引用本文： 刘军, 胡洪生, 吴红伟, 付海峰, 魏广民, 胡伟, 孙少华. VEGF 在门静脉高压患者术后门静脉系统血栓形成过程中的表达及意义. 中国普外基础与临床杂志, 2021, 28(1): 63-66. doi: 10.7507/1007-9424.202004072 复制
肝硬变是我国常见疾病，而门静脉高压症与肝硬变最严重的并发症有关，包括食管胃底静脉曲张破裂出血、肝性脑病、腹水等[1]。尽管药物和内镜治疗取得了较好的疗效，但仍无法替代手术治疗的作用[2]。脾切除+贲门周围血管离断术是治疗肝硬变门静脉高压的常见手术方式，但其术后门静脉系统血栓（portal vein system thrombosis，PVST）的发生率较高[3-5]。PVST 可能引起门静脉压力再次升高，导致静脉曲张出血，还可能引起肝内缺血，诱发急性肝衰竭和肝性脑病，严重威胁患者生命。肠系膜上静脉血栓形成还能导致小肠坏死等严重并发症[6-7]。尽管国内外关于 PVST 的研究已非常多，但其机制并未完全阐明。VEGF 属于血小板源生长因子超家族重要成员，可由血管内皮细胞等多种细胞分泌，已有研究证实，VEGF 能够刺激内皮细胞进而促进血小板的黏附和活化[8]，而血小板的黏附聚集是激发凝血和血栓形成的关键性因素。本研究通过免疫组织化学方法观察门静脉高压症患者术后脾静脉及脾脏组织中 VEGF 的表达部位及水平，同时检测血清 VEGF 水平，初步探讨 VEGF 在门静脉高压术后 PVST 形成过程中的作用。
1 资料与方法
1.1 研究对象
纳入研究的患者为 2014 年 1 月至 2018 年 12 月期间在湖北医药学院附属东风医院就诊的肝硬变门静脉高压患者，根据纳入标准及排除标准，共有 146 例患者纳入研究。
1.2 纳入标准及排除标准
1.2.1 纳入标准
明确诊断为肝硬变并出现食管胃底静脉曲张、腹水、脾肿大、脾功能亢进等临床表现而诊断为门静脉高压症，行脾切除+贲门周围血管离断术的患者；患者或委托人知晓研究方案并自愿提供术前及术后血清标本、自愿签署知情同意书。
1.2.2 排除标准
术前肝功能为 Child C 级；术前合并 PVST；合并肝脏恶性肿瘤或其他脏器恶性肿瘤。
1.3 研究方法
1.3.1 血清标本的采集与处理
所有纳入研究患者在术前（1 周内）及术后第 7 天分别于清晨空腹采肘静脉血 5 mL，经处理后取上清采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定 VEGF 水平。血清 VEGF 测定采用 Human VEGF-A 预包被 ELISA 试剂盒，严格按照产品说明书所列实验步骤进行。具体步骤：根据实验孔数量，确定所需的板条数目→加样，100 μL/孔加入样本或标准品→室温孵育 2 h→洗板→加生物素标记的抗体→室温孵育 2 h→洗板→加亲和素-HRP→室温孵育 20 min→洗板→加 TMB 显色液→室温避光孵育 15 min→加终止液终止反应→在检测波长 450 nm 处读取吸光度值（A 值）→计算各样本 VEGF 水平。实验过程中血标本采集经医院伦理委员会审批。
1.3.2 脾静脉及脾脏标本的采集与处理
