引用本文： 龚辰, 王海清, 冯燮林, 刘爱祥, 张丽霞, 李磊, 薄文滔, 胡勇, 张明仪, 张辉, 田浪, 唐小丽. TERT 启动子突变及其 mRNA 表达对肝细胞癌患者根治术后预后的影响. 中国普外基础与临床杂志, 2020, 27(8): 950-958. doi: 10.7507/1007-9424.201911030 复制
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一[1]，也是我国 60 岁之前男性因癌致死的主要原因[2]。近年来随着肝癌的早期诊断技术和手术技术的不断提高，使得 HCC 肝切除患者的长期生存率显著提高，但肝癌患者术后的 1 年复发率可达 25%，5 年复发率超过 60%[3]，因而肝癌患者的术后生存情况仍不乐观。近年研究[4]发现，端粒酶是控制细胞分化增殖的重要调控因子，端粒酶异常激活，细胞就有可能出现无序增殖进而引发癌变，而端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）是端粒酶的核心组成部分，是端粒酶活性的限速酶，对端粒酶的活性起关键作用。TERT 通常在自我更新的细胞（如干细胞）中表达活跃，而在成体细胞中少有表达，但在各类实体癌细胞中 TERT 也被发现广泛表达[5]，究其原因可能是 TERT 启动子的突变诱发了 TERT 的高表达，进而引发肿瘤。有研究[6]表明，在肝细胞癌中 TERT 启动子的突变率可高达 59%。本研究的目的就是通过分析 HCC 患者的 TERT 启动子突变情况和 TERT mRNA 表达水平与患者临床病理学特征的关系，探讨 TERT 启动子突变是否影响肝癌患者术后的预后。
1 资料和方法
1.1 研究对象
本研究回顾性收集了 2009 年 1 月至 2016 年1 月期间在电子科技大学附属肿瘤医院进行 HCC 根治性切除术患者的病例资料，总共纳入了 212 例患者进行研究。患者的纳入和排除标准如下：① 病理学检查证实的 HCC 患者；② 纳入的患者必须同时有病理证实的肝硬变（Ishak 评分≥5）；③ 纳入的患者必须为初次行肝癌根治性切除术的患者，排除复发后再次手术者；④ 纳入的患者必须为根治性肝切除（判断标准：肝癌患者无远处转移，无门静脉主干、肝静脉以及其他大血管侵犯；完全切除肿瘤；病理学检查证实切缘无肝癌细胞残留）。排除标准：① 远处转移、淋巴结转移以及侵犯大血管（门静脉主干、肝静脉以及其他大血管）的患者；② 接受射频消融及无水乙醇治疗的患者；③ 无完整冰冻组织病理学检查结果或无法随访的患者。212 例患者中，男 167 例（78.8%），女 45 例（21.2%）；年龄 27～75 岁、（53±11）岁；病因：HBV 感染 187 例 [占 88.2%，其中乙肝病毒载量（HBV-DNA）>1 000 copies/mL 60 例]，HCV 感染4 例（1.9%）；Child-Pugh 分级：A 级 199 例（93.9%），B 级 13 例（6.1%）；巴塞罗那分期（BCLC 分期）：0 期 13 例（6.1%），A 期 145 例（68.4%），B 期 42 例（19.8%），C 期 12 例（5.7%）；分化程度：高分化 3 例（1.4%），中分化 183 例（86.3%），低分化 26 例（12.3%）；单发 166 例（78.3%），多发 46 例（21.7%）；解剖性肝切除 97 例（45.8%）。
1.2 患者管理及随访
所有患者均由同一手术团队进行管理，并在术前进行了全面的体格检查和常规实验室检查。患者术后每 3 个月进行 1 次随访以监测 HCC 的复发和转移。随访包括超声检查、计算机断层扫描或磁共振成像及甲胎蛋白（AFP）检测。本组患者的末次随访时间是 2018 年 3 月 31 日。总生存时间（overall survival，OS）为手术日期至死亡日期或末次随访日期，无瘤生存时间（disease-free survival，DFS）为手术日期至肿瘤复发日期或末次随访日期。所有患者均获访，随访时间 1～63 个月，中位数为 20 个月。截至随访结束，有 56 例患者存活，97 例患者未复发。
1.3 主要试剂及仪器
主要试剂：组织 DNA 提取试剂盒（德国 QIAGEN 公司）、多重 PCR 试剂盒（德国 QIAGEN 公司）、RNA 提取试剂（北京百泰克公司）、第一链 cDNA 合成试剂盒（上海赛默飞世尔科技公司）和荧光定量 PCR 试剂盒（德国 QIAGEN 公司）；主要仪器：DU-730 紫外/可见分光光度计（美国 BECKMAN 公司）、荧光定量 PCR 仪（美国 ABI 公司）和高速冷冻离心机（美国 Sigma 公司）。
1.4 TERT、肿瘤蛋白 p53（TP53）和 β-连环蛋白（CTNNB1）基因突变检测
