引用本文： 孙胜, 孙诚谊, 潘耀振, 邓小强, 李红伟. 辐射联合脂质体介导的胞嘧啶脱氨基酶/5-氟胞嘧啶系统体外抑杀人胰腺癌细胞的研究. 中国普外基础与临床杂志, 2020, 27(9): 1078-1083. doi: 10.7507/1007-9424.201912009 复制
胰腺癌是腹部外科常见的恶性肿瘤，其发病隐匿，病情进展快，手术切除率仅为 15%～30%，病死率高，对传统的手术、放化疗及近年来新兴的靶向治疗等均不敏感，是临床上的难题之一[1-2]。而源于 20 世纪 90 年代兴起的自杀基因体系对肿瘤的研究和近年来自杀基因体系联合其他治疗方法的临床研究结果再次给胰腺癌这类疗效欠佳肿瘤的治疗提出了新的思考和希望[3-8]。胞嘧啶脱氨基酶（cytosine deaminase，CD）/5-氟胞嘧啶（5-flurocytosine，5-FC）系统技术是通过把仅存在于细菌、真菌的 CD 基因导入肿瘤细胞，利用其表达产物将前体药物 5-FC 转化为具有辐射增敏效应的细胞毒性药物 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU），进而影响细胞增殖时 DNA、RNA 的合成，表现出较强的抑瘤效应及“旁观者效应” [9-10]。为此，本研究应用 CD/5-FC 系统联合辐射对人胰腺癌细胞进行实验性自杀基因治疗，同时观察其辐射增敏效应和二者的协同抑瘤作用。
1 材料与方法
1.1 细胞及主要试剂
人胰腺癌细胞系 PC3 购自 ATCC 公司。脂质体 Lipofectin、G418 购自 Gibco 公司。MTT、5-FC 购自 Sigma 公司。含大肠杆菌 CD 基因的质粒 pcDNA3-CD、载体 pcDNA3 由中国医科院曹慧青博士惠赠。质粒提取、纯化试剂盒、反转录试剂盒购自 Promega 公司，总 RNA 提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。
1.2 细胞培养
将人胰腺癌 PC3 细胞常规传代培养于含 10% 胎牛血清（北京元亨圣马生物技术研究所，56 ℃，1 h 灭活）的 RPMI 1640（Gibco 公司）培养液中，培养条件为 37 ℃、饱和湿度及 5% CO2 的孵箱。
1.3 质粒转染
参照试剂盒说明书，用 Lipofectin 分别将空载体 pcDNA3 及 pcDNA3-CD 转染人胰腺癌 PC3 细胞。转染后的细胞经 G418（0.8 mg/mL）筛选。第 15 天时，挑取最佳单克隆于含 G418（0.2 mg/mL）的培养液中扩大培养，培养后的细胞分别命名为 PC3+pcDNA3 细胞（空载体 pcDNA3 转染的 PC3 细胞）、PC3+pcDNA3-CD 细胞（含 EC-CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的 PC3 细胞）、PC3+pcDNA3-CD+2 Gy 细胞（含 EC-CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的 PC3 细胞并经 2 Gy 钴-60（60Co）辐射。
1.4 采用 RT-PCR 方法对细胞进行鉴定
采用总 RNA 提取试剂盒分别提取未经转染的 PC3、PC3+pcDNA3、PC3+pcDNA3-CD 和 PC3+pcDNA3-CD+2 Gy 细胞的总 RNA，取适量总 RNA，以 Oligo（dt）为引物进行反转录，对反转录产物进行 PCR 反应。CD 基因上游引物为 5′-ACCGGATCCTTACAATGTCGAATAACGC-3′，下游引物为 5′-CGCGAATTCCCAGTCGTTCAACGTTTG3-3′，PCR 反应条件为 94 ℃ 40 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 1 min，总循环数 32，扩增片段长度 1.3 kb。内对照 GAPDH 基因上游引物为 5′ -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物为 5′ -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，总循环数 28，扩增片段长度约 450 bp。结果经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳鉴定，采用凝胶成像仪检测进行定性分析。