收集手术过程中切除的脾静脉及脾脏标本，肝硬变门静脉高压症脾脏切除术中，待脾脏取出后，在脾门处取 5 mm×2 mm×1 mm 大小脾静脉组织，在脾下极取 5 mm×5 mm×5 mm 大小脾脏组织，甲醛溶液固定。脾静脉及脾脏标本采用免疫组织化学方法检测 VEGF 表达部位及水平，实验按照免疫组织化学二步法常规染色步骤进行。具体步骤：脱蜡，水化组织切片→3% 过氧化氢孵育 4 min 以阻断内源性过氧化物酶→PBS 洗 1 次，3 min→滴加适当稀释的一抗 VEGF 单克隆抗体（1∶100），4 ℃ 孵育 24 h→弃一抗，用 PBS 洗 3 次→滴加二抗 IgG（1∶200），置室温下孵育 20 min→PBS 洗 3 次→二氨基联苯胺（DAB）显色，光镜观察显色满意后自来水冲洗 5 min 终止显色→常规复染，脱水，封片→用 PBS 液替代一抗进行阴性对照染色。VEGF 阳性细胞为胞浆呈黄色至棕黄色。图像分析在显微镜下进行，每张切片于低倍镜下选取 5 个视野，然后在高倍镜下计数阳性细胞数。染色结果以染色指数评估，染色指数=染色范围评分×染色强度评分。染色范围以染色细胞占细胞总数百分比计算：≤10% 为 0 分，11%～25% 为1 分，26%～50% 为 2 分，51%～75% 为 3 分，≥76%为 4 分；染色强度评分：阴性为 0 分，弱阳性为 1 分，阳性为 2 分，强阳性为 3 分。
1.3.3 PVST 的诊断
所有入选患者于术后第 7 天时行肝胆胰脾超声检查，确定是否存在 PVST，依据是否形成 PVST 分为血栓形成组和非血栓形成组。
1.4 统计学方法
采用 SPSS 17.0 统计软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（
±s）表示，2 组间的比较采用 t 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
根据纳入标准及排除标准，共有 146 例肝硬变门静脉高压患者患者纳入研究。其中男 95 例，女 51 例；年龄 34～70 岁，平均 50.7 岁。手术方式为脾切除+贲门周围血管离断术，其中 39 例行腹腔镜手术，73 例行开腹手术。在术后第 7 天时行腹部超声检查，共有 31 例患者形成 PVST，PVST 发生率为 21.2%（31/146）。将此 31 例患者纳入血栓形成组，剩余 115 例患者为非血栓形成组。
2.2 2 组患者血清 VEGF 水平检测结果
根据标准品浓度在 450 nm 处所读得的A 值做出标准曲线，再根据标准曲线计算出各个样本中 VEGF 水平。结果：血栓形成组和非血栓形成组术前血清 VEGF 水平虽有差异，但差异无统计学意义（P>0.05）；术后血栓形成组血清 VEGF 水平显著高于非血栓形成组（P<0.05）。详见表 1。
表1
2 组患者手术前后血清 VEGF 水平检测结果（
，ng/L）
2.3 脾静脉及脾脏组织中 VEGF 表达检测结果
在脾静脉中，VEGF 主要定位于脾静脉血管内皮细胞和血管平滑肌细胞胞浆和胞核，以胞浆为主；在脾脏中，VEGF 主要在脾脏内滤泡旁血管、髓索血管和小梁血管壁的内皮细胞和血管平滑肌细胞胞浆内表达。2 组患者脾静脉细胞胞浆均被染色为黄色到棕黄色，呈片状或团块状分布，与非血栓形成组相比，血栓形成组染色更深，阳性细胞数更多，染色指数更高，差异有统计学意义（P<0.05），见图 1a、1b 和表 2。2 组患者脾脏细胞胞浆均被染成黄色到棕黄色，呈片状或团块状分布，与非血栓形成组相比，血栓形成组染色更深，阳性细胞数更多，染色指数更高，差异有统计学意义（P<0.05），见图 1c、1d 和表 2。
图1
