引用本文： 周柯均, 王城, 谢梦忆, 侯永川, 熊云麟, 刘瑜, 邓琳. 白藜芦醇通过 PI3K p85/Akt 信号轴抗 HepG2 肝癌细胞增殖. 中国普外基础与临床杂志, 2020, 27(7): 808-813. doi: 10.7507/1007-9424.201910006 复制
原发性肝癌是目前我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率占所有恶性肿瘤的第 4 位，致死率占第3 位，严重威胁我国人民的生命和健康[1]。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原发性肝癌的 85%～90%，预后差且死亡率高[2-4]。自 20 世纪以来，我国的 HCC 发病率呈逐年上升趋势，己成为农村恶性肿瘤致死的主要原因之一。目前 HCC 的治疗多以手术切除作为首选手段。虽然基于早期诊断的完整瘤体切除并辅之术后系统治疗的手段能有效延长患者的存活期限，但仍不能逆转或干预患者的不良预后结局[5]。因此，研发新型、高效且低毒的抗 HCC 药物迫在眉睫。非黄酮类的多酚化合物白藜芦醇，在植物中主要以反式形式存在，具有显著的抗炎和抗氧化的作用，在肿瘤的防治研究中备受关注。梁睿及其团队[6]曾发现，白藜芦醇可能通过升高 MCF-7/ADR 细胞中的 miR-519c 水平，抑制细胞耐药蛋白的表达，发挥逆转乳腺癌耐药的作用。苗向霞等[7]也发现，白藜芦醇可降低肝癌 HepG2 细胞中 O-乙酰葡糖胺糖基化蛋白（O-GlcNAc）的糖基化水平，进而抑制肝癌 HepG2 细胞中的脂肪合成。赵宇及其团队[8]曾报道，白藜芦醇可通过诱导自噬而抑制 HepG2 细胞的增殖，其机制可能与磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）通路有关。但目前关于白藜芦醇对 HCC 作用的研究主要基于其诱导自噬和抗氧化的功能，针对白藜芦醇如何通过 PI3K/Akt 轴影响 HCC 细胞增殖的机制的研究相对较少。因此，本研究拟观察白藜芦醇是否影响 HCC 细胞的增殖，并进一步研究白藜芦醇如何通过 PI3K/Akt 轴影响 HCC 细胞增殖，旨在为 HCC 的防治提供新的临床前药效效价依据。
1 材料和方法
1.1 细胞株、药物、试剂与设备
人肝癌细胞株 HepG2 由美国爱因斯坦医学院惠赠。
药物和试剂包括：二甲基亚砜（DMSO）和白藜芦醇（西格玛奥德里奇贸易有限公司）、DMEM 高糖培养基和 DEPC 水（赛默飞世尔科技有限公司）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）、CCK8 细胞增殖与活性检查试剂盒（DOJINDO LABORATORIES/日本株式会社同仁化学研究所）、胎牛血清（FBS，上海逍鹏生物科技有限公司）、PI3 Kinase p85α（型号：6G10，Mouse mAb，货号：#13666，Cell Signaling Technology）、Phospho-PI3 Kinase p85/p55（型号：E3U1H，Rabbit mAb，货号：#17366，Cell Signaling Technology）、Akt（型号：11E7，Rabbit mAb，货号：4685，Cell Signaling Technology）和 Phospho-Akt（型号：D9E，Rabbit mAb，货号：4060，Cell Signaling Technology）。
设备包括：光学显微镜（Leica Microsystems company）、酶标仪（Bio-Rad Laboratories company）、低速自动平衡离心机（雷勃尔医疗器械有限公司）、高速台式冷冻离心机（湘仪离心机仪器有限公司）、CO2 培养箱（赛默飞世尔科技有限公司）、超净工作台（Bio-Rad Laboratories company）、制冰机（Panasonic company）、漩涡振荡器（IKA 公司）、Fusion Solo 化学发光成像仪（VILBER 公司）、NovoCyte 流式细胞仪（ACEA）和 xCElligence RTCA DP（ACEA Biosciences，Inc）。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
将 HepG2 细胞加入 10 cm2培养皿中，添加含 10% FBS、1% 抗生素（青霉素和链霉素）的 DMEM 培养基约 10 mL，在温度 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养。
1.2.2 细胞处理及分组干预方式
