引用本文： 肖国, 姜淮芜, 徐亮, 明锐, 马波. CRYAB 在胃癌组织中的表达及化疗药物对CRYAB mRNA表达的影响. 中国普外基础与临床杂志, 2021, 28(2): 212-218. doi: 10.7507/1007-9424.202005025 复制
胃癌（gastric cancer）是危害我国乃至全球的公共卫生问题，在 2018 年新发 100 多万例胃癌，并有 78.3 万例死亡，使其成为全球第五常见的恶性肿瘤并高居肿瘤死亡率的第 3 位[1]，处于亚洲的中国也是全球胃癌高发地之一[2]。由于胃癌在早期时通常没有明显和特异的征兆，诸多患者就诊时已处于疾病晚期，预后不佳[3]。在过去的 20 年里，胃癌领域中创新了许多诊断与治疗方法，并取得了重大成就，早期胃癌的 5 年生存率甚至可达到 95% 以上[4]，但晚期胃癌患者的预后仍然很差[5]，术后复发和转移是临床面临的主要挑战。因此深入了解胃癌的进展过程对优化临床诊疗至关重要，由此迸发出了诸多新的研究热点，αB-晶体蛋白（alpha B-crystallin，CRYAB）就是其中之一。研究[6]证实，CRYAB 可能在许多恶性肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用。CRYAB 又称 HspB5 蛋白，最早发现于眼球晶状体，其与多种恶性肿瘤的发生和发展相关，例如消化系统的喉鳞癌、食管癌、胃癌、肝癌和结直肠癌，以及其他系统的卵巢癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、骨肉瘤、胶质母细胞瘤等肿瘤有着密切的相关性。它是热休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）家族中最重要的成员之一[7]。HSPs 是一组高度保守的肽类蛋白质，主要属于胞内蛋白并存在于多种类型细胞中，可作为分子伴侣参与蛋白质的合成、折叠、积聚、装配、运输和降解[8]，而 CRYAB 蛋白正是通过调控细胞周期、分化、凋亡、炎症、氧化应激等细胞通路[9]，从而起着抗细胞凋亡[10]、稳定细胞骨架蛋白和骨架网络[11-12]、免疫系统激活[13]等功能。并且有研究[14-15]表明，CRYAB 蛋白与肿瘤化疗药物耐药密切相关，对热应激、氧化应激等诱导的细胞死亡具有保护作用，由此可直接影响化疗效果。胃癌的综合治疗中，术前新辅助化疗和术后化疗的疗效已得到确切证实，但化疗后的疗效却不尽相同，为探究所采用的奥沙利铂、5-氟尿嘧啶等药物作用于患者后是否对胃癌组织中 CRYAB 蛋白的表达水平有影响、从而导致疗效不同，本研究探索了 CRYAB 蛋白在胃癌组织中的表达，以明确 CRYAB 蛋白表达与胃癌患者临床病理学特征的相关性，旨在为优化胃癌的诊疗提供方向及依据。
1 资料及方法
1.1 研究对象
回顾性收集西南医科大学附属第一医院及四川绵阳四〇四医院 2018 年 4 月至 2020 年 3 月期间的行根治性手术切除的 76 例胃癌患者的癌组织及相应的癌旁组织（癌旁组织距离癌组织以远 5 cm，术后病理未查见癌细胞）。纳入标准：① 年龄≤75 岁，术前胃镜病理学检查确诊胃癌，根据病变部位行胃癌根治术，术后病理学检查示有完整切缘，且切缘阴性；② 未进行术前、术中化疗，术前放疗，免疫治疗等抗肿瘤治疗措施；③ 均经术后病理确诊为原发胃癌，并明确了病理学类型；④ 病例资料完整；⑤ 有完整的肿瘤组织和阴性切缘组织的石蜡标本。排除标准：① 早期胃癌行内镜治疗患者 ［内镜下黏膜切除术（EMR）或内镜黏膜下剥离术（ESD）］；② 胃癌术后复发或残胃再发癌患者。收集患者的临床病理学特征相关数据，包括年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤直径、TNM 分期、Borrmann 分型、分化程度、淋巴结转移、浸润深度以及病理 Lauren 分类。76 例胃癌患者的临床病理学特征见表 1。
表1
CRYAB 蛋白在胃癌组织中的表达及其与患者临床学病理特征的关系
此外，前瞻性收集 2018 年 11 月至 2020 年 3 月期间西南医科大学附属第一医院收治的 21 例新辅助化疗后行胃癌根治术的患者以及 26 例未行新辅助化疗患者的胃癌组织标本。纳入标准：① 同上述胃癌纳入标准的第 1–3 项；② 所有病例临床分期为 Ⅱ～Ⅲ 期；③ 无重大基础疾病，能耐受手术及术后临床治疗。排除标准：① 同上述胃癌排除标准的第 1–2 项；② 晚期出现淋巴结转移患者。新辅助化疗患者为术前接受 5-氟尿嘧啶（剂量为 500 mg/m2，连用 4 d）+奥沙利铂（剂量为 130 mg/m2，给药 1 次）化疗方案，3 周为 1 个疗程，总共化疗 2～3 次，停 3～4 周后行胃癌根治术。本研究所有临床数据及资料经患者同意用于科学研究并签署知情同意书。
