜能有关。本研究中发现，E-cad 在胃癌组织中的蛋白表达阳性率较癌旁正常胃黏膜组织中明显下调，并且发现 E-cad 表达在 T3+T4 期及低-未分化胃癌组织的表达阳性率均较 T1+T2 和高中分化明显降低（P<0.05），结果提示，E-cad 蛋白表达阳性率低可能与肿瘤浸润、组织分化较低等生物学特性有关，分析其机理可能是由于 E-cad 与细胞膜细胞骨架的良好锚合及其维持正常生物屏障功能密切相关，因此，E-cad 的表达异常、功能缺失或其细胞膜锚合结构中某些分子的缺损，都可能导致癌细胞脱离肿瘤组织而向周围侵犯[20-25]；此外，本研究结果未发现胃癌组织中 E-cad 蛋白表达阳性率与患者性别、淋巴结转移、远处转移及 HP 感染情况有关（P>0.05），还需要进一步探索；本研究进一步分析了 E-cad 蛋白阳性和阴性表达胃癌患者的术后 5 年生存情况，其结果显示，E-cad 阳性表达患者的术后生存情况明显优于阴性表达患者（P=0.016），结果提示，E-cad 不仅在肿瘤的浸润及分化过程中发挥着重要作用，还与预后有关，未来 E-cad 检测可作为判断胃癌患者预后的重要指标之一。
3.3 Lgr5 蛋白与 E-cad 蛋白的关联
Lgr5 作为肿瘤干细胞标志物在肿瘤发生及进展中起到重要作用，在胃癌中其表达上调是否会被其他抑癌基因所抑制目前尚不明确，如作为抑癌因子的 E-cad 蛋白是否对 Lgr5 有一定影响成为关注焦点。在本研究中发现，Lgr5 在胃癌组织中的蛋白表达阳性率明显高于癌旁正常胃黏膜组织，而 E-cad 蛋白表达阳性率情况与此相反且呈明显的负相关关系（rs=–0.355，P=0.003），并且发现 E-cad 蛋白和 Lgr5 蛋白表达均与胃癌的局部浸润和分化程度有关，结果提示，二者可能在胃癌的发生及发展过程中起到某种协同作用，但其具体机制还不清楚，需要进一步探索。
总之，从本研究初步结果提示，Lgr5 蛋白和E-cad 蛋白在胃癌组织中的表达阳性率相对于癌旁正常胃黏膜组织分别上升和下降，且二者与肿瘤的分化程度和淋巴结转移有密切的关系，二者可能共同参与了胃癌的发生、发展及转移过程；同时还发现 Lgr5 蛋白可能与 HP 感染具有协同作用，但其具体机制尚不清楚。本研究结论仍需大样本的随机对照研究证实并进一步发掘其在胃癌中的相互关系和作用机制。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：冯宁完成课题设计、课题实施及论文撰写工作；刘文志、林峰完成论文设计、实验指导；张旭、薛帆、崔佑刚、马洋参与病例收集、部分免疫组化实验、术后随访等工作。
伦理声明：本研究通过了大连大学附属中山医院伦理委员会审批（伦理编号：2016004）。