取传代后 3 d 的 HepG2 细胞，给予不同浓度白藜芦醇处理：0、6.25、12.5、25.0 以及 50.0 μmol/L。0 μmol/L 组中加入等体积的 0.1% 的 DMSO 溶液作为对照。本实验用 0.1% 的 DMSO 溶液配置成 6.25、12.5、25.0 以及50.0 μmol/L 的白藜芦醇。
1.2.3 CCK8 细胞增殖与活性检测试剂盒检测细胞增殖活性
取对数期的 HepG2 细胞，用新鲜的完全培养基制成单细胞悬液，调整细胞密度为 5×104个/mL，每孔取 100 μL 细胞悬液于 96 孔板中，置于 37 ℃、5% CO2 的饱和湿度培养箱中培养 24 h 后，每孔加入相应的白藜芦醇，使其终末浓度分别为 0、12.5、25.0 和 50.0 μmol/L，每个浓度设置 6 个复孔。在 0、24、48 和 72 h 时，每孔加入 10 μLCCK8 溶液，放入培养箱继续孵育 2 h 后，在酶标仪上测定每孔在 450 nm 处的吸光度（A）值。计算每个浓度的均值，绘制生长曲线。
1.2.4 实时细胞分析仪（RTCA）系统检测细胞增殖与毒理
在 HepG2 细胞的对数生长期加入不同浓度的白藜芦醇（浓度包括 0、6.25、12.5、25.0 及 50.0 μmol/L），在之后的 2 d 时间内设定每 10 分钟连续读取 HepG2 细胞的 NCI（normalized cell index）值，以观察各个浓度白藜芦醇对 HepG2 细胞增殖的影响。具体操作为：实验前用 75% 乙醇棉球将 RTCA 检测仪擦拭干净，放入超净台中以紫外线消毒 1～2 h，再将 RTCA 检测仪置入恒温孵箱中，连接电脑检查仪器情况。实验步骤如下：① 首先，在超净工作台中向 16 孔增殖板的每个小孔中加入 60 μL 无血清基础培养基，后将 16 孔增殖板放入 RTCA 检测仪中，检查是否接触良好（在“Message”页面，显示 Connection OK），开始检测基线，检测后确定“Message”页面无警告报错信息；② 取出 16 孔增殖板，在超净工作台中以每孔 6 000 个细胞接种处于对数生长期的 HepG2 细胞混悬液 60 μL，室温放置 30 min，放入孵箱内的 RTCA 检测仪中，开始第二步检测增殖；③ 待细胞进入对数生长期后，于电脑软件上点击“abort current step”，放弃当前步骤，将板子取出。在每孔中加入不同浓度白藜芦醇并设置无药物的空白对照组。再次将加完药物的 16 孔板放回孵箱中。设定程序每 10 分钟进行 1 次阻抗值读数，48 h 后获得完整的细胞生长曲线。平行实验至少重复 3 次。
1.2.5 流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡
本研究 RTCA 结果提示，6.25 μmol/L 白藜芦醇对细胞的抑制作用与 0 μmol/L 比较差异不大，因此后续实验未设定该浓度，白藜芦醇浓度包括 0、12.5、25.0 及 50.0 μmol/L。收集 4 组处理 48 h 后的 HepG2 细胞于流式管中，用 PBS 重悬上述细胞，1 000 rpm/min 离心 5 min（离心半径为 13.5 cm）后弃上清液，再加入 300 μL 的 1×Binding Buffer 重悬细胞，添加 5 μL 的荧光素 APC 标记的 Annexin V（Annexin V-APC）和 7 氨基放线菌素（7-AAD）/核糖核酸酶（RNase）染液混匀后，室温避光孵育 15 min。将染好色后的细胞使用 NovoCyte 流式细胞仪进行凋亡细胞的检测。通过软件分析，绘制双色散点图，其中 APC 为横坐标，PE 为纵坐标。实验均重复 3 次，取均值。
1.2.6 Western blot 法检测 PI3K p85、磷酸化蛋白激酶 B（p-Akt）、总 Akt（t-Akt）和细胞周期素 A2（CyclinA2）蛋白的表达
收集 4 组处理 48 h 后的 HepG2 细胞，使用 RIPA 在冰上裂解细胞 30 min 后提取细胞总蛋白。以 BCA 试剂盒定量检测 4 组样本的蛋白浓度，然后取等量蛋白以 100 ℃ 变性 5 min。各取 20 μg 已经煮沸变性的蛋白样品上样，进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳。使用聚偏氟乙烯（PVDF）膜转膜，用含 5% 脱脂奶粉的 TBST 室温封闭超过 2 h，分别用 PI3K p85 抗体（1∶1 000）、p-Akt（phospho S473）抗体（1∶1 000）、t-Akt 抗体（1∶1 000）和 CyclinA2 抗体（1∶1 000）4 ℃ 冰箱孵育 PVDF 膜过夜。经过 TBST 洗涤 3 次后加入二抗，室温下于摇床上平摇1 h，用 TBST 漂洗 3 次 PVDF 膜后，暗室中使用显影液显影曝光。以细胞内 GAPDH 的含量作为内参，利用 ImageJ 软件对曝光后的 4 组目的蛋白条带进行光密度扫描定量。PI3K p85、t-Akt 和 CyclinA2 蛋白的相对表达水平为相应蛋白条带的光密度量比上对应内参蛋白 GAPDH 的光密度量。常规内参 GAPDH 检测只能排除体系误差，为明确 p-Akt 的表达变化是因上样量不同所致还是因白藜芦醇作用而致，在后续结果分析中进一步明确比较 p-Akt 蛋白的相对表达水平与 t-Akt 的相对表达水平的比值。每组细胞重复测量 3 次。