1.5 细胞体外药物敏感实验
在该实验中细胞被分为 5 组：① PC3 组：未转染基因的 PC3 细胞；② PC3+pcDNA3 组：空载体 pcDNA3 转染 PC3 细胞；③ PC3+2 Gy 组：未转染基因的 PC3 细胞经 2 Gy 60Co 照射（照射距离为 4 m，辐射率为 1.01×10–3 C/（kg•s)，北京军事医学科学院钴源室）；④ PC3+pcDNA3-CD 组：含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的 PC3 细胞；⑤ PC3+pcDNA3-CD+2 Gy 组：含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的 PC3 细胞经 2 Gy 60Co 照射（照射同 PC3+2 Gy 组）。然后将上述 5 组细胞按 2×103个/孔分别接种于 96 孔板，培养 10～12 h 后加入 5-FC 至终浓度分别为 0、10、100、200、500、1 000 μmol/L，每个剂量设 4 个平行孔。培养 4 d 后采用 MTT 法测定各组光吸收度值即 A 值，以 PC3 组细胞为对照，培养液调零，计算细胞存活抑制率，其计算公式为：存活抑制率（%）=（1－实验组 A 值）/（1－对照组 A 值）×100%。实验独立重复 3 次，计算平均值。
1.6 MTT 法检测 CD/5-FC 系统的旁观者效应
将 PC3+pcDNA3-CD 细胞和 PC3 细胞（未经转染的 PC3 细胞）按 0∶10、2∶8、4∶6、6∶4、8∶2、10∶0 的数目比制做单细胞混合悬液，按 1×104 个/孔细胞接种于 96 孔板，每个数目比设 6 个平行孔。培养 10～12 h 后每个数目比细胞中加入 5-FC 至终浓度为 500 μmol/L，继续培养 4 d 后采用 MTT 法测 A 值，以 PC3 组细胞为对照，培养液调零，计算出混合细胞存活抑制率并定义为混合细胞存活抑制率实验值。根据混合细胞存活抑制率实验值和细胞数目比再次计算出 5-FC 在 500 μmol/L 药物浓度下混合细胞的存活抑制率并定义为混合细胞存活抑制率预测值。混合细胞存活抑制率实验值和预测值计算公式为：混合细胞存活抑制率实验值（%）=（1–实验组 A 值）/（1–对照组 A 值）×100%；混合细胞存活抑制率预测值=（混合细胞中转染的 PC3 细胞的数目比×转染的 PC3 细胞 10∶0 数目比时的混合细胞存活抑制率实验值）+（未经转染的 PC3 细胞数目比×未经转染的 PC3 细胞 10∶0 数目比时的混合细胞存活抑制率实验值）。
1.7 细胞照射和细胞存活克隆形成
在该实验中，将指数生长期的未经转染的 PC3 细胞和含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的 PC3 细胞按 1×105 个/孔分别接种于 6 孔板中并将其分为4 组：① PC3 组：未转染基因的 PC3 细胞；② PC3+5-FC 组：未转染基因的 PC3 细胞经含500 μmol/L 5-FC 浓度的细胞培养液培养；③ PC3/CD 组：含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的 PC3 细胞；④ PC3/CD+5-FC 组：含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的 PC3 细胞经含 500 μmol/L5-FC 浓度的细胞培养液培养。PC3 组和 PC3/CD 组细胞用常规细胞培养液培养，PC3+5-FC 组和 PC3/CD+5-FC 组细胞用含 500 μmol/L 5-FC 浓度的细胞培养液培养。培养 72 h 后收集各组细胞，然后分别给予 0、1、2、4、6、8 Gy 的 60Co 照射，对应于以上辐射剂量按细胞数依次为 500、1 000、2 000、4 000、6 000、8 000 个/孔接种于 35 mm 平皿，每个剂量设 3 个平行皿；培养 12 d 后计数各组存活细胞克隆数（细胞数≥50 个的集落为 1 个存活细胞克隆），同时计算细胞克隆形成率、存活分数（SF）和放射增敏比（sensitizer enchancement ratio，SER），计算公式分别为：细胞克隆形成率（%）=照射后细胞形成的克隆数/种植细胞数×100%；SF=2 Gy 60Co 照射后细胞克隆形成率/0 Gy 60Co 照射时细胞克隆形成率；本研究中，结合临床实际放疗剂量，将 SER 定义为 2 Gy 60Co 照射时 PC3 组细胞存活分数与 PC3/CD+5-FC 组细胞 SF 之比值，即 SER=PC3 组 SF /PC3/CD+5-FC 组 SF。实验独立重复 3 次，计算平均值。