所有肿瘤冰冻标本均由电子科技大学附属肿瘤医院病理科收集，患者术后取肿瘤组织进行快速冰冻保存，其后进行突变检测。① DNA 提取：使用组织 DNA 提取试剂盒，DNA 提取后保存于–20 ℃备用。② PCR 扩增：使用多重 PCR 试剂盒，扩增引物见表 1。TP53 和 CTNNB1 基因的扩增循环条件：95 ℃ 初始热活化，94 ℃ 变性，于 65 ℃ 和 50 ℃ 中退火，72 ℃ 延期，循环 25～40 个循环，最后在 60 ℃ 中扩展；TERT 基因的扩增循环条件：95 ℃ 初始热活化，94 ℃ 变性，60 ℃ 退火，72 ℃ 延期，循环 35 个循环，最后在 60 ℃ 中扩展。③ 突变检测：检测 DNA 浓度（≥20 ng/µL）和纯度（A260/A280在 1.6～1.8 之间，A 为吸光度值）合格后，用 Sanger 测序法检测 TERT、TP53 以及 CTNNB1 基因突变。
表1
待检测突变基因的扩增引物
1.5 TERT mRNA 的表达检测
TERT mRNA 的表达检测步骤为：① RNA 提取，使用北京百泰克公司试剂，提取后使用 DU-730 紫外可见分光光度计检测提取液的浓度及纯度，浓度≥100 ng/µL 和纯度 A260/A280>1.9 为合格；② RNA 逆转录，使用 Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis kit 进行逆转录；③ TERT mRNA 的表达水平检测，试剂盒使用 Quanti NovaTM SYNR® Green PCR Kit，用 SYBR 法定量 PCR 检测 TERT mRNA 的表达水平。操作均按试剂盒说明书进行。
1.6 统计学方法
所有统计分析均使用 SPSS 17.0 版统计软件进行分析。患者的计数资料采用均数±标准差（
±s）或中位数（范围）表示；服从正态分布计量资料的统计方法采用成组 t 检验，否则使用 Mann-Whitney U 或 Kruskal-Wallis H 检验。计数资料以例数（百分比）表示，并使用成组 χ2 检验或 Fisher 精确检验进行组间比较（非等级资料），等级资料采用秩和检验。非侵入性指标的诊断价值用接受者操作特征曲线（ROC）分析，最佳临界值用 ROC 曲线下面积（AUC）来评估，最大灵敏度和特异度之和与 1 的差值，即为 Youden 指数[7]。累积总体生存率和无瘤生存率使用 Kaplan-Meier 方法计算，并通过对数秩检验进行统计学分析；Cox 比例风险模型用于 OS 和 DFS 的单因素和多因素分析。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 TERT 启动子突变与患者临床病理学特征的关系
通过对 212 例 HCC 患者的基因 PCR 产物进行测序分析，结果显示（图 1），3 种基因突变均有出现，其中 TERT 启动子的突变率为 17.9%（38/212），TP53 基因的突变率为 40.1%（85/212），CTNNB1 基因的突变率为 13.7%（29/212）。TERT 启动子突变与患者临床病理学特征关系的分析结果表明，TERT 启动子突变组和 TERT 启动子未突变组的 Child-Pugh 分级（P=0.015）和术前白蛋白水平（P=0.038）不同，差异均有统计学意义；但 TERT 启动子突变与 TERT mRNA 的表达水平、TP53 基因突变和 CTNNB1 基因突变均无关（P>0.05）；与肝癌患者的其他临床病理学特征无关（P>0.05），包括性别、年龄、HBV 感染、HBV-DNA 载量、HCV 感染、术前 APF 水平，术前 AST 水平、术前 ALT 水平、术前血小板计数、肝切除体积、BCLC 分期、分化程度、术中出血量、输血情况、微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）、肿瘤数量、手术方式、并发症和肿瘤直径（表 2）。
图1
示 TERT 启动子、TP53 基因和 CTNNB1 基因 PCR 产物的测序分析结果
a：TERT 启动子突变位点为距 ATG 翻译起始位点上游 –124 位的 G>A 突变；b：TP53 基因的突变形式为 G>C 突变；c：CTNNB1 基因的突变形式为 T>C 突变；黑箭指示突变的具体位点
表2
TERT 启动子突变及 TERT mRNA 表达与患者临床病理学特征的关系
2.2 TERT mRNA 表达水平与患者临床病理学特征的关系