1.3 统计学方法
用 SPSS 23.0 统计软件进行分析。计量数据均采用均数±标准差（
±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用最小显著性差异法（LSD 法）。检验水准为 α=0.05。
2 结果
2.1 CCK8 法观察白藜芦醇对 HepG2 细胞活力的影响
如图 1a 所示，CCK8 实验结果显示，白藜芦醇对 HepG2 细胞的生长具有明显的抑制作用：相较于不加白藜芦醇的 0 μmol/L 组而言，随着浓度和时间的延长，各浓度组在不同时间点的 OD值均小于 0 μmol/L 组，表现出抑制效应；白藜芦醇作用 48 h 后，各个浓度对细胞的抑制效应均增大，且 50 μmol/L浓度下细胞的抑制效应最大。
图1
示 CCK8 法和 RTCA 系统检测各浓度白藜芦醇对 HepG2 细胞活力的影响、流式细胞仪检测细胞凋亡情况以及 Western blot 法检测各浓度白藜芦醇对 HepG2 细胞中 PI3K/Akt 信号及其下游 CyclinA2 蛋白的表达结果
a：CCK8 法检测的各浓度白藜芦醇对 HepG2 细胞活力的影响结果；b：RTCA 系统示踪曲线；c：RTCA 系统检测各浓度白藜芦醇对 HepG2 细胞活力的影响结果，与 0 μmol/L 和 6.25 μmol/L 比较，*
2.2 RTCA 系统观察各浓度白藜芦醇对 HepG2 细胞增殖的影响
通过 RTCA 系统检测加药后不同时间点不同浓度白藜芦醇处理组细胞的 NCI 值，结果显示，与 0 μmol/L 相比，白藜芦醇在浓度为 6.25 μmol/L 时对 HepG2 细胞 NCI 值的影响不大；但从浓度为 12.5 μmol/L 开始，HepG2 细胞的 NCI 值显著降低；且随着时间的延长，12.5、25.0 和 50.0 μmol/L 白藜芦醇组的 NCI 值逐渐降低（图 1b）。
处理 12、24、36 和 48 h 时，同时点 0 μmol/L 组和 6.25 μmol/L 组的 NCI 值比较差异均无统计学意义（P>0.05），但同时点 12.5、25.0 及 50.0 μmol/L 组与 0 μmol/L 组比较，NCI 值均降低，差异有统计学意义（P<0.05），见图 1c。
2.3 白藜芦醇可以诱导 HepG2 细胞凋亡
4 组细胞的流式细胞仪检测结果表明，白藜芦醇可以诱导 HepG2 细胞发生细胞凋亡，且具有剂量依赖性。通过与 0 μmol/L 浓度比较，发现不同浓度白藜芦醇可以诱导前肝癌细胞系 HepG2 的细胞凋亡，晚期凋亡细胞率由 0 μmol/L 处理组的 3.21% 上升到 50.0 μmol/L 白藜芦醇处理组的 20.64%，具体见图 1d–1g）。
2.4 白藜芦醇在肝癌细胞中抑制 PI3K p85/Akt 信号的表达
Western blot 结果显示，12.5、25.0 以及50.0 μmol/L 白藜芦醇可以显著降低 HepG2 细胞内 PI3K p85 蛋白的表达水平，与 0 μmol/L 白藜芦醇组比较差异均有统计学意义（P<0.05），且白藜芦醇的效应呈剂量依赖关系，即白藜芦醇的给药浓度越高越能降低 HepG2 细胞内 PI3K p85 的表达水平，3 个浓度组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。但白藜芦醇对 HepG2 细胞内 t-Akt 蛋白的表达水平无显著影响，4 组间比较差异无统计学意义（P>0.05），见图 1h 和图 1i。
此外，鉴于前述研究中观察到白藜芦醇对 HepG2 细胞内 t-Akt 蛋白的表达水平无显著影响，而 Akt 的磷酸化也能从侧面反映出 PI3K 信号通路的激活，故本研究进一步检测 p-Akt 的水平。常规内参 GAPDH 检测只能排除体系误差，为明确p-Akt 的表达变化是因上样量不同所致还是因白藜芦醇作用而致，在后续结果分析中明确比较 p-Akt 蛋白的相对表达水平与 t-Akt 蛋白的相对表达水平的比值。结果表明，与 0 μmol/L 白藜芦醇组比较，12.5、25.0 和 50.0 μmol/L 白藜芦醇组的 p-Akt 和p-Akt/t-Akt 比值均较低（P<0.05），见图 1i。该研究结果提示，白藜芦醇抑制的是 HepG2 细胞内 Akt 的第 473 位丝氨酸的磷酸化。
2.5 白藜芦醇在肝癌细胞中抑制 PI3K p85/Akt 下游 CyclinA2 蛋白的表达