1.2 主要实验试剂和设备
1.2.1 主要实验试剂
重组 Anti-Alpha B-Crystallin 抗体（成都万道生物科技发展有限公司，克隆号 EPR2752）、TRIzol（美国 Invitrogen 公司，15596-026）、氯仿（中国南京化学试剂有限公司）、异丙醇（中国南京化学试剂有限公司）、70% 乙醇（中国江苏凯基生物技术股份有限公司，KGDN6）、0.1% DEPC Water（中国江苏凯基生物技术股份有限公司，KGDN4500）、cDNA 第一链合成试剂盒（日本 TaKaRa 公司，RR036B）和 One Step TB GreenTM PrimeScriptTM RT-PCR Kit Ⅱ （SYBR Green，日本 TaKaRa 公司，RR086B）。
1.2.2 主要设备
立式压力锅（YXQ-LS-50，中国上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、电热鼓风干燥箱（101AS-3，中国上海圣欣科学仪器有限公司）、分析天平（BL310/BL21S，德国 Sartorius 公司）、超净工作台（SW-CJ-1FD，中国苏州净化设备有限公司）、台式低速离心机（80-2，中国上海医疗器械股份有限公司医疗设备厂）、通风橱（单柜，中国苏州净化设备有限公司）、涡旋振荡器（XW-80A，中国海门其林贝尔仪器制造有限公司）、高速冷冻离心机（ST16R，美国 Thermo Sorvall 公司）、紫外光度仪（UV-2450，日本 SHIMADZU 公司）、普通梯度 PCR 仪（Veriti 96 well Thermal cycler，美国 ABI 公司）、荧光定量 PCR 循环仪（Step one plus Real time-PCR system，美国 ABI 公司）、移液器（10、200 和 1000 μL，德国 Eppendorf 公司）、自动组织脱水机（ASP200S，Leica Biosystems Nussloch GmbH 公司）、生物组织包埋机（YB-6，湖北泰维科技实业有限公司）、新飞冰箱（BCD-208D，北新飞电器集团有限公司）、可微调移液器（10～200 μL，P4808，深圳市爱纳多电子商务有限公司）、生物组织摊烤片机（YT-7FB 型，湖北省孝感亚光医用电子技术有限公司）、电热恒温培养箱（DH5000AB，苏州威尔实验用品有限公司）、切片机（Thermo，北京吉特普伦生物技术有限公司）和研究级光学显微镜（OLYMPUS BX-43，北京泰克汇光科技有限公司）。
1.3 应用免疫组织化学 SP 法检测 CRYAB 蛋白在胃癌组织中的表达
胃癌组织和癌旁组织行免疫组织化学 SP 法染色以检测 CRYAB 蛋白的表达水平。SP 法主要具体操作步骤：石蜡切片 4 μm，脱蜡至水；蒸馏水洗，PBS 浸泡 5 min；抗原修复采用高压抗原修复法，即将切片放入抗原修复液中再置于高压锅中，待喷气后计时 5 min 取出切片冷却到室温，PBS 洗3 次，每次 2 min；使用 3% 的双氧水室温孵育10 min 以消除内源性过氧化物酶活性；PBS 冲洗后滴加一抗 1∶100 稀释，4 ℃ 下孵育过夜，再次 PBS 冲洗后滴加二抗，37 ℃ 孵育 25 min，PBS 冲洗后进行 DAB 显色；最后使用蒸馏水充分冲洗、复染、脱水、透明和封片。
结果判定标准[16]：以细胞胞浆中呈现为棕黄色染色视为 CRYAB 蛋白表达阳性。免疫染色由两名病理医师同时根据阳性细胞的百分比和染色强度进行评分，评分有分歧时进行讨论，讨论结果不一致由第 3 名病理医师进行评定。阳性细胞的百分比分为 4 类：0～10%，1 分；11%～50%，2 分；51%～80%，3 分；81%～100%，4 分。染色强度评分如下：无色，阴性，0 分；淡黄色，弱阳性，1 分；棕黄色，中阳性，2 分；棕褐色，强阳性，3 分。以阳性细胞百分比得分与染色强度对应得分的乘积作为最终染色分数。采用两级评分系统对 CRYAB 蛋白表达染色程度进行量化：总分<4 分为低表达，总分≥4 分为高表达。
1.4 应用实时荧光定量 PCR（real-time-PCR，qPCR）方法检测 CRYAB mRNA 在胃癌组织中的表达