1.8 统计学方法
应用 SPSS 18.0 软件包对数据进行分析，对符合正态分布的数据以均数±标准差（
±s）表示，多组计量资料进行单因素方差结果分析，两两组间比较，采用 LSD-t 检验方法。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 细胞鉴定结果
PCR 产物经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳显示，未转染基因的 PC3 细胞及空载体 pcDNA3 转染 PC3 细胞未能扩增出相应的目的基因—CD 基因片段；含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的 PC3 细胞和2 Gy 60Co 照射后含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的 PC3 细胞均见到了预期大小的 CD（1.3 kb）基因相应的片段。该结果提示，目的质粒成功转染入靶细胞即 CD 基因已稳定地整合入 PC3 细胞并获得了一定的表达，见图 1。
图1
示 RT-PCR 方法检测 PC3 细胞总 RNA 结果
1：未转染基因的 PC3 细胞；2：空载体 pcDNA3 转染 PC3 细胞；3：含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染、经 2 Gy 60Co 照射的 PC3 细胞；4：含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的 PC3 细胞；5：DNA Marker DL2000
2.2 细胞对药物的敏感性结果
通过 MTT 法检验细胞的药物敏感性，结果见表 1。5-FC 对实验中 5 组的 PC3 细胞均表现出一定的药物抑制敏感性，且随着药物浓度增加存活抑制率也不断升高。其中 PC3 组细胞和 PC3+pcDNA3 组细胞对 5-FC 敏感性较低，即使在 5-FC 浓度达到 1 000 μmol/L 时，对细胞存活抑制率仍低于 10%。5-FC 对 PC3+pcDNA3-CD 组和 PC3+pcDNA3-CD+2 Gy 组细胞的存活抑制率明显高于 PC3 组（P<0.05），当 5-FC 浓度在 200 μmol/L 时的存活抑制率达 50% 左右，提示 5-FC 对 PC3+pcDNA3-CD 细胞的半抑制浓度（IC50）约为 200 μmol/L，此浓度下 PC3+pcDNA3-CD 对 5-FC 的敏感性与 PC3、PC3+pcDNA3 组细胞相比均提高了 10 倍左右。在 0 μmol/L 浓度 5-FC 时即单纯给予2 Gy 60Co 照射后较未照射 PC3 组和 PC3+pcDNA3 组细胞的存活抑制率均大约提高了 5%（P<0.05），提示单纯的临床相关剂量 2 Gy 60Co 照射对 PC3 细胞存在一定的抑杀效应，与辐射抑瘤原理相符合。
表1
不同浓度 5-FC 对各组细胞的存活抑制率（
，%）
2.3 CD/5-FC 系统对 PC3 细胞的旁观者效应
500 μmol/L 浓度下前药 5-FC 对不同比例混合细胞的存活抑制率实验值和预测值见表 2。从表 2 可见，由 PC3+pcDNA3-CD 细胞和未经转染 PC3 细胞按 2∶8、4∶6、6∶4、8∶2 混合细胞比例时的存活抑制率实验值和存活抑制率预测值均明显高于“0∶10”混合细胞即单一的未经转染的 PC3 细胞（P<0.05），但与“10∶0”混合细胞即单一的含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的胰腺癌 PC3 细胞比较差异无统计学意义（P>0.05）；同时在 2∶8、4∶6、6∶4、8∶2 同一混合细胞比例条件下的存活抑制率实验值明显高于存活抑制率预测值（P<0.05），即混合细胞中稳定表达 CD 基因的 PC3 细胞的存在大大提高了 5-FC 对混合细胞中 PC3+pcDNA3-CD 细胞和 PC3 细胞的抑杀作用，提示 CD/5-FC 系统对 PC3 细胞旁观者效应的客观存在。
表2