示 2 组患者脾静脉及脾脏组织中 VEGF 表达检测结果（免疫组织化学染色 ×200）
a：血栓形成组脾静脉壁 VEGF 表达；b：非血栓形成组脾静脉壁 VEGF 表达；c：血栓形成组脾脏 VEGF 表达；d：非血栓形成组脾脏 VEGF 表达
表2
2 组患者脾静脉及脾脏组织中 VEGF 指数检测结果（
）
3 讨论
众所周知，静脉血栓形成需要血流淤滞、内皮细胞损伤和血液高凝状态 3 个条件[9]，其中内皮细胞损伤则是关键因素。正常血管壁的内皮通过释放不同的抗凝和抗血小板因子，如一氧化氮和前列腺素 PGI2 等来防止血栓形成，当血管内皮细胞损伤后，血小板被募集到裸露的胶原蛋白表面，血小板迅速黏附并活化，黏附的血小板释放活性物质，导致更多的血小板黏附和聚集，并促进血小板和内皮细胞的促凝活性，最终形成血栓[10]。因此血小板在血栓形成过程中发挥了关键作用[11]。
VEGF 属于血小板源生长因子超家族重要成员，可由血管内皮细胞等多种细胞分泌，具有高度生物活性，主要作用于血管内皮细胞，具有增加微血管通透性，特异性地与血管内皮细胞受体结合，促进内皮细胞增殖、促血管生成等作用[12]。VEGF 已被证实与多种疾病的发生、发展有关[13]。
VEGF 与血小板关系密切，1997 年，Möhle 等[14]发现在体外凝血酶的刺激下血小板能够释放 VEGF，而后 O’Byrne 等[15]在肾癌患者中证实，血清 VEGF 含量与血小板计数呈正相关，并且血清 VEGF 含量高及血小板计数高的患者往往预后不良。Kim 等[16]在研究肝癌时也得到相似的结论，并发现肝癌合并有门静脉血栓的患者，其血清 VEGF 浓度与血小板计数的比值明显高于无门静脉血栓的患者。
本研究发现，肝硬变门静脉高压症患者行手术治疗后，术后血栓形成组血清 VEGF 水平明显高于非血栓形成组，血栓形成组脾静脉及脾脏组织中 VEGF 表达强于非血栓形成组，表明 VEGF 可能参与了 PVST 的形成过程。分析其机制可能为：肝硬变门静脉高压患者行脾切除术后，失去了脾脏对衰老及功能不全的血小板的破坏及吞噬作用，常常会出现血小板数量升高[17]，脾静脉呈一盲端，血流缓慢，局部血液呈高凝状态下易形成血栓；手术破坏了门静脉系统的解剖结构，损伤了门静脉系统的血管壁，改变了门静脉系统的血流方向，术中钳夹、挤压等操作造成门静脉系统血管内膜损伤，部分内皮细胞脱离和胶原暴露会导致血小板黏附、活化[18]，血小板处于高度激活状态，被激活的血小板会释放大量的 VEGF[19]，而 VEGF 刺激内皮细胞进而进一步促进血小板的黏附和活化[8]，血小板的黏附聚集是激发凝血和血栓形成的关键因素[20]，活化的血小板与中性粒细胞和单核细胞黏附与聚集，促进血液中纤维素的形成，并募集其他血细胞形成血凝块，导致门静脉系统血管内血栓形成。
VEGF 除参与血栓的形成，还可能通过促进血栓机化和促进血管内膜的修复，从而在血栓的溶解与再通过程中发挥重要作用[21]。有学者[9]认为，血栓溶解过程与伤口愈合是类似的：首先是白细胞的募集，大量中性粒细胞侵入血栓内，后被单核细胞所替代，并逐渐在血栓内形成新的毛细血管，多种与血管新生相关的细胞因子起重要调节作用。VEGF 作为血管生成的基础调控因子，在未来 VEGF 基因治疗血管生成相关疾病方面有着更为广阔的前景[22]。
重要声明
利益冲突声明：所有作者均无利益冲突。
作者贡献声明：刘军负责实验设计、实施实验、数据收集与整理、统计分析及文章撰写；胡洪生负责实验设计、指导实验实施、文章修改；吴红伟、付海峰、魏广民和胡伟负责实施实验、标本收集、统计分析等；孙少华指导实验设计、经费等支持。