本组患者的 TERT mRNA 表达水平值的中位数为 0.007 812 5（范围为 0.000 006 9～0.500 000 0），通过 ROC 曲线分析 TERT mRNA 表达水平预测肿瘤复发的最佳临界值为 0.010 8（AUC=0.599，P=0.013，灵敏度=0.412，特异度=0.904，Youden 指数=0.316），据此将 TERT mRNA 表达分为高表达和低表达 2 组。分析结果表明，TERT mRNA 的表达与 HBV 感染（P=0.046）、Child-Pugh 分级（P=0.003）、术前 AST 水平（P=0.002）和 ALT 水平（P=0.008）相关；而与其他临床病理学特征无关（P>0.05），包括性别、年龄、HBV-DNA 载量、HCV 感染、术前 APF 水平、术前白蛋白水平、术前血小板计数、肝切除体积、BCLC 分期、分化程度、术中输血量、输血情况、MVI、肿瘤数量、手术方式、并发症、肿瘤直径、TP53 基因突变及 CTNNB1 基因突变（表 2）。
2.3 OS 影响因素的单因素和多因素分析
单因素分析结果表明：非解剖性肝切除、肿瘤直径>5 cm 和 TERT mRNA 高表达是影响 OS 的因素（表 3）。根据专业知识和单因素分析结果，将患者性别、年龄、HBV 感染、Child-Pugh 分级、BCLC 分期、MVI、肝癌分化程度、术前 AFP 水平、术前 AST 水平、术前 ALT 水平、术前白蛋白水平、术前血小板计数、手术方式、肝切除体积、肿瘤直径、并发症、TP53 基因突变、CTNNB1 基因突变、TERT 启动子突变及 TERT mRNA 表达纳入 Cox 风险比例回归模型分析，结果表明：非解剖性肝切除 ［HR=2.22，95%CI 为（1.28，3.85）］、肿瘤直径>5 cm ［HR=2.06，95%CI 为（1.19，3.55）］ 和 TERT mRNA 高表达 ［HR=5.74，95%CI 为（3.20，10.30）］ 仍是影响 OS 的独立危险因素（图 2 和表 4）。
图2
示不同 TERT 启动子突变及 TERT mRNA 表达情况患者的 OS 和 DFS 曲线
a：TERT 启动子突变与未突变患者的 OS 曲线；b：TERT 启动子突变与未突变患者的 DFS 曲线；c：TERT mRNA 高表达与低表达患者的 OS 曲线；d：TERT mRNA 高表达与低表达患者的 DFS 曲线
表3
OS 和 DFS 影响因素的单因素分析结果
表4
OS 和 DFS 影响因素的多因素分析结果
2.4 DFS 影响因素的单因素和多因素分析
单因素分析结果表明：术前血小板计数>100×109/L、术前 AST 水平>40 U/mL、肿瘤直径>5 cm 和 TERT mRNA 高表达是影响 DFS 的影响因素（表 3）。根据专业知识和单因素分析结果，将患者性别、年龄、HBV 感染、Child-Pugh 分级、BCLC 分期、MVI、肝癌分化程度、术前 AFP 水平、术前 AST 水平、术前 ALT 水平、术前白蛋白水平、术前血小板计数、手术方式、肝切除体积、肿瘤直径、并发症、TP53 基因突变、CTNNB1 基因突变、TERT 启动子突变以及 TERT mRNA 表达纳入 Cox 比例风险回归模型，结果表明：血小板计数>100×109/L ［HR=0.62，95%CI 为（0.41，0.94）］ 是 DFS 的保护因素，肿瘤直径>5 cm ［HR=1.91，95%CI 为（1.26，2.90）］ 和 TERT mRNA 高表达 ［HR=1.79，95%CI 为（1.14，2.83）］ 是影响 DFS 的危险因素（表 4和图 2）。
3 讨论
近年来 TERT 和肿瘤的相关性已经被越来越多的人认识到，但其在肿瘤中的表达和作用机制还不是太明确。有研究[9]表明，TERT 启动子、TP53 基因及 CTNNB1 基因突变在肿瘤早期普遍存在（发生率>85%），而其中 TERT 启动子突变和拷贝数变化才是影响癌症发生的核心。对于感染了 HBV 的汉族 HCC 患者，TERT 启动子突变是他们的常见体细胞突变，在 AFP 水平低的人群中检测 TERT 启动子突变可能有助于诊断非典型肝癌[10-11]。因此，本研究着眼于 TERT 基因和表达两方面，分析了 TERT 启动子突变和 TERT mRNA 表达与肝癌患者临床病理学特征的关系，结果发现，TERT 启动子突变并不影响 TERT mRNA 的表达以及其他常见基因的突变，TERT 启动子突变与患者的临床预后的联系也并不紧密，而 TERT mRNA 的表达水平却与患者的临床预后有相关性，这可能是我们以后评估抗肿瘤治疗和肿瘤复发有价值的标志物。