500 μmol/L 5-FC 浓度对不同比例细胞的存活抑制率实验值和预测值（
，%）
2.4 细胞辐射敏感性分析结果
细胞照射和细胞存活克隆形成结果见表 3。各组内细胞在分别给予 1、2、4、6、8 Gy 60Co 照射后的细胞克隆形成率和 SF 均较给予 0 Gy 60Co 照射状态的细胞克隆形成率和 SF 低（P<0.05），且随照射剂量的增加呈现进行性下降趋势（P<0.05）。PC3 组、PC3+5-FC 组、PC3/CD 组的 PC3 细胞在相对应各60Co 照射剂量点的细胞克隆形成率和 SF 值较为接近（P>0.05）；而 PC3/CD+5-FC 组在 1、2、4、6、8 Gy 60Co 照射点相对应的细胞克隆形成率和 SF 值均明显低于 PC3 组、PC3+5-FC 组和 PC3/CD 组（P<0.05）。在 2 Gy 60Co 照射下 PC3/CD 组和 PC3/CD+5-FC 组细胞的 SF 值分别是 0.296、0.201，二者比值即 SER 约为 1.5。
表3
各组细胞辐射敏感性分析结果（
，n=3）
3 讨论
自杀基因疗法一直是肿瘤基因治疗领域的研究热点之一[11-12]，对某些肿瘤的治疗已进入临床并取得预期疗效[9-10, 13-14]。CD/5-FC 自杀基因系统通过导入外源 CD 基因在肿瘤细胞中表达，将前药 5-FC 转换成临床常用的化疗药物 5-FU 并在局部获得较高的药物浓度，从而对肿瘤细胞产生针对性靶向杀伤作用，同时也表现出极有利用价值的“旁杀伤效应”[15-17]。本实验观察了 CD/5-FC 系统对人胰腺癌的治疗作用，同样证实了 5-FC 对表达 CD 基因的 PC3 细胞具有野生型 PC3 细胞无法比拟的杀伤力。另外，本研究发现 5-FC 对由未经转染 PC3 细胞和含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的 PC3 细胞按不同比例组成的混合细胞的杀伤效应比对单纯未经转染的 PC3 及单纯含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的胰腺癌 PC3 细胞的杀伤效应存在明显优势，进一步证实 CD/5-FC 系统对 PC3 细胞旁观者效应的客观存在，这在一定程度上避免了临床常规应用化疗药物的全身毒副作用，而旁观者效应的存在，使目前基因治疗中载体对肿瘤细胞的低转染效率的缺陷得以弥补。
辐射应用于肿瘤治疗已有百年历史，放射治疗引起细胞死亡的主要靶分子是 DNA。在大量的自杀基因 CD/5-FC 系统治疗结肠癌研究[18-21]中发现，联合辐射治疗时具有明显的协同作用，前药 5-FC 转换而成的 5-FU 相对集中于局部肿瘤细胞内，其对放射线的增敏作用较与之对照的 5-FU 与放疗结合组具有相对集中、更强和低毒副作用的特点。CD/5-FC 系统通过转换而来的 5-FU 本身即是一种公认的放疗增敏剂，它通过耗尽细胞核多肽来抑制辐射后 DNA 损伤修复[22-25]。本实验结果证实，当给予经过 5-FC 处理且稳定表达 CD 基因的 PC3 细胞不同剂量的辐射后，发现细胞克隆形成率和细胞存活分数较野生型 PC3 细胞和单纯给予辐射的稳定表达 CD 基因 PC3 细胞显著减低，且与辐射剂量成一定依赖性；仅给予单次 2 Gy 照射后同样表现出一定的协同抑瘤作用，这一结果进一步证实 CD/5-FC 自杀基因体系明显增强了辐射对含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的 PC3 细胞的抑杀效应，即提高了稳定表达 CD 基因 PC3 细胞的辐射杀伤敏感性。电离辐射和 5-FU 会对正常组织产生一定的影响，但由于所采用的辐射剂量为临床相关剂量 2 Gy，同时前药 5-FC 转换而成的 5-FU 相对集中于局部肿瘤细胞内，二者累积剂量均较低，对患者将不会产生明显的毒副影响。
总之，辐射和自杀基因 CD/5-FC 治疗系统的联合可以促进目的基因的转染和表达、协同提高治疗效果，具有强效抑瘤作用，且多不伴有明显的剂量依赖毒副效应[26-27]。相信随着研究的深入，在加上目前成熟的介入及靶向放疗技术，联合辐射和 CD/5-FC 系统有望为最大限度地抑制胰腺癌的生长和转移提供一种新的可能。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们无相互竞争的利益。