伦理声明：经医院伦理委员会审批，符合伦理学要求。
肝硬变是我国常见疾病，而门静脉高压症与肝硬变最严重的并发症有关，包括食管胃底静脉曲张破裂出血、肝性脑病、腹水等[1]。尽管药物和内镜治疗取得了较好的疗效，但仍无法替代手术治疗的作用[2]。脾切除+贲门周围血管离断术是治疗肝硬变门静脉高压的常见手术方式，但其术后门静脉系统血栓（portal vein system thrombosis，PVST）的发生率较高[3-5]。PVST 可能引起门静脉压力再次升高，导致静脉曲张出血，还可能引起肝内缺血，诱发急性肝衰竭和肝性脑病，严重威胁患者生命。肠系膜上静脉血栓形成还能导致小肠坏死等严重并发症[6-7]。尽管国内外关于 PVST 的研究已非常多，但其机制并未完全阐明。VEGF 属于血小板源生长因子超家族重要成员，可由血管内皮细胞等多种细胞分泌，已有研究证实，VEGF 能够刺激内皮细胞进而促进血小板的黏附和活化[8]，而血小板的黏附聚集是激发凝血和血栓形成的关键性因素。本研究通过免疫组织化学方法观察门静脉高压症患者术后脾静脉及脾脏组织中 VEGF 的表达部位及水平，同时检测血清 VEGF 水平，初步探讨 VEGF 在门静脉高压术后 PVST 形成过程中的作用。
1 资料与方法
1.1 研究对象
纳入研究的患者为 2014 年 1 月至 2018 年 12 月期间在湖北医药学院附属东风医院就诊的肝硬变门静脉高压患者，根据纳入标准及排除标准，共有 146 例患者纳入研究。
1.2 纳入标准及排除标准
1.2.1 纳入标准
明确诊断为肝硬变并出现食管胃底静脉曲张、腹水、脾肿大、脾功能亢进等临床表现而诊断为门静脉高压症，行脾切除+贲门周围血管离断术的患者；患者或委托人知晓研究方案并自愿提供术前及术后血清标本、自愿签署知情同意书。
1.2.2 排除标准
术前肝功能为 Child C 级；术前合并 PVST；合并肝脏恶性肿瘤或其他脏器恶性肿瘤。
1.3 研究方法
1.3.1 血清标本的采集与处理
所有纳入研究患者在术前（1 周内）及术后第 7 天分别于清晨空腹采肘静脉血 5 mL，经处理后取上清采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定 VEGF 水平。血清 VEGF 测定采用 Human VEGF-A 预包被 ELISA 试剂盒，严格按照产品说明书所列实验步骤进行。具体步骤：根据实验孔数量，确定所需的板条数目→加样，100 μL/孔加入样本或标准品→室温孵育 2 h→洗板→加生物素标记的抗体→室温孵育 2 h→洗板→加亲和素-HRP→室温孵育 20 min→洗板→加 TMB 显色液→室温避光孵育 15 min→加终止液终止反应→在检测波长 450 nm 处读取吸光度值（A 值）→计算各样本 VEGF 水平。实验过程中血标本采集经医院伦理委员会审批。
1.3.2 脾静脉及脾脏标本的采集与处理