Western blot 结果显示，与 0 μmol/L 比较，12.5、25.0 和 50.0 μmol/L 白藜芦醇可以显著降低HepG2 细胞内 CyclinA2 蛋白的表达水平（P<0.05），且呈剂量依赖关系，即白藜芦醇的给药浓度越高越能降低 HepG2 细胞内 CyclinA2 蛋白的表达水平（图 1j 和 1k）。
3 讨论
白藜芦醇的化学名称为 3,5,4´-三羟基苯二烯，主要存在于葡萄、藜芦、虎杖等植物中，是植物在恶劣环境下或遭到病原体侵害时自身分泌的一种抵御感染的多酚类抗菌素[9]。白藜芦醇作为一种天然的有多种生物学功能的植物化合物，具有降脂、抗氧化、抗癌、保护心脑血管、保肝、抗衰老、免疫调节、雌激素样作用等功能。随着研究的不断深入发展，其药理活性的研究逐渐得到关注，尤其在防治肿瘤、心血管疾病等方面显示出巨大的应用潜力，有望开发成为可防治多种疾病的新型药物，具有广泛的应用前景[10]。研究发现，白藜芦醇可以通过减少细胞凋亡、抑制脂质过氧化、抑制炎性细胞因子表达等，实现保护肝细胞、减轻肝损伤和促进肝功能恢复的目的[11-12]。离体或动物实验观察到，白藜芦醇对消化、血液、呼吸、生殖等多个系统来源的多种肿瘤细胞都有拮抗作用[13]。本实验在不同浓度白藜芦醇处理 HepG2 肝癌细胞的研究中观察到，白藜芦醇对 HepG2 细胞的生长具有明显的抑制作用，并且随着时间的延长和白藜芦醇浓度的增高，HepG2 细胞的活力越来越低。白藜芦醇作用 48 h 后，各个浓度对细胞的抑制效应逐渐增大，且 50.0 μmol/L 浓度下细胞的抑制效应最强。进一步的 RTCA 系统研究也发现，白藜芦醇对 HepG2 细胞的 NCI 值降低作用具有浓度依赖关系，即白藜芦醇浓度越高对 HepG2 细胞的 NCI 值降低作用越强，且该作用具有时间依赖效应。以上结果也证实了，高浓度的白藜芦醇可以抑制 HepG2 肝癌细胞的增殖，而白藜芦醇抑制 HepG2 肝癌细胞增殖的效应也具有时间和剂量依赖效应。
白藜芦醇抑制肿瘤细胞的生长，与其对细胞周期的调控相关[14]。白藜芦醇在肿瘤的发生和发展过程中都具有抗肿瘤功效。这主要依靠其抗氧化性和抗突变作用，诱导第二相药代酶产生（抗启动活性）；此外，它可以传递抗炎作用并有抑制环氧合酶（COX）和过氧代氢酶的功能（即抗促进作用）[15-16]。白藜芦醇通过诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、阻滞细胞周期、介导体液免疫应答、调节细胞因子分泌和拮抗肿瘤血管生成而影响肿瘤的发生发展[17]。Delmas 等[18]发现，白藜芦醇作用于肝癌小鼠模型后，可以抑制周期蛋白的产生，降低周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK）蛋白表达和活性，阻滞细胞周期，达到抑制肝癌细胞增殖的作用；上述作用存在时间和剂量的依赖性。有实验[18]表明，白藜芦醇在短时间内可以通过浓度依赖性作用阻断肿瘤的 DNA 合成，当作用时间延长后通过作用于细胞周期而起到阻滞肿瘤生长的作用；进一步实验证实，白藜芦醇可以通过减慢细胞周期循环速度或阻滞某一特定时相从而发挥其作用，这种作用与其浓度有关。经白藜芦醇处理过的细胞不仅仅有相应的细胞周期改变，并伴有细胞核增大。Bishayee 等[19]对二乙亚硝胺诱导的动物肝癌的实验研究发现，白藜芦醇诱导肿瘤细胞凋亡的途径之一可能是上调 Nrf2 核转录因子介导的蛋白及 mRNA 的表达，从而起促进肝癌细胞凋亡的作用[20]。
白藜芦醇可通过多条途径发挥抗肿瘤作用，其中 PI3K 信号转导通路成为近年来的研究热点[21-22]。在培养的小鼠 JB6 表皮细胞中，白藜芦醇及其衍生物通过阻断表皮生长因子介导的 PI3K/Akt 的活性而抑制肿瘤细胞的转化[23-24]。在人类乳腺癌细胞中，白藜芦醇通过影响与雌激素受体 α 相关的 PI3K 信号通路，从而阻断细胞的生存和增殖[25-26]。笔者在本研究中观察到，白藜芦醇可以显著降低 HepG2 细胞内 PI3K p85 的表达水平，且呈剂量依赖关系，即白藜芦醇的给药浓度越高越能下调 HepG2 细胞内 PI3K p85 的表达。虽然白藜芦醇对 HepG2 细胞内 t-Akt 的表达水平无显著影响，但白藜芦醇可以显著降低 HepG2 细胞内 p-Akt 的表达水平，且白藜芦醇降低的是 HepG2 细胞内 Akt 的第 473 位丝氨酸的磷酸化。此外，本研究结果还显示，白藜芦醇可以显著降低 HepG2 细胞内 PI3K p85/Akt 信号通路下游 CyclinA2 蛋白的表达水平，且呈剂量依赖关系，即白藜芦醇的给药浓度越高越能降低 HepG2 细胞内 CyclinA2 蛋白的表达水平。因此，结合前人研究与本实验的观察发现，笔者认为，白藜芦醇可能通过 PI3K p85/Akt 信号轴来达到抗肝癌细胞增殖的作用，这为 HCC 的药物治疗提供了新的思路。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：周柯均撰写文章和参与实验；王城负责实验质控；谢梦忆参与数据分析、整理及汇总；侯永川、熊云麟、刘瑜和邓琳参与实验。