作者贡献声明：孙胜提出研究思路、设计研究方案、负责设计和进行实验并负责论文起草；孙诚谊提出研究方向、指导研究设计并监督、管理研究进行；潘耀振指导部分实验设计、负责部分数据分析并协助稿件起草；邓小强参与部分实验操作并负责部分数据分析；李红伟参与部分实验设计并提供技术支持和资料收集。
胰腺癌是腹部外科常见的恶性肿瘤，其发病隐匿，病情进展快，手术切除率仅为 15%～30%，病死率高，对传统的手术、放化疗及近年来新兴的靶向治疗等均不敏感，是临床上的难题之一[1-2]。而源于 20 世纪 90 年代兴起的自杀基因体系对肿瘤的研究和近年来自杀基因体系联合其他治疗方法的临床研究结果再次给胰腺癌这类疗效欠佳肿瘤的治疗提出了新的思考和希望[3-8]。胞嘧啶脱氨基酶（cytosine deaminase，CD）/5-氟胞嘧啶（5-flurocytosine，5-FC）系统技术是通过把仅存在于细菌、真菌的 CD 基因导入肿瘤细胞，利用其表达产物将前体药物 5-FC 转化为具有辐射增敏效应的细胞毒性药物 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU），进而影响细胞增殖时 DNA、RNA 的合成，表现出较强的抑瘤效应及“旁观者效应” [9-10]。为此，本研究应用 CD/5-FC 系统联合辐射对人胰腺癌细胞进行实验性自杀基因治疗，同时观察其辐射增敏效应和二者的协同抑瘤作用。
1 材料与方法
1.1 细胞及主要试剂
人胰腺癌细胞系 PC3 购自 ATCC 公司。脂质体 Lipofectin、G418 购自 Gibco 公司。MTT、5-FC 购自 Sigma 公司。含大肠杆菌 CD 基因的质粒 pcDNA3-CD、载体 pcDNA3 由中国医科院曹慧青博士惠赠。质粒提取、纯化试剂盒、反转录试剂盒购自 Promega 公司，总 RNA 提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。
1.2 细胞培养
将人胰腺癌 PC3 细胞常规传代培养于含 10% 胎牛血清（北京元亨圣马生物技术研究所，56 ℃，1 h 灭活）的 RPMI 1640（Gibco 公司）培养液中，培养条件为 37 ℃、饱和湿度及 5% CO2 的孵箱。
1.3 质粒转染
参照试剂盒说明书，用 Lipofectin 分别将空载体 pcDNA3 及 pcDNA3-CD 转染人胰腺癌 PC3 细胞。转染后的细胞经 G418（0.8 mg/mL）筛选。第 15 天时，挑取最佳单克隆于含 G418（0.2 mg/mL）的培养液中扩大培养，培养后的细胞分别命名为 PC3+pcDNA3 细胞（空载体 pcDNA3 转染的 PC3 细胞）、PC3+pcDNA3-CD 细胞（含 EC-CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的 PC3 细胞）、PC3+pcDNA3-CD+2 Gy 细胞（含 EC-CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的 PC3 细胞并经 2 Gy 钴-60（60Co）辐射。
1.4 采用 RT-PCR 方法对细胞进行鉴定
采用总 RNA 提取试剂盒分别提取未经转染的 PC3、PC3+pcDNA3、PC3+pcDNA3-CD 和 PC3+pcDNA3-CD+2 Gy 细胞的总 RNA，取适量总 RNA，以 Oligo（dt）为引物进行反转录，对反转录产物进行 PCR 反应。CD 基因上游引物为 5′-ACCGGATCCTTACAATGTCGAATAACGC-3′，下游引物为 5′-CGCGAATTCCCAGTCGTTCAACGTTTG3-3′，PCR 反应条件为 94 ℃ 40 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 1 min，总循环数 32，扩增片段长度 1.3 kb。内对照 GAPDH 基因上游引物为 5′ -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物为 5′ -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，总循环数 28，扩增片段长度约 450 bp。结果经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳鉴定，采用凝胶成像仪检测进行定性分析。
1.5 细胞体外药物敏感实验