在本研究中，首先对 HCC 患者的肿瘤切除组织进行了基因测序，结果 TERT 启动子的突变率为 17.9%，与其他学者[9]研究所示的癌症患者中 TERT 启动子突变率（10.5%）接近。国外的研究[12]报道，亚洲 HCC 患者的 TERT 启动子突变率约为 42.5%，本研究的突变率与之相比偏低，产生这种差异的原因可能如下。① 与我国的 HBV 高感染率有关。有研究[13-14]表明，HBV 可以整合到 TERT 启动子序列中，HBV-DNA 在 TERT 启动子序列中的插入可能是降低 TERT 启动子突变率的原因之一。② 与饮食习惯有关。有研究[15-16]表明，TERT 启动子的突变与乙醇、黄曲霉毒素 B1（AFB1）等化学因素的刺激也密切相关。近年来健康饮食的倡导，使人们摄入乙醇和 AFB1 减少，可能导致 TERT 启动子突变率降低。本研究通过统计分析还发现，TERT 启动子突变仅与患者的 Child-Pugh 分级和术前白蛋白值相关，说明 TERT 突变与患者的肝功能相关，TERT 启动子突变患者的肝功能更差。这可能与“双击”理论有关，即 TERT 诱导癌症发生需要 2 次刺激：第 1 次 TERT 启动子发生突变，第 2 次端粒酶活性和端粒的稳定性继发性急剧改变[17]。而且有研究[18]显示，TERT 扩增和 TERT 启动子中插入 HBV 病毒是解释端粒酶激活的另一种机制。综上，TERT 启动子突变与肝功能相关，而与肝癌发生不直接相关。
通过检测和统计学分析可知，TERT mRNA 表达水平与 HCC 患者预后的关系为：TERT mRNA 的表达与 HBV 感染、Child-Pugh 分级、术前 AST 值和 ALT 值相关，且影响患者的 OS 和 DFS。有研究[19-20]指出，外周血中人类端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，h-TERT）mRNA 是否表达是影响患者生存时间的因素之一，其表达水平的高低与肿瘤直径有关，并可以用于评估肿瘤复发和治疗情况，其灵敏度似乎比 AFP mRNA 更高。而在实体癌组织中，目前只发现成人神经胶质瘤中 TERT 启动子突变与 TERT mRNA 表达上调和端粒酶活性高度相关[21]，而肝癌组织中的 TERT 启动子突变与 TERT 表达之间并不完全统一，它们之间还存在着多种可能机制（如甲基化）相互影响，但肝癌组织中 TERT mRNA 的表达水平与肝癌患者的肿瘤生长情况和生存率是明确相关的[22-23]。这些都和本研究结果相符，究其原因，这可能是由于 TERT mRNA 高表达能影响端粒酶活性，使细胞永生化进而发生癌变[4]，促进肿瘤复发和缩短患者生存期。其次，端粒酶异常激活将导致肝星状细胞活性增强[24]，肝星状细胞的活化将使肝炎进一步向肝结节和肝纤维化发展，影响肝功能，引发肝损害，降低肝脏的免疫能力。而对于 HBV 感染的 HCC 患者来说，肝脏免疫能力降低引起的高 HBV DNA 拷贝是影响其 OS 和 DFS 的独立危险因素[25]。以上结果说明，TERT mRNA 表达水平的高低可能才是我们应该关注的肝癌预后的特征因子。
本研究分析结果表明，影响患者 OS 的因素有非解剖性肝切除、肿瘤直径>5 cm 及 TERT mRNA 高表达，影响患者 DFS 的因素有术前血小板计数>100×109/L、肿瘤直径>5 cm 及 TERT mRNA 高表达。肝癌的肿瘤直径是多种肝癌分期系统的主要考虑因素，肿瘤直径越大越易诱发肿瘤血管侵犯和多发。已有研究[8]表明，肿瘤直径>5 cm 的患者行肝癌手术后 5 年生存率低于肿瘤直径≤5 cm 的患者，所以肿瘤直径应是影响患者 OS 与 DSF 的因素之一。有研究[26]显示，非解剖性肝切除会影响术中出血、输血及肿瘤受压迫的情况，这些将直接影响患者的术后恢复及并发症的发生，间接影响患者的机体免疫能力，而机体免疫力的高低是影响术后感染和肿瘤复发的关键因素之一[27]，所以非解剖性肝切除与患者的 OS 密切相关。此外，血小板在肝脏病变中发挥着重要的作用，血小板的缺乏会增大患者的出血风险，而且还会影响肝脏的再生。有研究[28]表明，血小板数量的降低可能会影响肝脏的重要代谢途径，促进肝功能不全。同时血小板影响血管内皮生成，在肝癌的炎症反应中起关键作用，有助于维持肝癌炎症微环境和毛细血管生成，影响肝癌的预后[29-30]。
综上，本研究结果表明，TERT 启动子突变存在于 HCC 患者当中，但它只与患者的肝功能相关，并不能成为预测 HCC 术后患者预后的指标，也不影响患者的 OS 和 DFS；TERT mRNA 表达水平的高低是影响 HCC 患者术后预后的指标，它与患者的 OS 与 DFS 相关，TERT mRNA 可能是 HCC 预后的标志物。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：龚辰、王海清和冯燮林负责临床研究方案设计；冯燮林、王海清、刘爱祥、张丽霞、李磊、薄文滔、胡勇、张明仪、张辉、田浪和唐小丽参与临床数据收集、整理与分析；王海清和龚辰负责基因突变和 TERT mRNA 表达检查及数据收集；冯燮林、张明仪、张丽霞、唐小丽、王海清和龚辰参与对最终结果的讨论与分析。