原发性肝癌是目前我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率占所有恶性肿瘤的第 4 位，致死率占第3 位，严重威胁我国人民的生命和健康[1]。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原发性肝癌的 85%～90%，预后差且死亡率高[2-4]。自 20 世纪以来，我国的 HCC 发病率呈逐年上升趋势，己成为农村恶性肿瘤致死的主要原因之一。目前 HCC 的治疗多以手术切除作为首选手段。虽然基于早期诊断的完整瘤体切除并辅之术后系统治疗的手段能有效延长患者的存活期限，但仍不能逆转或干预患者的不良预后结局[5]。因此，研发新型、高效且低毒的抗 HCC 药物迫在眉睫。非黄酮类的多酚化合物白藜芦醇，在植物中主要以反式形式存在，具有显著的抗炎和抗氧化的作用，在肿瘤的防治研究中备受关注。梁睿及其团队[6]曾发现，白藜芦醇可能通过升高 MCF-7/ADR 细胞中的 miR-519c 水平，抑制细胞耐药蛋白的表达，发挥逆转乳腺癌耐药的作用。苗向霞等[7]也发现，白藜芦醇可降低肝癌 HepG2 细胞中 O-乙酰葡糖胺糖基化蛋白（O-GlcNAc）的糖基化水平，进而抑制肝癌 HepG2 细胞中的脂肪合成。赵宇及其团队[8]曾报道，白藜芦醇可通过诱导自噬而抑制 HepG2 细胞的增殖，其机制可能与磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）通路有关。但目前关于白藜芦醇对 HCC 作用的研究主要基于其诱导自噬和抗氧化的功能，针对白藜芦醇如何通过 PI3K/Akt 轴影响 HCC 细胞增殖的机制的研究相对较少。因此，本研究拟观察白藜芦醇是否影响 HCC 细胞的增殖，并进一步研究白藜芦醇如何通过 PI3K/Akt 轴影响 HCC 细胞增殖，旨在为 HCC 的防治提供新的临床前药效效价依据。
1 材料和方法
1.1 细胞株、药物、试剂与设备
人肝癌细胞株 HepG2 由美国爱因斯坦医学院惠赠。
药物和试剂包括：二甲基亚砜（DMSO）和白藜芦醇（西格玛奥德里奇贸易有限公司）、DMEM 高糖培养基和 DEPC 水（赛默飞世尔科技有限公司）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）、CCK8 细胞增殖与活性检查试剂盒（DOJINDO LABORATORIES/日本株式会社同仁化学研究所）、胎牛血清（FBS，上海逍鹏生物科技有限公司）、PI3 Kinase p85α（型号：6G10，Mouse mAb，货号：#13666，Cell Signaling Technology）、Phospho-PI3 Kinase p85/p55（型号：E3U1H，Rabbit mAb，货号：#17366，Cell Signaling Technology）、Akt（型号：11E7，Rabbit mAb，货号：4685，Cell Signaling Technology）和 Phospho-Akt（型号：D9E，Rabbit mAb，货号：4060，Cell Signaling Technology）。
设备包括：光学显微镜（Leica Microsystems company）、酶标仪（Bio-Rad Laboratories company）、低速自动平衡离心机（雷勃尔医疗器械有限公司）、高速台式冷冻离心机（湘仪离心机仪器有限公司）、CO2 培养箱（赛默飞世尔科技有限公司）、超净工作台（Bio-Rad Laboratories company）、制冰机（Panasonic company）、漩涡振荡器（IKA 公司）、Fusion Solo 化学发光成像仪（VILBER 公司）、NovoCyte 流式细胞仪（ACEA）和 xCElligence RTCA DP（ACEA Biosciences，Inc）。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
将 HepG2 细胞加入 10 cm2培养皿中，添加含 10% FBS、1% 抗生素（青霉素和链霉素）的 DMEM 培养基约 10 mL，在温度 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养。
1.2.2 细胞处理及分组干预方式
取传代后 3 d 的 HepG2 细胞，给予不同浓度白藜芦醇处理：0、6.25、12.5、25.0 以及 50.0 μmol/L。0 μmol/L 组中加入等体积的 0.1% 的 DMSO 溶液作为对照。本实验用 0.1% 的 DMSO 溶液配置成 6.25、12.5、25.0 以及50.0 μmol/L 的白藜芦醇。