收集手术过程中切除的脾静脉及脾脏标本，肝硬变门静脉高压症脾脏切除术中，待脾脏取出后，在脾门处取 5 mm×2 mm×1 mm 大小脾静脉组织，在脾下极取 5 mm×5 mm×5 mm 大小脾脏组织，甲醛溶液固定。脾静脉及脾脏标本采用免疫组织化学方法检测 VEGF 表达部位及水平，实验按照免疫组织化学二步法常规染色步骤进行。具体步骤：脱蜡，水化组织切片→3% 过氧化氢孵育 4 min 以阻断内源性过氧化物酶→PBS 洗 1 次，3 min→滴加适当稀释的一抗 VEGF 单克隆抗体（1∶100），4 ℃ 孵育 24 h→弃一抗，用 PBS 洗 3 次→滴加二抗 IgG（1∶200），置室温下孵育 20 min→PBS 洗 3 次→二氨基联苯胺（DAB）显色，光镜观察显色满意后自来水冲洗 5 min 终止显色→常规复染，脱水，封片→用 PBS 液替代一抗进行阴性对照染色。VEGF 阳性细胞为胞浆呈黄色至棕黄色。图像分析在显微镜下进行，每张切片于低倍镜下选取 5 个视野，然后在高倍镜下计数阳性细胞数。染色结果以染色指数评估，染色指数=染色范围评分×染色强度评分。染色范围以染色细胞占细胞总数百分比计算：≤10% 为 0 分，11%～25% 为1 分，26%～50% 为 2 分，51%～75% 为 3 分，≥76%为 4 分；染色强度评分：阴性为 0 分，弱阳性为 1 分，阳性为 2 分，强阳性为 3 分。
1.3.3 PVST 的诊断
所有入选患者于术后第 7 天时行肝胆胰脾超声检查，确定是否存在 PVST，依据是否形成 PVST 分为血栓形成组和非血栓形成组。
1.4 统计学方法
采用 SPSS 17.0 统计软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，2 组间的比较采用 t 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
根据纳入标准及排除标准，共有 146 例肝硬变门静脉高压患者患者纳入研究。其中男 95 例，女 51 例；年龄 34～70 岁，平均 50.7 岁。手术方式为脾切除+贲门周围血管离断术，其中 39 例行腹腔镜手术，73 例行开腹手术。在术后第 7 天时行腹部超声检查，共有 31 例患者形成 PVST，PVST 发生率为 21.2%（31/146）。将此 31 例患者纳入血栓形成组，剩余 115 例患者为非血栓形成组。
2.2 2 组患者血清 VEGF 水平检测结果
根据标准品浓度在 450 nm 处所读得的A 值做出标准曲线，再根据标准曲线计算出各个样本中 VEGF 水平。结果：血栓形成组和非血栓形成组术前血清 VEGF 水平虽有差异，但差异无统计学意义（P>0.05）；术后血栓形成组血清 VEGF 水平显著高于非血栓形成组（P<0.05）。详见表 1。
表1
2 组患者手术前后血清 VEGF 水平检测结果（，ng/L）
2.3 脾静脉及脾脏组织中 VEGF 表达检测结果
在脾静脉中，VEGF 主要定位于脾静脉血管内皮细胞和血管平滑肌细胞胞浆和胞核，以胞浆为主；在脾脏中，VEGF 主要在脾脏内滤泡旁血管、髓索血管和小梁血管壁的内皮细胞和血管平滑肌细胞胞浆内表达。2 组患者脾静脉细胞胞浆均被染色为黄色到棕黄色，呈片状或团块状分布，与非血栓形成组相比，血栓形成组染色更深，阳性细胞数更多，染色指数更高，差异有统计学意义（P<0.05），见图 1a、1b 和表 2。2 组患者脾脏细胞胞浆均被染成黄色到棕黄色，呈片状或团块状分布，与非血栓形成组相比，血栓形成组染色更深，阳性细胞数更多，染色指数更高，差异有统计学意义（P<0.05），见图 1c、1d 和表 2。
图1
示 2 组患者脾静脉及脾脏组织中 VEGF 表达检测结果（免疫组织化学染色 ×200）
a：血栓形成组脾静脉壁 VEGF 表达；b：非血栓形成组脾静脉壁 VEGF 表达；c：血栓形成组脾脏 VEGF 表达；d：非血栓形成组脾脏 VEGF 表达