在该实验中细胞被分为 5 组：① PC3 组：未转染基因的 PC3 细胞；② PC3+pcDNA3 组：空载体 pcDNA3 转染 PC3 细胞；③ PC3+2 Gy 组：未转染基因的 PC3 细胞经 2 Gy 60Co 照射（照射距离为 4 m，辐射率为 1.01×10–3 C/（kg•s)，北京军事医学科学院钴源室）；④ PC3+pcDNA3-CD 组：含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的 PC3 细胞；⑤ PC3+pcDNA3-CD+2 Gy 组：含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的 PC3 细胞经 2 Gy 60Co 照射（照射同 PC3+2 Gy 组）。然后将上述 5 组细胞按 2×103个/孔分别接种于 96 孔板，培养 10～12 h 后加入 5-FC 至终浓度分别为 0、10、100、200、500、1 000 μmol/L，每个剂量设 4 个平行孔。培养 4 d 后采用 MTT 法测定各组光吸收度值即 A 值，以 PC3 组细胞为对照，培养液调零，计算细胞存活抑制率，其计算公式为：存活抑制率（%）=（1－实验组 A 值）/（1－对照组 A 值）×100%。实验独立重复 3 次，计算平均值。
1.6 MTT 法检测 CD/5-FC 系统的旁观者效应
将 PC3+pcDNA3-CD 细胞和 PC3 细胞（未经转染的 PC3 细胞）按 0∶10、2∶8、4∶6、6∶4、8∶2、10∶0 的数目比制做单细胞混合悬液，按 1×104 个/孔细胞接种于 96 孔板，每个数目比设 6 个平行孔。培养 10～12 h 后每个数目比细胞中加入 5-FC 至终浓度为 500 μmol/L，继续培养 4 d 后采用 MTT 法测 A 值，以 PC3 组细胞为对照，培养液调零，计算出混合细胞存活抑制率并定义为混合细胞存活抑制率实验值。根据混合细胞存活抑制率实验值和细胞数目比再次计算出 5-FC 在 500 μmol/L 药物浓度下混合细胞的存活抑制率并定义为混合细胞存活抑制率预测值。混合细胞存活抑制率实验值和预测值计算公式为：混合细胞存活抑制率实验值（%）=（1–实验组 A 值）/（1–对照组 A 值）×100%；混合细胞存活抑制率预测值=（混合细胞中转染的 PC3 细胞的数目比×转染的 PC3 细胞 10∶0 数目比时的混合细胞存活抑制率实验值）+（未经转染的 PC3 细胞数目比×未经转染的 PC3 细胞 10∶0 数目比时的混合细胞存活抑制率实验值）。
1.7 细胞照射和细胞存活克隆形成
在该实验中，将指数生长期的未经转染的 PC3 细胞和含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的 PC3 细胞按 1×105 个/孔分别接种于 6 孔板中并将其分为4 组：① PC3 组：未转染基因的 PC3 细胞；② PC3+5-FC 组：未转染基因的 PC3 细胞经含500 μmol/L 5-FC 浓度的细胞培养液培养；③ PC3/CD 组：含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的 PC3 细胞；④ PC3/CD+5-FC 组：含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的 PC3 细胞经含 500 μmol/L5-FC 浓度的细胞培养液培养。PC3 组和 PC3/CD 组细胞用常规细胞培养液培养，PC3+5-FC 组和 PC3/CD+5-FC 组细胞用含 500 μmol/L 5-FC 浓度的细胞培养液培养。培养 72 h 后收集各组细胞，然后分别给予 0、1、2、4、6、8 Gy 的 60Co 照射，对应于以上辐射剂量按细胞数依次为 500、1 000、2 000、4 000、6 000、8 000 个/孔接种于 35 mm 平皿，每个剂量设 3 个平行皿；培养 12 d 后计数各组存活细胞克隆数（细胞数≥50 个的集落为 1 个存活细胞克隆），同时计算细胞克隆形成率、存活分数（SF）和放射增敏比（sensitizer enchancement ratio，SER），计算公式分别为：细胞克隆形成率（%）=照射后细胞形成的克隆数/种植细胞数×100%；SF=2 Gy 60Co 照射后细胞克隆形成率/0 Gy 60Co 照射时细胞克隆形成率；本研究中，结合临床实际放疗剂量，将 SER 定义为 2 Gy 60Co 照射时 PC3 组细胞存活分数与 PC3/CD+5-FC 组细胞 SF 之比值，即 SER=PC3 组 SF /PC3/CD+5-FC 组 SF。实验独立重复 3 次，计算平均值。