胃癌组织样本收集后置于–78 ℃ 冷藏柜中超低温保存。qPCR 步骤：首先提取胃癌组织标本的 RNA，提取后进行 RNA 浓度和纯度的测定，即取5 μL RNA 样品到 495 μL 1×TE Buffer 中，测定样品在 260 nm 和 280 nm 处的吸光度值（A 值），RNA 的浓度＝A260×稀释倍数×0.04 μg/μL（比色皿光径为1 cm），本实验A260/280=1.9，表明 RNA 浓度以及纯度达标。然后采用逆转录试剂盒进行 cDNA 的第一链合成。设计合成的 PCR 引物，CRYAB 引物正向为 5′-CGCCTCTTTGACCAGTTCTTC-3′，反向为5′-AAGGTAGAAGGGACTCAGGGA-3′，扩增片段长度为 84 bp。采用 GAPDH 为内参照，引物正向为 5′-CAAATTCCATGGCACCGTCA-3′，反向为5′-AGCATCGCCCCACTTGATTT-3′，扩增片段长度为 109 bp。在完成 qPCR 预实验后进行 qPCR 正式实验以测定 CRYAB mRNA 的表达水平，正式实验循环过程中扩增条件为：95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s；循环 40 次。qPCR 实时荧光实验结果采用 2–ΔΔCT 方法计算。
1.5 统计学方法
所有数据结果经过 Excel 整理，采用 SPSS 17.0 统计软件进行统计处理。计数资料采用成组或配对设计的 χ2 检验，计量资料采用两独立样本比较的 t 检验（本研究数据符合正态分布及方差齐性条件）。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 CRYAB 蛋白在胃癌组织及其癌旁组织中的表达结果
免疫组织化学染色（图 1a 和图 1b）结果显示，CRYAB 蛋白的染色部位主要是细胞胞浆，呈现为棕黄色或棕褐色，即 CRYAB 蛋白的表达主要是位于细胞胞浆中。76 例胃癌组织中，CRYAB 蛋白高表达 51 例（67.1%），癌旁组织高表达 32 例（42.1%），CRYAB 蛋白在胃癌组织中的高表达率高于癌旁组织（χ2=9.581，P=0.002）。
图1
示 CRYAB 蛋白在胃癌组织及其癌旁组织中的表达（SP ×400），以及新辅助化疗组和未行新辅助化疗组胃癌组织中 CRYAB mRNA 的表达水平
a：胃癌组织中 CRYAB 蛋白呈阳性表达；b：癌旁组织中 CRYAB 蛋白呈阴性表达；c：新辅助化疗组和未行新辅助化疗组胃癌组织中 CRYAB mRNA 的表达水平
2.2 胃癌组织中 CRYAB 蛋白的表达与胃癌患者临床病理学特征的关系
CRYAB 蛋白在胃癌组织中的高表达与患者年龄、性别、肿瘤部位及肿瘤直径均无关（P>0.05），而与肿瘤 Borrmann 分型、TNM 分期、分化程度、淋巴结转移、浸润深度和 Lauren 分类均有关（P<0.05），Borrmann 分型Ⅲ+Ⅳ型者的高表达率高于 Ⅰ+Ⅱ 型者，TNM Ⅲ+Ⅳ 期者的高表达率高于 Ⅰ+Ⅱ 期者，低+未分化者的高表达率高于高+中分化者，有淋巴结转移者的高表达率高于无淋巴结转移者，浸润深度为浆膜层+胃全层者的高表达率高于黏膜层+固有肌层者，Lauren 分类为弥漫型者的高表达率较高，肠型的高表达率较低。具体见表 1。
2.3 新辅助化疗组和未行新辅助化疗组胃癌组织中 CRYAB mRNA 的表达水平比较
对 21 例新辅助化疗后的胃癌癌组织及 26 例未行新辅助化疗患者的胃癌组织的 CRYAB mRNA 表达水平进行检测的结果见图 1c。新辅助化疗组的 CRYAB mRNA 的表达水平为 1.24±0.22，高于未行新辅助化疗组的 0.78±0.16，差异具有统计学意义（t=8.37，P<0.001）。
3 讨论
在 1989 年，Iwaki 等[17]发表了第 1 篇关于 CRYAB 蛋白在病理状态下于非晶体组织中异常表达的文章，随后关于 CRYAB 蛋白的研究逐渐深入，自 2000 年开始，对其部分作用机制已有了一些基础的理解，特别是在白内障、心肌病[18-19]等方面有了一些重大进展。随后 2 年，关于 CRYAB 蛋白与肿瘤的相关性被提出，最早研究的肿瘤有我们熟知的卵巢癌[20]、间变性甲状腺癌[21]、胶质母细胞瘤[22]、乳腺癌[23]等。有研究[18]证明，CRYAB 蛋白是一种有效的负调控因子，可以抑制免疫系统和中枢神经系统（CNS）中的多种炎症通路，并且提示 CRYAB 蛋白具有抗凋亡作用。