1.2.3 CCK8 细胞增殖与活性检测试剂盒检测细胞增殖活性
取对数期的 HepG2 细胞，用新鲜的完全培养基制成单细胞悬液，调整细胞密度为 5×104个/mL，每孔取 100 μL 细胞悬液于 96 孔板中，置于 37 ℃、5% CO2 的饱和湿度培养箱中培养 24 h 后，每孔加入相应的白藜芦醇，使其终末浓度分别为 0、12.5、25.0 和 50.0 μmol/L，每个浓度设置 6 个复孔。在 0、24、48 和 72 h 时，每孔加入 10 μLCCK8 溶液，放入培养箱继续孵育 2 h 后，在酶标仪上测定每孔在 450 nm 处的吸光度（A）值。计算每个浓度的均值，绘制生长曲线。
1.2.4 实时细胞分析仪（RTCA）系统检测细胞增殖与毒理
在 HepG2 细胞的对数生长期加入不同浓度的白藜芦醇（浓度包括 0、6.25、12.5、25.0 及 50.0 μmol/L），在之后的 2 d 时间内设定每 10 分钟连续读取 HepG2 细胞的 NCI（normalized cell index）值，以观察各个浓度白藜芦醇对 HepG2 细胞增殖的影响。具体操作为：实验前用 75% 乙醇棉球将 RTCA 检测仪擦拭干净，放入超净台中以紫外线消毒 1～2 h，再将 RTCA 检测仪置入恒温孵箱中，连接电脑检查仪器情况。实验步骤如下：① 首先，在超净工作台中向 16 孔增殖板的每个小孔中加入 60 μL 无血清基础培养基，后将 16 孔增殖板放入 RTCA 检测仪中，检查是否接触良好（在“Message”页面，显示 Connection OK），开始检测基线，检测后确定“Message”页面无警告报错信息；② 取出 16 孔增殖板，在超净工作台中以每孔 6 000 个细胞接种处于对数生长期的 HepG2 细胞混悬液 60 μL，室温放置 30 min，放入孵箱内的 RTCA 检测仪中，开始第二步检测增殖；③ 待细胞进入对数生长期后，于电脑软件上点击“abort current step”，放弃当前步骤，将板子取出。在每孔中加入不同浓度白藜芦醇并设置无药物的空白对照组。再次将加完药物的 16 孔板放回孵箱中。设定程序每 10 分钟进行 1 次阻抗值读数，48 h 后获得完整的细胞生长曲线。平行实验至少重复 3 次。
1.2.5 流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡
本研究 RTCA 结果提示，6.25 μmol/L 白藜芦醇对细胞的抑制作用与 0 μmol/L 比较差异不大，因此后续实验未设定该浓度，白藜芦醇浓度包括 0、12.5、25.0 及 50.0 μmol/L。收集 4 组处理 48 h 后的 HepG2 细胞于流式管中，用 PBS 重悬上述细胞，1 000 rpm/min 离心 5 min（离心半径为 13.5 cm）后弃上清液，再加入 300 μL 的 1×Binding Buffer 重悬细胞，添加 5 μL 的荧光素 APC 标记的 Annexin V（Annexin V-APC）和 7 氨基放线菌素（7-AAD）/核糖核酸酶（RNase）染液混匀后，室温避光孵育 15 min。将染好色后的细胞使用 NovoCyte 流式细胞仪进行凋亡细胞的检测。通过软件分析，绘制双色散点图，其中 APC 为横坐标，PE 为纵坐标。实验均重复 3 次，取均值。
1.2.6 Western blot 法检测 PI3K p85、磷酸化蛋白激酶 B（p-Akt）、总 Akt（t-Akt）和细胞周期素 A2（CyclinA2）蛋白的表达
收集 4 组处理 48 h 后的 HepG2 细胞，使用 RIPA 在冰上裂解细胞 30 min 后提取细胞总蛋白。以 BCA 试剂盒定量检测 4 组样本的蛋白浓度，然后取等量蛋白以 100 ℃ 变性 5 min。各取 20 μg 已经煮沸变性的蛋白样品上样，进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳。使用聚偏氟乙烯（PVDF）膜转膜，用含 5% 脱脂奶粉的 TBST 室温封闭超过 2 h，分别用 PI3K p85 抗体（1∶1 000）、p-Akt（phospho S473）抗体（1∶1 000）、t-Akt 抗体（1∶1 000）和 CyclinA2 抗体（1∶1 000）4 ℃ 冰箱孵育 PVDF 膜过夜。经过 TBST 洗涤 3 次后加入二抗，室温下于摇床上平摇1 h，用 TBST 漂洗 3 次 PVDF 膜后，暗室中使用显影液显影曝光。以细胞内 GAPDH 的含量作为内参，利用 ImageJ 软件对曝光后的 4 组目的蛋白条带进行光密度扫描定量。PI3K p85、t-Akt 和 CyclinA2 蛋白的相对表达水平为相应蛋白条带的光密度量比上对应内参蛋白 GAPDH 的光密度量。常规内参 GAPDH 检测只能排除体系误差，为明确 p-Akt 的表达变化是因上样量不同所致还是因白藜芦醇作用而致，在后续结果分析中进一步明确比较 p-Akt 蛋白的相对表达水平与 t-Akt 的相对表达水平的比值。每组细胞重复测量 3 次。