1.8 统计学方法
应用 SPSS 18.0 软件包对数据进行分析，对符合正态分布的数据以均数±标准差（±s）表示，多组计量资料进行单因素方差结果分析，两两组间比较，采用 LSD-t 检验方法。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 细胞鉴定结果
PCR 产物经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳显示，未转染基因的 PC3 细胞及空载体 pcDNA3 转染 PC3 细胞未能扩增出相应的目的基因—CD 基因片段；含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的 PC3 细胞和2 Gy 60Co 照射后含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的 PC3 细胞均见到了预期大小的 CD（1.3 kb）基因相应的片段。该结果提示，目的质粒成功转染入靶细胞即 CD 基因已稳定地整合入 PC3 细胞并获得了一定的表达，见图 1。
图1
示 RT-PCR 方法检测 PC3 细胞总 RNA 结果
1：未转染基因的 PC3 细胞；2：空载体 pcDNA3 转染 PC3 细胞；3：含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染、经 2 Gy 60Co 照射的 PC3 细胞；4：含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的 PC3 细胞；5：DNA Marker DL2000
2.2 细胞对药物的敏感性结果
通过 MTT 法检验细胞的药物敏感性，结果见表 1。5-FC 对实验中 5 组的 PC3 细胞均表现出一定的药物抑制敏感性，且随着药物浓度增加存活抑制率也不断升高。其中 PC3 组细胞和 PC3+pcDNA3 组细胞对 5-FC 敏感性较低，即使在 5-FC 浓度达到 1 000 μmol/L 时，对细胞存活抑制率仍低于 10%。5-FC 对 PC3+pcDNA3-CD 组和 PC3+pcDNA3-CD+2 Gy 组细胞的存活抑制率明显高于 PC3 组（P<0.05），当 5-FC 浓度在 200 μmol/L 时的存活抑制率达 50% 左右，提示 5-FC 对 PC3+pcDNA3-CD 细胞的半抑制浓度（IC50）约为 200 μmol/L，此浓度下 PC3+pcDNA3-CD 对 5-FC 的敏感性与 PC3、PC3+pcDNA3 组细胞相比均提高了 10 倍左右。在 0 μmol/L 浓度 5-FC 时即单纯给予2 Gy 60Co 照射后较未照射 PC3 组和 PC3+pcDNA3 组细胞的存活抑制率均大约提高了 5%（P<0.05），提示单纯的临床相关剂量 2 Gy 60Co 照射对 PC3 细胞存在一定的抑杀效应，与辐射抑瘤原理相符合。
表1
不同浓度 5-FC 对各组细胞的存活抑制率（，%）
2.3 CD/5-FC 系统对 PC3 细胞的旁观者效应
500 μmol/L 浓度下前药 5-FC 对不同比例混合细胞的存活抑制率实验值和预测值见表 2。从表 2 可见，由 PC3+pcDNA3-CD 细胞和未经转染 PC3 细胞按 2∶8、4∶6、6∶4、8∶2 混合细胞比例时的存活抑制率实验值和存活抑制率预测值均明显高于“0∶10”混合细胞即单一的未经转染的 PC3 细胞（P<0.05），但与“10∶0”混合细胞即单一的含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的胰腺癌 PC3 细胞比较差异无统计学意义（P>0.05）；同时在 2∶8、4∶6、6∶4、8∶2 同一混合细胞比例条件下的存活抑制率实验值明显高于存活抑制率预测值（P<0.05），即混合细胞中稳定表达 CD 基因的 PC3 细胞的存在大大提高了 5-FC 对混合细胞中 PC3+pcDNA3-CD 细胞和 PC3 细胞的抑杀作用，提示 CD/5-FC 系统对 PC3 细胞旁观者效应的客观存在。
表2
500 μmol/L 5-FC 浓度对不同比例细胞的存活抑制率实验值和预测值（，%）
2.4 细胞辐射敏感性分析结果