此外研究[19]发现，CRYAB 蛋白可作为血管内皮生长因子 A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）的伴侣蛋白，在血管生成中发挥重要作用，并证明了其在肿瘤侵袭和转移方面所存在的促进作用及有着作为治疗靶点的潜力。有研究[24]发现，M2 巨噬细胞通过上调 CRYAB 基因表达并激活细胞外调节蛋白激酶 1/2/原癌基因 Fra-1/slug 蛋白（ERK1/2/Fra-1/slug）信号通路，通过上皮细胞-间充质转化（EMT）促进肺癌的恶性进展；而且也有研究[25]表明，CRYAB 蛋白与结直肠癌不良预后也相关，其通过 ERK 信号通路促进 EMT 进程。它是一个潜在的肿瘤生物标志物并且关系到结直肠癌（CRC）的诊断和预后。EMT 指的是上皮细胞在一些因素的作用下，失去极性及细胞间紧密连接和黏附连接，获得了浸润性和游走迁移能力，变成具备间质细胞形态和特性的细胞学改变。EMT 是诸多肿瘤进展的重要路径之一，众所周知胃癌也与 EMT 有着不可分割的联系，由此可以推测，CRYAB 蛋白可能通过 EMT 促进胃癌的发生发展。以上结果都提示 CRYAB 蛋白与胃癌的发生发展关系密切。而这些推断都与本研究结果相同，本研究结果表明，CRYAB 蛋白在胃癌组织中的高表达率高于癌旁组织（P=0.002）。
通过对 CRYAB 蛋白机制的研究，发现 CRYAB 蛋白最重要的作用是其抗凋亡多肽在各种条件下对细胞凋亡产生影响，但它不仅仅是在肿瘤的发生中有着积极作用。研究[26-27]表明，CRYAB 蛋白在肿瘤发展中也是十分重要的，它直接关系到肿瘤的转移和复发，这涉及到患者的术后生存时间。为了进一步探索 CRYAB 蛋白与胃癌的相关性，本研究探索了 CRYAB 蛋白在胃癌组织中的表达与患者临床病理学特征的关系，结果发现，CRYAB 蛋白在胃癌组织中的高表达与患者年龄、性别、肿瘤直径和肿瘤部位均无关（P>0.05），而与肿瘤 TNM 分期、分化程度、浸润深度、Borrmann 分型及淋巴结转移有关（P<0.05）。同时本研究通过病理 Lauren 分类的组间分析发现，CRYAB 蛋白在胃癌肠型中的高表达率与弥漫型的差异存在统计学意义（P<0.05），而混合型与弥漫型的 CRYAB 蛋白的高表达率比较差异无统计学意义（P>0.05），也就是说，CRYAB 蛋白的高表达与胃癌病理组织学分级密切相关，可能对胃癌的进展起到至关重要的作用。本研究除了我们熟知并且常用来统计的分类外，在新加入的 Borrmann 分型和病理 Lauren 分类这两项中也有了新的发现。就 Borrmann 分型来讲，其分级越高，越能体现胃癌组织的肿瘤界限的不确定性，更具有侵袭性，并且分化程度通常较低，与术后肿瘤复发转移密切相关，本研究结果侧面也印证了这一点。从对病理 Lauren 分类的分析来看，肠型腺癌与弥漫型（低分化癌）中 CRYAB 蛋白的表达情况存在差异，通常肠型腺癌的恶性程度较后者较低，预后也较好。加上诸多的研究[26-28]证实，CRYAB 蛋白可作为多种肿瘤预后的独立因素，可作为评估患者预后的指标，由此可以推断出，CRYAB 与胃癌的预后也是相关的，这都与本研究推断一致。因而检测 CRYAB 蛋白在胃癌组织中的表达情况可以对临床治疗起到一定的指导作用。
有学者[14]在人类恶性黑色素瘤细胞株中进行顺铂、依托泊苷、福莫司汀及三者衍生物的耐药性实验，研究发现，富含半胱氨酸蛋白 61（cysteine rich 61，CYR61）、腺苷高半胱氨酸酶 1（Adenosylhomocysteinase1，AHCYL1）、膜棕榈酰化蛋白 1（membrane-palmitoylated protein，MPP1）以及几个与凋亡相关的基因，尤其是 CRYAB 基因，在耐药实验中均体现出表达差异，展示出其显著的对抗 DNA 损伤药物的耐药性。Kase 等[15]研究发现，CRYAB 蛋白在化疗后视网膜母细胞瘤中高表达，能减少抗癌药物产生的凋亡信号，从而保护肿瘤细胞。也有研究[29]发现，在卵巢癌中顺铂诱导的细胞凋亡程度由于 CRYAB 蛋白表达的上调而明显下降。研究[30]证实，miR-491 通过靶向 CRYAB 蛋白可抑制骨肉瘤肺转移和化疗耐药，过表达 miR-491 可通过作用于 CRYAB 蛋白而抑制骨肉瘤细胞的肺转移，而增强顺铂诱导的肿瘤生长抑制和凋亡。以上这些研究都证实了 CRYAB 蛋白在细胞保护方面及抗凋亡方面中的作用。本研究针对 21 例新辅助化疗后行胃癌根治术患者的癌组织以及 26 例未行新辅助化疗患者的癌组织标本，采用 qPCR 法检测 CRYAB mRNA 的表达水平，结果发现，化疗后癌组织中 CRYAB mRNA 的表达水平明显高于未行化疗患者，二者比较差异有统计学意义（P<0.001）。