1.3 统计学方法
用 SPSS 23.0 统计软件进行分析。计量数据均采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用最小显著性差异法（LSD 法）。检验水准为 α=0.05。
2 结果
2.1 CCK8 法观察白藜芦醇对 HepG2 细胞活力的影响
如图 1a 所示，CCK8 实验结果显示，白藜芦醇对 HepG2 细胞的生长具有明显的抑制作用：相较于不加白藜芦醇的 0 μmol/L 组而言，随着浓度和时间的延长，各浓度组在不同时间点的 OD值均小于 0 μmol/L 组，表现出抑制效应；白藜芦醇作用 48 h 后，各个浓度对细胞的抑制效应均增大，且 50 μmol/L浓度下细胞的抑制效应最大。
图1
示 CCK8 法和 RTCA 系统检测各浓度白藜芦醇对 HepG2 细胞活力的影响、流式细胞仪检测细胞凋亡情况以及 Western blot 法检测各浓度白藜芦醇对 HepG2 细胞中 PI3K/Akt 信号及其下游 CyclinA2 蛋白的表达结果
a：CCK8 法检测的各浓度白藜芦醇对 HepG2 细胞活力的影响结果；b：RTCA 系统示踪曲线；c：RTCA 系统检测各浓度白藜芦醇对 HepG2 细胞活力的影响结果，与 0 μmol/L 和 6.25 μmol/L 比较，*
2.2 RTCA 系统观察各浓度白藜芦醇对 HepG2 细胞增殖的影响
通过 RTCA 系统检测加药后不同时间点不同浓度白藜芦醇处理组细胞的 NCI 值，结果显示，与 0 μmol/L 相比，白藜芦醇在浓度为 6.25 μmol/L 时对 HepG2 细胞 NCI 值的影响不大；但从浓度为 12.5 μmol/L 开始，HepG2 细胞的 NCI 值显著降低；且随着时间的延长，12.5、25.0 和 50.0 μmol/L 白藜芦醇组的 NCI 值逐渐降低（图 1b）。
处理 12、24、36 和 48 h 时，同时点 0 μmol/L 组和 6.25 μmol/L 组的 NCI 值比较差异均无统计学意义（P>0.05），但同时点 12.5、25.0 及 50.0 μmol/L 组与 0 μmol/L 组比较，NCI 值均降低，差异有统计学意义（P<0.05），见图 1c。
2.3 白藜芦醇可以诱导 HepG2 细胞凋亡
4 组细胞的流式细胞仪检测结果表明，白藜芦醇可以诱导 HepG2 细胞发生细胞凋亡，且具有剂量依赖性。通过与 0 μmol/L 浓度比较，发现不同浓度白藜芦醇可以诱导前肝癌细胞系 HepG2 的细胞凋亡，晚期凋亡细胞率由 0 μmol/L 处理组的 3.21% 上升到 50.0 μmol/L 白藜芦醇处理组的 20.64%，具体见图 1d–1g）。
2.4 白藜芦醇在肝癌细胞中抑制 PI3K p85/Akt 信号的表达
Western blot 结果显示，12.5、25.0 以及50.0 μmol/L 白藜芦醇可以显著降低 HepG2 细胞内 PI3K p85 蛋白的表达水平，与 0 μmol/L 白藜芦醇组比较差异均有统计学意义（P<0.05），且白藜芦醇的效应呈剂量依赖关系，即白藜芦醇的给药浓度越高越能降低 HepG2 细胞内 PI3K p85 的表达水平，3 个浓度组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。但白藜芦醇对 HepG2 细胞内 t-Akt 蛋白的表达水平无显著影响，4 组间比较差异无统计学意义（P>0.05），见图 1h 和图 1i。
此外，鉴于前述研究中观察到白藜芦醇对 HepG2 细胞内 t-Akt 蛋白的表达水平无显著影响，而 Akt 的磷酸化也能从侧面反映出 PI3K 信号通路的激活，故本研究进一步检测 p-Akt 的水平。常规内参 GAPDH 检测只能排除体系误差，为明确p-Akt 的表达变化是因上样量不同所致还是因白藜芦醇作用而致，在后续结果分析中明确比较 p-Akt 蛋白的相对表达水平与 t-Akt 蛋白的相对表达水平的比值。结果表明，与 0 μmol/L 白藜芦醇组比较，12.5、25.0 和 50.0 μmol/L 白藜芦醇组的 p-Akt 和p-Akt/t-Akt 比值均较低（P<0.05），见图 1i。该研究结果提示，白藜芦醇抑制的是 HepG2 细胞内 Akt 的第 473 位丝氨酸的磷酸化。
2.5 白藜芦醇在肝癌细胞中抑制 PI3K p85/Akt 下游 CyclinA2 蛋白的表达
Western blot 结果显示，与 0 μmol/L 比较，12.5、25.0 和 50.0 μmol/L 白藜芦醇可以显著降低HepG2 细胞内 CyclinA2 蛋白的表达水平（P<0.05），且呈剂量依赖关系，即白藜芦醇的给药浓度越高越能降低 HepG2 细胞内 CyclinA2 蛋白的表达水平（图 1j 和 1k）。