伦理声明：本研究已通过电子科技大学附属肿瘤医院伦理审查委员会的伦理审核批准。
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一[1]，也是我国 60 岁之前男性因癌致死的主要原因[2]。近年来随着肝癌的早期诊断技术和手术技术的不断提高，使得 HCC 肝切除患者的长期生存率显著提高，但肝癌患者术后的 1 年复发率可达 25%，5 年复发率超过 60%[3]，因而肝癌患者的术后生存情况仍不乐观。近年研究[4]发现，端粒酶是控制细胞分化增殖的重要调控因子，端粒酶异常激活，细胞就有可能出现无序增殖进而引发癌变，而端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）是端粒酶的核心组成部分，是端粒酶活性的限速酶，对端粒酶的活性起关键作用。TERT 通常在自我更新的细胞（如干细胞）中表达活跃，而在成体细胞中少有表达，但在各类实体癌细胞中 TERT 也被发现广泛表达[5]，究其原因可能是 TERT 启动子的突变诱发了 TERT 的高表达，进而引发肿瘤。有研究[6]表明，在肝细胞癌中 TERT 启动子的突变率可高达 59%。本研究的目的就是通过分析 HCC 患者的 TERT 启动子突变情况和 TERT mRNA 表达水平与患者临床病理学特征的关系，探讨 TERT 启动子突变是否影响肝癌患者术后的预后。
1 资料和方法
1.1 研究对象
本研究回顾性收集了 2009 年 1 月至 2016 年1 月期间在电子科技大学附属肿瘤医院进行 HCC 根治性切除术患者的病例资料，总共纳入了 212 例患者进行研究。患者的纳入和排除标准如下：① 病理学检查证实的 HCC 患者；② 纳入的患者必须同时有病理证实的肝硬变（Ishak 评分≥5）；③ 纳入的患者必须为初次行肝癌根治性切除术的患者，排除复发后再次手术者；④ 纳入的患者必须为根治性肝切除（判断标准：肝癌患者无远处转移，无门静脉主干、肝静脉以及其他大血管侵犯；完全切除肿瘤；病理学检查证实切缘无肝癌细胞残留）。排除标准：① 远处转移、淋巴结转移以及侵犯大血管（门静脉主干、肝静脉以及其他大血管）的患者；② 接受射频消融及无水乙醇治疗的患者；③ 无完整冰冻组织病理学检查结果或无法随访的患者。212 例患者中，男 167 例（78.8%），女 45 例（21.2%）；年龄 27～75 岁、（53±11）岁；病因：HBV 感染 187 例 [占 88.2%，其中乙肝病毒载量（HBV-DNA）>1 000 copies/mL 60 例]，HCV 感染4 例（1.9%）；Child-Pugh 分级：A 级 199 例（93.9%），B 级 13 例（6.1%）；巴塞罗那分期（BCLC 分期）：0 期 13 例（6.1%），A 期 145 例（68.4%），B 期 42 例（19.8%），C 期 12 例（5.7%）；分化程度：高分化 3 例（1.4%），中分化 183 例（86.3%），低分化 26 例（12.3%）；单发 166 例（78.3%），多发 46 例（21.7%）；解剖性肝切除 97 例（45.8%）。
1.2 患者管理及随访
所有患者均由同一手术团队进行管理，并在术前进行了全面的体格检查和常规实验室检查。患者术后每 3 个月进行 1 次随访以监测 HCC 的复发和转移。随访包括超声检查、计算机断层扫描或磁共振成像及甲胎蛋白（AFP）检测。本组患者的末次随访时间是 2018 年 3 月 31 日。总生存时间（overall survival，OS）为手术日期至死亡日期或末次随访日期，无瘤生存时间（disease-free survival，DFS）为手术日期至肿瘤复发日期或末次随访日期。所有患者均获访，随访时间 1～63 个月，中位数为 20 个月。截至随访结束，有 56 例患者存活，97 例患者未复发。
1.3 主要试剂及仪器
主要试剂：组织 DNA 提取试剂盒（德国 QIAGEN 公司）、多重 PCR 试剂盒（德国 QIAGEN 公司）、RNA 提取试剂（北京百泰克公司）、第一链 cDNA 合成试剂盒（上海赛默飞世尔科技公司）和荧光定量 PCR 试剂盒（德国 QIAGEN 公司）；主要仪器：DU-730 紫外/可见分光光度计（美国 BECKMAN 公司）、荧光定量 PCR 仪（美国 ABI 公司）和高速冷冻离心机（美国 Sigma 公司）。
1.4 TERT、肿瘤蛋白 p53（TP53）和 β-连环蛋白（CTNNB1）基因突变检测