细胞照射和细胞存活克隆形成结果见表 3。各组内细胞在分别给予 1、2、4、6、8 Gy 60Co 照射后的细胞克隆形成率和 SF 均较给予 0 Gy 60Co 照射状态的细胞克隆形成率和 SF 低（P<0.05），且随照射剂量的增加呈现进行性下降趋势（P<0.05）。PC3 组、PC3+5-FC 组、PC3/CD 组的 PC3 细胞在相对应各60Co 照射剂量点的细胞克隆形成率和 SF 值较为接近（P>0.05）；而 PC3/CD+5-FC 组在 1、2、4、6、8 Gy 60Co 照射点相对应的细胞克隆形成率和 SF 值均明显低于 PC3 组、PC3+5-FC 组和 PC3/CD 组（P<0.05）。在 2 Gy 60Co 照射下 PC3/CD 组和 PC3/CD+5-FC 组细胞的 SF 值分别是 0.296、0.201，二者比值即 SER 约为 1.5。
表3
各组细胞辐射敏感性分析结果（，n=3）
3 讨论
自杀基因疗法一直是肿瘤基因治疗领域的研究热点之一[11-12]，对某些肿瘤的治疗已进入临床并取得预期疗效[9-10, 13-14]。CD/5-FC 自杀基因系统通过导入外源 CD 基因在肿瘤细胞中表达，将前药 5-FC 转换成临床常用的化疗药物 5-FU 并在局部获得较高的药物浓度，从而对肿瘤细胞产生针对性靶向杀伤作用，同时也表现出极有利用价值的“旁杀伤效应”[15-17]。本实验观察了 CD/5-FC 系统对人胰腺癌的治疗作用，同样证实了 5-FC 对表达 CD 基因的 PC3 细胞具有野生型 PC3 细胞无法比拟的杀伤力。另外，本研究发现 5-FC 对由未经转染 PC3 细胞和含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的 PC3 细胞按不同比例组成的混合细胞的杀伤效应比对单纯未经转染的 PC3 及单纯含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的胰腺癌 PC3 细胞的杀伤效应存在明显优势，进一步证实 CD/5-FC 系统对 PC3 细胞旁观者效应的客观存在，这在一定程度上避免了临床常规应用化疗药物的全身毒副作用，而旁观者效应的存在，使目前基因治疗中载体对肿瘤细胞的低转染效率的缺陷得以弥补。
辐射应用于肿瘤治疗已有百年历史，放射治疗引起细胞死亡的主要靶分子是 DNA。在大量的自杀基因 CD/5-FC 系统治疗结肠癌研究[18-21]中发现，联合辐射治疗时具有明显的协同作用，前药 5-FC 转换而成的 5-FU 相对集中于局部肿瘤细胞内，其对放射线的增敏作用较与之对照的 5-FU 与放疗结合组具有相对集中、更强和低毒副作用的特点。CD/5-FC 系统通过转换而来的 5-FU 本身即是一种公认的放疗增敏剂，它通过耗尽细胞核多肽来抑制辐射后 DNA 损伤修复[22-25]。本实验结果证实，当给予经过 5-FC 处理且稳定表达 CD 基因的 PC3 细胞不同剂量的辐射后，发现细胞克隆形成率和细胞存活分数较野生型 PC3 细胞和单纯给予辐射的稳定表达 CD 基因 PC3 细胞显著减低，且与辐射剂量成一定依赖性；仅给予单次 2 Gy 照射后同样表现出一定的协同抑瘤作用，这一结果进一步证实 CD/5-FC 自杀基因体系明显增强了辐射对含 CD 基因质粒 pcDNA3-CD 转染的 PC3 细胞的抑杀效应，即提高了稳定表达 CD 基因 PC3 细胞的辐射杀伤敏感性。电离辐射和 5-FU 会对正常组织产生一定的影响，但由于所采用的辐射剂量为临床相关剂量 2 Gy，同时前药 5-FC 转换而成的 5-FU 相对集中于局部肿瘤细胞内，二者累积剂量均较低，对患者将不会产生明显的毒副影响。
总之，辐射和自杀基因 CD/5-FC 治疗系统的联合可以促进目的基因的转染和表达、协同提高治疗效果，具有强效抑瘤作用，且多不伴有明显的剂量依赖毒副效应[26-27]。相信随着研究的深入，在加上目前成熟的介入及靶向放疗技术，联合辐射和 CD/5-FC 系统有望为最大限度地抑制胰腺癌的生长和转移提供一种新的可能。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们无相互竞争的利益。
作者贡献声明：孙胜提出研究思路、设计研究方案、负责设计和进行实验并负责论文起草；孙诚谊提出研究方向、指导研究设计并监督、管理研究进行；潘耀振指导部分实验设计、负责部分数据分析并协助稿件起草；邓小强参与部分实验操作并负责部分数据分析；李红伟参与部分实验设计并提供技术支持和资料收集。