3 讨论
白藜芦醇的化学名称为 3,5,4´-三羟基苯二烯，主要存在于葡萄、藜芦、虎杖等植物中，是植物在恶劣环境下或遭到病原体侵害时自身分泌的一种抵御感染的多酚类抗菌素[9]。白藜芦醇作为一种天然的有多种生物学功能的植物化合物，具有降脂、抗氧化、抗癌、保护心脑血管、保肝、抗衰老、免疫调节、雌激素样作用等功能。随着研究的不断深入发展，其药理活性的研究逐渐得到关注，尤其在防治肿瘤、心血管疾病等方面显示出巨大的应用潜力，有望开发成为可防治多种疾病的新型药物，具有广泛的应用前景[10]。研究发现，白藜芦醇可以通过减少细胞凋亡、抑制脂质过氧化、抑制炎性细胞因子表达等，实现保护肝细胞、减轻肝损伤和促进肝功能恢复的目的[11-12]。离体或动物实验观察到，白藜芦醇对消化、血液、呼吸、生殖等多个系统来源的多种肿瘤细胞都有拮抗作用[13]。本实验在不同浓度白藜芦醇处理 HepG2 肝癌细胞的研究中观察到，白藜芦醇对 HepG2 细胞的生长具有明显的抑制作用，并且随着时间的延长和白藜芦醇浓度的增高，HepG2 细胞的活力越来越低。白藜芦醇作用 48 h 后，各个浓度对细胞的抑制效应逐渐增大，且 50.0 μmol/L 浓度下细胞的抑制效应最强。进一步的 RTCA 系统研究也发现，白藜芦醇对 HepG2 细胞的 NCI 值降低作用具有浓度依赖关系，即白藜芦醇浓度越高对 HepG2 细胞的 NCI 值降低作用越强，且该作用具有时间依赖效应。以上结果也证实了，高浓度的白藜芦醇可以抑制 HepG2 肝癌细胞的增殖，而白藜芦醇抑制 HepG2 肝癌细胞增殖的效应也具有时间和剂量依赖效应。
白藜芦醇抑制肿瘤细胞的生长，与其对细胞周期的调控相关[14]。白藜芦醇在肿瘤的发生和发展过程中都具有抗肿瘤功效。这主要依靠其抗氧化性和抗突变作用，诱导第二相药代酶产生（抗启动活性）；此外，它可以传递抗炎作用并有抑制环氧合酶（COX）和过氧代氢酶的功能（即抗促进作用）[15-16]。白藜芦醇通过诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、阻滞细胞周期、介导体液免疫应答、调节细胞因子分泌和拮抗肿瘤血管生成而影响肿瘤的发生发展[17]。Delmas 等[18]发现，白藜芦醇作用于肝癌小鼠模型后，可以抑制周期蛋白的产生，降低周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK）蛋白表达和活性，阻滞细胞周期，达到抑制肝癌细胞增殖的作用；上述作用存在时间和剂量的依赖性。有实验[18]表明，白藜芦醇在短时间内可以通过浓度依赖性作用阻断肿瘤的 DNA 合成，当作用时间延长后通过作用于细胞周期而起到阻滞肿瘤生长的作用；进一步实验证实，白藜芦醇可以通过减慢细胞周期循环速度或阻滞某一特定时相从而发挥其作用，这种作用与其浓度有关。经白藜芦醇处理过的细胞不仅仅有相应的细胞周期改变，并伴有细胞核增大。Bishayee 等[19]对二乙亚硝胺诱导的动物肝癌的实验研究发现，白藜芦醇诱导肿瘤细胞凋亡的途径之一可能是上调 Nrf2 核转录因子介导的蛋白及 mRNA 的表达，从而起促进肝癌细胞凋亡的作用[20]。
白藜芦醇可通过多条途径发挥抗肿瘤作用，其中 PI3K 信号转导通路成为近年来的研究热点[21-22]。在培养的小鼠 JB6 表皮细胞中，白藜芦醇及其衍生物通过阻断表皮生长因子介导的 PI3K/Akt 的活性而抑制肿瘤细胞的转化[23-24]。在人类乳腺癌细胞中，白藜芦醇通过影响与雌激素受体 α 相关的 PI3K 信号通路，从而阻断细胞的生存和增殖[25-26]。笔者在本研究中观察到，白藜芦醇可以显著降低 HepG2 细胞内 PI3K p85 的表达水平，且呈剂量依赖关系，即白藜芦醇的给药浓度越高越能下调 HepG2 细胞内 PI3K p85 的表达。虽然白藜芦醇对 HepG2 细胞内 t-Akt 的表达水平无显著影响，但白藜芦醇可以显著降低 HepG2 细胞内 p-Akt 的表达水平，且白藜芦醇降低的是 HepG2 细胞内 Akt 的第 473 位丝氨酸的磷酸化。此外，本研究结果还显示，白藜芦醇可以显著降低 HepG2 细胞内 PI3K p85/Akt 信号通路下游 CyclinA2 蛋白的表达水平，且呈剂量依赖关系，即白藜芦醇的给药浓度越高越能降低 HepG2 细胞内 CyclinA2 蛋白的表达水平。因此，结合前人研究与本实验的观察发现，笔者认为，白藜芦醇可能通过 PI3K p85/Akt 信号轴来达到抗肝癌细胞增殖的作用，这为 HCC 的药物治疗提供了新的思路。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：周柯均撰写文章和参与实验；王城负责实验质控；谢梦忆参与数据分析、整理及汇总；侯永川、熊云麟、刘瑜和邓琳参与实验。