所有肿瘤冰冻标本均由电子科技大学附属肿瘤医院病理科收集，患者术后取肿瘤组织进行快速冰冻保存，其后进行突变检测。① DNA 提取：使用组织 DNA 提取试剂盒，DNA 提取后保存于–20 ℃备用。② PCR 扩增：使用多重 PCR 试剂盒，扩增引物见表 1。TP53 和 CTNNB1 基因的扩增循环条件：95 ℃ 初始热活化，94 ℃ 变性，于 65 ℃ 和 50 ℃ 中退火，72 ℃ 延期，循环 25～40 个循环，最后在 60 ℃ 中扩展；TERT 基因的扩增循环条件：95 ℃ 初始热活化，94 ℃ 变性，60 ℃ 退火，72 ℃ 延期，循环 35 个循环，最后在 60 ℃ 中扩展。③ 突变检测：检测 DNA 浓度（≥20 ng/µL）和纯度（A260/A280在 1.6～1.8 之间，A 为吸光度值）合格后，用 Sanger 测序法检测 TERT、TP53 以及 CTNNB1 基因突变。
表1
待检测突变基因的扩增引物
1.5 TERT mRNA 的表达检测
TERT mRNA 的表达检测步骤为：① RNA 提取，使用北京百泰克公司试剂，提取后使用 DU-730 紫外可见分光光度计检测提取液的浓度及纯度，浓度≥100 ng/µL 和纯度 A260/A280>1.9 为合格；② RNA 逆转录，使用 Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis kit 进行逆转录；③ TERT mRNA 的表达水平检测，试剂盒使用 Quanti NovaTM SYNR® Green PCR Kit，用 SYBR 法定量 PCR 检测 TERT mRNA 的表达水平。操作均按试剂盒说明书进行。
1.6 统计学方法
所有统计分析均使用 SPSS 17.0 版统计软件进行分析。患者的计数资料采用均数±标准差（±s）或中位数（范围）表示；服从正态分布计量资料的统计方法采用成组 t 检验，否则使用 Mann-Whitney U 或 Kruskal-Wallis H 检验。计数资料以例数（百分比）表示，并使用成组 χ2 检验或 Fisher 精确检验进行组间比较（非等级资料），等级资料采用秩和检验。非侵入性指标的诊断价值用接受者操作特征曲线（ROC）分析，最佳临界值用 ROC 曲线下面积（AUC）来评估，最大灵敏度和特异度之和与 1 的差值，即为 Youden 指数[7]。累积总体生存率和无瘤生存率使用 Kaplan-Meier 方法计算，并通过对数秩检验进行统计学分析；Cox 比例风险模型用于 OS 和 DFS 的单因素和多因素分析。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 TERT 启动子突变与患者临床病理学特征的关系
通过对 212 例 HCC 患者的基因 PCR 产物进行测序分析，结果显示（图 1），3 种基因突变均有出现，其中 TERT 启动子的突变率为 17.9%（38/212），TP53 基因的突变率为 40.1%（85/212），CTNNB1 基因的突变率为 13.7%（29/212）。TERT 启动子突变与患者临床病理学特征关系的分析结果表明，TERT 启动子突变组和 TERT 启动子未突变组的 Child-Pugh 分级（P=0.015）和术前白蛋白水平（P=0.038）不同，差异均有统计学意义；但 TERT 启动子突变与 TERT mRNA 的表达水平、TP53 基因突变和 CTNNB1 基因突变均无关（P>0.05）；与肝癌患者的其他临床病理学特征无关（P>0.05），包括性别、年龄、HBV 感染、HBV-DNA 载量、HCV 感染、术前 APF 水平，术前 AST 水平、术前 ALT 水平、术前血小板计数、肝切除体积、BCLC 分期、分化程度、术中出血量、输血情况、微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）、肿瘤数量、手术方式、并发症和肿瘤直径（表 2）。
图1
示 TERT 启动子、TP53 基因和 CTNNB1 基因 PCR 产物的测序分析结果
a：TERT 启动子突变位点为距 ATG 翻译起始位点上游 –124 位的 G>A 突变；b：TP53 基因的突变形式为 G>C 突变；c：CTNNB1 基因的突变形式为 T>C 突变；黑箭指示突变的具体位点
表2
TERT 启动子突变及 TERT mRNA 表达与患者临床病理学特征的关系
2.2 TERT mRNA 表达水平与患者临床病理学特征的关系