这与前人的研究[14-15, 29-30]结果相一致，即化疗后 CRYAB 蛋白在恶性肿瘤中的表达将会上调。可以看出，使用化疗药物后，肿瘤细胞可能会通过多种不同的途径激发其自我保护功能，降低凋亡信号对自身的影响，上调 CRYAB 蛋白的表达，有助于肿瘤细胞的自我保护，一定程度上减少细胞的凋亡，由此推论，化疗药物耐药的原因之一也正是因为不同患者 CRYAB mRNA 的表达水平有所不同导致的，CRYAB mRNA 通过多途径对化疗效果起到不同程度的影响。有研究[31]指出，CRYAB 蛋白可保护机体免受异常折叠蛋白或氧化炎症环境的毒害，体现了 CRYAB 蛋白具有保护细胞的作用，同时其在癌细胞中表达时具有致瘤性。目前一些新兴策略提出，可刺激蛋白的有益表达或者改变其在病理情况下所起到的作用，从而达到临床治疗的效果。例如，可通过模拟合成特定的组成 CRYAB 蛋白的低聚化合物来达到对 CRYAB 蛋白表达进行调节的目的，并且在不久的将来实现药物的临床试验，最终用于临床治疗。也有研究[32]对宫颈癌相关转录组数据进行 meta 分析，将基因表达谱与基因组级生物分子网络相结合，在 RNA（mRNA 和 miRNA）、蛋白（受体、转录因子等）、代谢物水平等方面揭示了宫颈癌中 CRYAB 蛋白是新的候选生物标志物和潜在的治疗靶点。所以，研制 CRYAB 基因位点靶向抑制药物，并与化疗药物合用，能实现更优化有效的胃癌化疗用药策略，可能对改善化疗药物的耐药、提高术前及术后化疗疗效有巨大帮助。
综上，本研究在蛋白及基因层面探索了 CRYAB 蛋白在胃癌组织中的表达情况，发现胃癌的发生发展与 CRYAB 蛋白的高水平表达密切相关，同时推测化疗耐药的原因之一可能与使用化疗药物后肿瘤细胞中 CRYAB mRNA 表达上调相关，从而保护肿瘤细胞，体现出其抗凋亡特性，但需要更大的样本量来降低偏倚以及对实际化疗效果进行评价，从而证实这一观点。但可以指出的是，CRYAB 蛋白不论是在胃癌的诊断、临床治疗等方面具有重要意义和广阔的应用前景，同时在评估患者预后及提供个体化随诊方案方面也有着指导作用。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：肖国，实验设计、资料采集、各项实验的具体实施和论文编撰；姜淮芜，主持科研施行、实验指导和科研质量控制；徐亮，实验指导和协助临床资料采集；明锐，协助实施实验和资料采集；马波，协助实施实验。
伦理声明：本研究已通过西南医科大学附属第一医院（批文编号：KY2020185）和四川绵阳四〇四医院的伦理审核批准（批文编号：005）。
志谢：非常感谢伏阳燕老师和陈俐巧老师对实验的指导和对具体实验操作的协助，感谢许婷婷老师的指导和对切片观察的协助。
胃癌（gastric cancer）是危害我国乃至全球的公共卫生问题，在 2018 年新发 100 多万例胃癌，并有 78.3 万例死亡，使其成为全球第五常见的恶性肿瘤并高居肿瘤死亡率的第 3 位[1]，处于亚洲的中国也是全球胃癌高发地之一[2]。由于胃癌在早期时通常没有明显和特异的征兆，诸多患者就诊时已处于疾病晚期，预后不佳[3]。在过去的 20 年里，胃癌领域中创新了许多诊断与治疗方法，并取得了重大成就，早期胃癌的 5 年生存率甚至可达到 95% 以上[4]，但晚期胃癌患者的预后仍然很差[5]，术后复发和转移是临床面临的主要挑战。因此深入了解胃癌的进展过程对优化临床诊疗至关重要，由此迸发出了诸多新的研究热点，αB-晶体蛋白（alpha B-crystallin，CRYAB）就是其中之一。研究[6]证实，CRYAB 可能在许多恶性肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用。CRYAB 又称 HspB5 蛋白，最早发现于眼球晶状体，其与多种恶性肿瘤的发生和发展相关，例如消化系统的喉鳞癌、食管癌、胃癌、肝癌和结直肠癌，以及其他系统的卵巢癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、骨肉瘤、胶质母细胞瘤等肿瘤有着密切的相关性。它是热休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）家族中最重要的成员之一[7]。HSPs 是一组高度保守的肽类蛋白质，主要属于胞内蛋白并存在于多种类型细胞中，可作为分子伴侣参与蛋白质的合成、折叠、积聚、装配、运输和降解[8]，而 CRYAB 蛋白正是通过调控细胞周期、分化、凋亡、炎症、氧化应激等细胞通路[9]，从而起着抗细胞凋亡[10]、稳定细胞骨架蛋白和骨架网络[11-12]、免疫系统激活[13]等功能。