表2
2 组患者脾静脉及脾脏组织中 VEGF 指数检测结果（）
3 讨论
众所周知，静脉血栓形成需要血流淤滞、内皮细胞损伤和血液高凝状态 3 个条件[9]，其中内皮细胞损伤则是关键因素。正常血管壁的内皮通过释放不同的抗凝和抗血小板因子，如一氧化氮和前列腺素 PGI2 等来防止血栓形成，当血管内皮细胞损伤后，血小板被募集到裸露的胶原蛋白表面，血小板迅速黏附并活化，黏附的血小板释放活性物质，导致更多的血小板黏附和聚集，并促进血小板和内皮细胞的促凝活性，最终形成血栓[10]。因此血小板在血栓形成过程中发挥了关键作用[11]。
VEGF 属于血小板源生长因子超家族重要成员，可由血管内皮细胞等多种细胞分泌，具有高度生物活性，主要作用于血管内皮细胞，具有增加微血管通透性，特异性地与血管内皮细胞受体结合，促进内皮细胞增殖、促血管生成等作用[12]。VEGF 已被证实与多种疾病的发生、发展有关[13]。
VEGF 与血小板关系密切，1997 年，Möhle 等[14]发现在体外凝血酶的刺激下血小板能够释放 VEGF，而后 O’Byrne 等[15]在肾癌患者中证实，血清 VEGF 含量与血小板计数呈正相关，并且血清 VEGF 含量高及血小板计数高的患者往往预后不良。Kim 等[16]在研究肝癌时也得到相似的结论，并发现肝癌合并有门静脉血栓的患者，其血清 VEGF 浓度与血小板计数的比值明显高于无门静脉血栓的患者。
本研究发现，肝硬变门静脉高压症患者行手术治疗后，术后血栓形成组血清 VEGF 水平明显高于非血栓形成组，血栓形成组脾静脉及脾脏组织中 VEGF 表达强于非血栓形成组，表明 VEGF 可能参与了 PVST 的形成过程。分析其机制可能为：肝硬变门静脉高压患者行脾切除术后，失去了脾脏对衰老及功能不全的血小板的破坏及吞噬作用，常常会出现血小板数量升高[17]，脾静脉呈一盲端，血流缓慢，局部血液呈高凝状态下易形成血栓；手术破坏了门静脉系统的解剖结构，损伤了门静脉系统的血管壁，改变了门静脉系统的血流方向，术中钳夹、挤压等操作造成门静脉系统血管内膜损伤，部分内皮细胞脱离和胶原暴露会导致血小板黏附、活化[18]，血小板处于高度激活状态，被激活的血小板会释放大量的 VEGF[19]，而 VEGF 刺激内皮细胞进而进一步促进血小板的黏附和活化[8]，血小板的黏附聚集是激发凝血和血栓形成的关键因素[20]，活化的血小板与中性粒细胞和单核细胞黏附与聚集，促进血液中纤维素的形成，并募集其他血细胞形成血凝块，导致门静脉系统血管内血栓形成。
VEGF 除参与血栓的形成，还可能通过促进血栓机化和促进血管内膜的修复，从而在血栓的溶解与再通过程中发挥重要作用[21]。有学者[9]认为，血栓溶解过程与伤口愈合是类似的：首先是白细胞的募集，大量中性粒细胞侵入血栓内，后被单核细胞所替代，并逐渐在血栓内形成新的毛细血管，多种与血管新生相关的细胞因子起重要调节作用。VEGF 作为血管生成的基础调控因子，在未来 VEGF 基因治疗血管生成相关疾病方面有着更为广阔的前景[22]。
重要声明
利益冲突声明：所有作者均无利益冲突。
作者贡献声明：刘军负责实验设计、实施实验、数据收集与整理、统计分析及文章撰写；胡洪生负责实验设计、指导实验实施、文章修改；吴红伟、付海峰、魏广民和胡伟负责实施实验、标本收集、统计分析等；孙少华指导实验设计、经费等支持。
伦理声明：经医院伦理委员会审批，符合伦理学要求。