本组患者的 TERT mRNA 表达水平值的中位数为 0.007 812 5（范围为 0.000 006 9～0.500 000 0），通过 ROC 曲线分析 TERT mRNA 表达水平预测肿瘤复发的最佳临界值为 0.010 8（AUC=0.599，P=0.013，灵敏度=0.412，特异度=0.904，Youden 指数=0.316），据此将 TERT mRNA 表达分为高表达和低表达 2 组。分析结果表明，TERT mRNA 的表达与 HBV 感染（P=0.046）、Child-Pugh 分级（P=0.003）、术前 AST 水平（P=0.002）和 ALT 水平（P=0.008）相关；而与其他临床病理学特征无关（P>0.05），包括性别、年龄、HBV-DNA 载量、HCV 感染、术前 APF 水平、术前白蛋白水平、术前血小板计数、肝切除体积、BCLC 分期、分化程度、术中输血量、输血情况、MVI、肿瘤数量、手术方式、并发症、肿瘤直径、TP53 基因突变及 CTNNB1 基因突变（表 2）。
2.3 OS 影响因素的单因素和多因素分析
单因素分析结果表明：非解剖性肝切除、肿瘤直径>5 cm 和 TERT mRNA 高表达是影响 OS 的因素（表 3）。根据专业知识和单因素分析结果，将患者性别、年龄、HBV 感染、Child-Pugh 分级、BCLC 分期、MVI、肝癌分化程度、术前 AFP 水平、术前 AST 水平、术前 ALT 水平、术前白蛋白水平、术前血小板计数、手术方式、肝切除体积、肿瘤直径、并发症、TP53 基因突变、CTNNB1 基因突变、TERT 启动子突变及 TERT mRNA 表达纳入 Cox 风险比例回归模型分析，结果表明：非解剖性肝切除 ［HR=2.22，95%CI 为（1.28，3.85）］、肿瘤直径>5 cm ［HR=2.06，95%CI 为（1.19，3.55）］ 和 TERT mRNA 高表达 ［HR=5.74，95%CI 为（3.20，10.30）］ 仍是影响 OS 的独立危险因素（图 2 和表 4）。
图2
示不同 TERT 启动子突变及 TERT mRNA 表达情况患者的 OS 和 DFS 曲线
a：TERT 启动子突变与未突变患者的 OS 曲线；b：TERT 启动子突变与未突变患者的 DFS 曲线；c：TERT mRNA 高表达与低表达患者的 OS 曲线；d：TERT mRNA 高表达与低表达患者的 DFS 曲线
表3
OS 和 DFS 影响因素的单因素分析结果
表4
OS 和 DFS 影响因素的多因素分析结果
2.4 DFS 影响因素的单因素和多因素分析
单因素分析结果表明：术前血小板计数>100×109/L、术前 AST 水平>40 U/mL、肿瘤直径>5 cm 和 TERT mRNA 高表达是影响 DFS 的影响因素（表 3）。根据专业知识和单因素分析结果，将患者性别、年龄、HBV 感染、Child-Pugh 分级、BCLC 分期、MVI、肝癌分化程度、术前 AFP 水平、术前 AST 水平、术前 ALT 水平、术前白蛋白水平、术前血小板计数、手术方式、肝切除体积、肿瘤直径、并发症、TP53 基因突变、CTNNB1 基因突变、TERT 启动子突变以及 TERT mRNA 表达纳入 Cox 比例风险回归模型，结果表明：血小板计数>100×109/L ［HR=0.62，95%CI 为（0.41，0.94）］ 是 DFS 的保护因素，肿瘤直径>5 cm ［HR=1.91，95%CI 为（1.26，2.90）］ 和 TERT mRNA 高表达 ［HR=1.79，95%CI 为（1.14，2.83）］ 是影响 DFS 的危险因素（表 4和图 2）。
3 讨论
近年来 TERT 和肿瘤的相关性已经被越来越多的人认识到，但其在肿瘤中的表达和作用机制还不是太明确。有研究[9]表明，TERT 启动子、TP53 基因及 CTNNB1 基因突变在肿瘤早期普遍存在（发生率>85%），而其中 TERT 启动子突变和拷贝数变化才是影响癌症发生的核心。对于感染了 HBV 的汉族 HCC 患者，TERT 启动子突变是他们的常见体细胞突变，在 AFP 水平低的人群中检测 TERT 启动子突变可能有助于诊断非典型肝癌[10-11]。因此，本研究着眼于 TERT 基因和表达两方面，分析了 TERT 启动子突变和 TERT mRNA 表达与肝癌患者临床病理学特征的关系，结果发现，TERT 启动子突变并不影响 TERT mRNA 的表达以及其他常见基因的突变，TERT 启动子突变与患者的临床预后的联系也并不紧密，而 TERT mRNA 的表达水平却与患者的临床预后有相关性，这可能是我们以后评估抗肿瘤治疗和肿瘤复发有价值的标志物。