并且有研究[14-15]表明，CRYAB 蛋白与肿瘤化疗药物耐药密切相关，对热应激、氧化应激等诱导的细胞死亡具有保护作用，由此可直接影响化疗效果。胃癌的综合治疗中，术前新辅助化疗和术后化疗的疗效已得到确切证实，但化疗后的疗效却不尽相同，为探究所采用的奥沙利铂、5-氟尿嘧啶等药物作用于患者后是否对胃癌组织中 CRYAB 蛋白的表达水平有影响、从而导致疗效不同，本研究探索了 CRYAB 蛋白在胃癌组织中的表达，以明确 CRYAB 蛋白表达与胃癌患者临床病理学特征的相关性，旨在为优化胃癌的诊疗提供方向及依据。
1 资料及方法
1.1 研究对象
回顾性收集西南医科大学附属第一医院及四川绵阳四〇四医院 2018 年 4 月至 2020 年 3 月期间的行根治性手术切除的 76 例胃癌患者的癌组织及相应的癌旁组织（癌旁组织距离癌组织以远 5 cm，术后病理未查见癌细胞）。纳入标准：① 年龄≤75 岁，术前胃镜病理学检查确诊胃癌，根据病变部位行胃癌根治术，术后病理学检查示有完整切缘，且切缘阴性；② 未进行术前、术中化疗，术前放疗，免疫治疗等抗肿瘤治疗措施；③ 均经术后病理确诊为原发胃癌，并明确了病理学类型；④ 病例资料完整；⑤ 有完整的肿瘤组织和阴性切缘组织的石蜡标本。排除标准：① 早期胃癌行内镜治疗患者 ［内镜下黏膜切除术（EMR）或内镜黏膜下剥离术（ESD）］；② 胃癌术后复发或残胃再发癌患者。收集患者的临床病理学特征相关数据，包括年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤直径、TNM 分期、Borrmann 分型、分化程度、淋巴结转移、浸润深度以及病理 Lauren 分类。76 例胃癌患者的临床病理学特征见表 1。
表1
CRYAB 蛋白在胃癌组织中的表达及其与患者临床学病理特征的关系
此外，前瞻性收集 2018 年 11 月至 2020 年 3 月期间西南医科大学附属第一医院收治的 21 例新辅助化疗后行胃癌根治术的患者以及 26 例未行新辅助化疗患者的胃癌组织标本。纳入标准：① 同上述胃癌纳入标准的第 1–3 项；② 所有病例临床分期为 Ⅱ～Ⅲ 期；③ 无重大基础疾病，能耐受手术及术后临床治疗。排除标准：① 同上述胃癌排除标准的第 1–2 项；② 晚期出现淋巴结转移患者。新辅助化疗患者为术前接受 5-氟尿嘧啶（剂量为 500 mg/m2，连用 4 d）+奥沙利铂（剂量为 130 mg/m2，给药 1 次）化疗方案，3 周为 1 个疗程，总共化疗 2～3 次，停 3～4 周后行胃癌根治术。本研究所有临床数据及资料经患者同意用于科学研究并签署知情同意书。
1.2 主要实验试剂和设备
1.2.1 主要实验试剂
重组 Anti-Alpha B-Crystallin 抗体（成都万道生物科技发展有限公司，克隆号 EPR2752）、TRIzol（美国 Invitrogen 公司，15596-026）、氯仿（中国南京化学试剂有限公司）、异丙醇（中国南京化学试剂有限公司）、70% 乙醇（中国江苏凯基生物技术股份有限公司，KGDN6）、0.1% DEPC Water（中国江苏凯基生物技术股份有限公司，KGDN4500）、cDNA 第一链合成试剂盒（日本 TaKaRa 公司，RR036B）和 One Step TB GreenTM PrimeScriptTM RT-PCR Kit Ⅱ （SYBR Green，日本 TaKaRa 公司，RR086B）。
1.2.2 主要设备
立式压力锅（YXQ-LS-50，中国上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、电热鼓风干燥箱（101AS-3，中国上海圣欣科学仪器有限公司）、分析天平（BL310/BL21S，德国 Sartorius 公司）、超净工作台（SW-CJ-1FD，中国苏州净化设备有限公司）、台式低速离心机（80-2，中国上海医疗器械股份有限公司医疗设备厂）、通风橱（单柜，中国苏州净化设备有限公司）、涡旋振荡器（XW-80A，中国海门其林贝尔仪器制造有限公司）、高速冷冻离心机（ST16R，美国 Thermo Sorvall 公司）、紫外光度仪（UV-2450，日本 SHIMADZU 公司）、普通梯度 PCR 仪（Veriti 96 well Thermal cycler，美国 ABI 公司）、荧光定量 PCR 循环仪（Step one plus Real time-PCR