在本研究中，首先对 HCC 患者的肿瘤切除组织进行了基因测序，结果 TERT 启动子的突变率为 17.9%，与其他学者[9]研究所示的癌症患者中 TERT 启动子突变率（10.5%）接近。国外的研究[12]报道，亚洲 HCC 患者的 TERT 启动子突变率约为 42.5%，本研究的突变率与之相比偏低，产生这种差异的原因可能如下。① 与我国的 HBV 高感染率有关。有研究[13-14]表明，HBV 可以整合到 TERT 启动子序列中，HBV-DNA 在 TERT 启动子序列中的插入可能是降低 TERT 启动子突变率的原因之一。② 与饮食习惯有关。有研究[15-16]表明，TERT 启动子的突变与乙醇、黄曲霉毒素 B1（AFB1）等化学因素的刺激也密切相关。近年来健康饮食的倡导，使人们摄入乙醇和 AFB1 减少，可能导致 TERT 启动子突变率降低。本研究通过统计分析还发现，TERT 启动子突变仅与患者的 Child-Pugh 分级和术前白蛋白值相关，说明 TERT 突变与患者的肝功能相关，TERT 启动子突变患者的肝功能更差。这可能与“双击”理论有关，即 TERT 诱导癌症发生需要 2 次刺激：第 1 次 TERT 启动子发生突变，第 2 次端粒酶活性和端粒的稳定性继发性急剧改变[17]。而且有研究[18]显示，TERT 扩增和 TERT 启动子中插入 HBV 病毒是解释端粒酶激活的另一种机制。综上，TERT 启动子突变与肝功能相关，而与肝癌发生不直接相关。
通过检测和统计学分析可知，TERT mRNA 表达水平与 HCC 患者预后的关系为：TERT mRNA 的表达与 HBV 感染、Child-Pugh 分级、术前 AST 值和 ALT 值相关，且影响患者的 OS 和 DFS。有研究[19-20]指出，外周血中人类端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，h-TERT）mRNA 是否表达是影响患者生存时间的因素之一，其表达水平的高低与肿瘤直径有关，并可以用于评估肿瘤复发和治疗情况，其灵敏度似乎比 AFP mRNA 更高。而在实体癌组织中，目前只发现成人神经胶质瘤中 TERT 启动子突变与 TERT mRNA 表达上调和端粒酶活性高度相关[21]，而肝癌组织中的 TERT 启动子突变与 TERT 表达之间并不完全统一，它们之间还存在着多种可能机制（如甲基化）相互影响，但肝癌组织中 TERT mRNA 的表达水平与肝癌患者的肿瘤生长情况和生存率是明确相关的[22-23]。这些都和本研究结果相符，究其原因，这可能是由于 TERT mRNA 高表达能影响端粒酶活性，使细胞永生化进而发生癌变[4]，促进肿瘤复发和缩短患者生存期。其次，端粒酶异常激活将导致肝星状细胞活性增强[24]，肝星状细胞的活化将使肝炎进一步向肝结节和肝纤维化发展，影响肝功能，引发肝损害，降低肝脏的免疫能力。而对于 HBV 感染的 HCC 患者来说，肝脏免疫能力降低引起的高 HBV DNA 拷贝是影响其 OS 和 DFS 的独立危险因素[25]。以上结果说明，TERT mRNA 表达水平的高低可能才是我们应该关注的肝癌预后的特征因子。
本研究分析结果表明，影响患者 OS 的因素有非解剖性肝切除、肿瘤直径>5 cm 及 TERT mRNA 高表达，影响患者 DFS 的因素有术前血小板计数>100×109/L、肿瘤直径>5 cm 及 TERT mRNA 高表达。肝癌的肿瘤直径是多种肝癌分期系统的主要考虑因素，肿瘤直径越大越易诱发肿瘤血管侵犯和多发。已有研究[8]表明，肿瘤直径>5 cm 的患者行肝癌手术后 5 年生存率低于肿瘤直径≤5 cm 的患者，所以肿瘤直径应是影响患者 OS 与 DSF 的因素之一。有研究[26]显示，非解剖性肝切除会影响术中出血、输血及肿瘤受压迫的情况，这些将直接影响患者的术后恢复及并发症的发生，间接影响患者的机体免疫能力，而机体免疫力的高低是影响术后感染和肿瘤复发的关键因素之一[27]，所以非解剖性肝切除与患者的 OS 密切相关。此外，血小板在肝脏病变中发挥着重要的作用，血小板的缺乏会增大患者的出血风险，而且还会影响肝脏的再生。有研究[28]表明，血小板数量的降低可能会影响肝脏的重要代谢途径，促进肝功能不全。同时血小板影响血管内皮生成，在肝癌的炎症反应中起关键作用，有助于维持肝癌炎症微环境和毛细血管生成，影响肝癌的预后[29-30]。
综上，本研究结果表明，TERT 启动子突变存在于 HCC 患者当中，但它只与患者的肝功能相关，并不能成为预测 HCC 术后患者预后的指标，也不影响患者的 OS 和 DFS；TERT mRNA 表达水平的高低是影响 HCC 患者术后预后的指标，它与患者的 OS 与 DFS 相关，TERT mRNA 可能是 HCC 预后的标志物。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：龚辰、王海清和冯燮林负责临床研究方案设计；冯燮林、王海清、刘爱祥、张丽霞、李磊、薄文滔、胡勇、张明仪、张辉、田浪和唐小丽参与临床数据收集、整理与分析；王海清和龚辰负责基因突变和 TERT mRNA 表达检查及数据收集；冯燮林、张明仪、张丽霞、唐小丽、王海清和龚辰参与对最终结果的讨论与分析。
伦理声明：本研究已通过电子科技大学附属肿瘤医院伦理审查委员会的伦理审核批准。