system，美国 ABI 公司）、移液器（10、200 和 1000 μL，德国 Eppendorf 公司）、自动组织脱水机（ASP200S，Leica Biosystems Nussloch GmbH 公司）、生物组织包埋机（YB-6，湖北泰维科技实业有限公司）、新飞冰箱（BCD-208D，北新飞电器集团有限公司）、可微调移液器（10～200 μL，P4808，深圳市爱纳多电子商务有限公司）、生物组织摊烤片机（YT-7FB 型，湖北省孝感亚光医用电子技术有限公司）、电热恒温培养箱（DH5000AB，苏州威尔实验用品有限公司）、切片机（Thermo，北京吉特普伦生物技术有限公司）和研究级光学显微镜（OLYMPUS BX-43，北京泰克汇光科技有限公司）。
1.3 应用免疫组织化学 SP 法检测 CRYAB 蛋白在胃癌组织中的表达
胃癌组织和癌旁组织行免疫组织化学 SP 法染色以检测 CRYAB 蛋白的表达水平。SP 法主要具体操作步骤：石蜡切片 4 μm，脱蜡至水；蒸馏水洗，PBS 浸泡 5 min；抗原修复采用高压抗原修复法，即将切片放入抗原修复液中再置于高压锅中，待喷气后计时 5 min 取出切片冷却到室温，PBS 洗3 次，每次 2 min；使用 3% 的双氧水室温孵育10 min 以消除内源性过氧化物酶活性；PBS 冲洗后滴加一抗 1∶100 稀释，4 ℃ 下孵育过夜，再次 PBS 冲洗后滴加二抗，37 ℃ 孵育 25 min，PBS 冲洗后进行 DAB 显色；最后使用蒸馏水充分冲洗、复染、脱水、透明和封片。
结果判定标准[16]：以细胞胞浆中呈现为棕黄色染色视为 CRYAB 蛋白表达阳性。免疫染色由两名病理医师同时根据阳性细胞的百分比和染色强度进行评分，评分有分歧时进行讨论，讨论结果不一致由第 3 名病理医师进行评定。阳性细胞的百分比分为 4 类：0～10%，1 分；11%～50%，2 分；51%～80%，3 分；81%～100%，4 分。染色强度评分如下：无色，阴性，0 分；淡黄色，弱阳性，1 分；棕黄色，中阳性，2 分；棕褐色，强阳性，3 分。以阳性细胞百分比得分与染色强度对应得分的乘积作为最终染色分数。采用两级评分系统对 CRYAB 蛋白表达染色程度进行量化：总分<4 分为低表达，总分≥4 分为高表达。
1.4 应用实时荧光定量 PCR（real-time-PCR，qPCR）方法检测 CRYAB mRNA 在胃癌组织中的表达
胃癌组织样本收集后置于–78 ℃ 冷藏柜中超低温保存。qPCR 步骤：首先提取胃癌组织标本的 RNA，提取后进行 RNA 浓度和纯度的测定，即取5 μL RNA 样品到 495 μL 1×TE Buffer 中，测定样品在 260 nm 和 280 nm 处的吸光度值（A 值），RNA 的浓度＝A260×稀释倍数×0.04 μg/μL（比色皿光径为1 cm），本实验A260/280=1.9，表明 RNA 浓度以及纯度达标。然后采用逆转录试剂盒进行 cDNA 的第一链合成。设计合成的 PCR 引物，CRYAB 引物正向为 5′-CGCCTCTTTGACCAGTTCTTC-3′，反向为5′-AAGGTAGAAGGGACTCAGGGA-3′，扩增片段长度为 84 bp。采用 GAPDH 为内参照，引物正向为 5′-CAAATTCCATGGCACCGTCA-3′，反向为5′-AGCATCGCCCCACTTGATTT-3′，扩增片段长度为 109 bp。在完成 qPCR 预实验后进行 qPCR 正式实验以测定 CRYAB mRNA 的表达水平，正式实验循环过程中扩增条件为：95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s；循环 40 次。qPCR 实时荧光实验结果采用 2–ΔΔCT 方法计算。
1.5 统计学方法
所有数据结果经过 Excel 整理，采用 SPSS 17.0 统计软件进行统计处理。计数资料采用成组或配对设计的 χ2 检验，计量资料采用两独立样本比较的 t 检验（本研究数据符合正态分布及方差齐性条件）。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 CRYAB 蛋白在胃癌组织及其癌旁组织中的表达结果
免疫组织化学染色（图 1a 和图 1b）结果显示，CRYAB 蛋白的染色部位主要是细胞胞浆，呈现为棕黄色或棕褐色，即 CRYAB 蛋白的表达主要是位于细胞胞浆中。76 例胃癌组织中，CRYAB 蛋白高表达 51 例（67.1%），癌旁组织高表达 32 例（42.1%），CRYAB 蛋白在胃癌组织中的高表达率高于癌旁组织（χ2=9.581，P=0.002）。
图1
示 CRYAB 蛋白在胃癌组织及其癌旁组织中的表达（SP ×400），以及新辅助化疗组和未行新辅助化疗组胃癌组织中 CRYAB mRNA 的表达水平
a：胃癌组织中 CRYAB 蛋白呈阳性表达；b：癌旁组织中 CRYAB 蛋白呈阴性表达；c：新辅助化疗组和未行新辅助化疗组胃癌组织中 CRYAB mRNA 的表达水平
2.2 胃癌组织中 CRYAB 蛋白的表达与胃癌患者临床病理学特征的关系
CRYAB 蛋白在胃癌组织中的高表达与患者年龄、性别、肿瘤部位及肿瘤直径均无关（P>0.05），而与肿瘤 Borrmann 分型、TNM 分期、分化程度、淋巴结转移、浸润深度和 Lauren 分类均有关（P<0.05），Borrmann 分型Ⅲ+Ⅳ型者的高表达率高于 Ⅰ+Ⅱ 型者，TNM Ⅲ+Ⅳ 期者的高表达率高于 Ⅰ+Ⅱ 期者，低+未分化者的高表达率高于高+中分化者，有淋巴结转移者的高表达率高于无淋巴结转移者，浸润深度为浆膜层+胃全层者的高表达率高于黏膜层+固有肌层者，Lauren 分类为弥漫型者的高表达率较高，肠型的高表达率较低。具体见表 1。
2.3 新辅助化疗组和未行新辅助化疗组胃癌组织中 CRYAB mRNA 的表达水平比较
对 21 例新辅助化疗后的胃癌癌组织及 26 例未行新辅助化疗患者的胃癌组织的 CRYAB mRNA 表达水平进行检测的结果见图 1c。新辅助化疗组的 CRYAB mRNA 的表达水平为 1.24±0.22，高于未行新辅助化疗组的 0.78±0.16，差异具有统计学意义（t=8.37，P<0.001）。
3 讨论
在 1989 年，Iwaki 等[17]发表了第 1 篇关于 CRYAB 蛋白在病理状态下于非晶体组织中异常表达的文章，随后关于 CRYAB 蛋白的研究逐渐深入，自 2000 年开始，对其部分作用机制已有了一些基础的理解，特别是在白内障、心肌病[18-19]等方面有了一些重大进展。随后 2 年，关于 CRYAB 蛋白与肿瘤的相关性被提出，最早研究的肿瘤有我们熟知的卵巢癌[20]、间变性甲状腺癌[21]、胶质母细胞瘤[22]、乳腺癌[23]等。有研究[18]证明，CRYAB 蛋白是一种有效的负调控因子，可以抑制免疫系统和中枢神经系统（CNS）中的多种炎症通路，并且提示 CRYAB 蛋白具有抗凋亡作用。此外研究[19]发现，CRYAB 蛋白可作为血管内皮生长因子 A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）的伴侣蛋白，在血管生成中发挥重要作用，并证明了其在肿瘤侵袭和转移方面所存在的促进作用及有着作为治疗靶点的潜力。有研究[24]发现，M2 巨噬细胞通过上调 CRYAB 基因表达并激活细胞外调节蛋白激酶 1/2/原癌基因 Fra-1/slug 蛋白（ERK1/2/Fra-1/slug）信号通路，通过上皮细胞-间充质转化（EMT）促进肺癌的恶性进展；而且也有研究[25]表明，CRYAB 蛋白与结直肠癌不良预后也相关，其通过 ERK 信号通路促进 EMT 进程。它是一个潜在的肿瘤生物标志物并且关系到结直肠癌（CRC）的诊断和预后。EMT 指的是上皮细胞在一些因素的作用下，失去极性及细胞间紧密连接和黏附连接，获得了浸润性和游走迁移能力，变成具备间质细胞形态和特性的细胞学改变。EMT 是诸多肿瘤进展的重要路径之一，众所周知胃癌也与 EMT 有着不可分割的联系，由此可以推测，CRYAB 蛋白可能通过 EMT 促进胃癌的发生发展。以上结果都提示 CRYAB 蛋白与胃癌的发生发展关系密切。而这些推断都与本研究结果相同，本研究结果表明，CRYAB 蛋白在胃癌组织中的高表达率高于癌旁组织（P=0.002）。
通过对 CRYAB 蛋白机制的研究，发现 CRYAB 蛋白最重要的作用是其抗凋亡多肽在各种条件下对细胞凋亡产生影响，但它不仅仅是在肿瘤的发生中有着积极作用。研究[26-27]表明，CRYAB 蛋白在肿瘤发展中也是十分重要的，它直接关系到肿瘤的转移和复发，这涉及到患者的术后生存时间。为了进一步探索 CRYAB 蛋白与胃癌的相关性，本研究探索了 CRYAB 蛋白在胃癌组织中的表达与患者临床病理学特征的关系，结果发现，CRYAB 蛋白在胃癌组织中的高表达与患者年龄、性别、肿瘤直径和肿瘤部位均无关（P>0.05），而与肿瘤 TNM 分期、分化程度、浸润深度、Borrmann 分型及淋巴结转移有关（P<0.05）。同时本研究通过病理 Lauren 分类的组间分析发现，CRYAB 蛋白在胃癌肠型中的高表达率与弥漫型的差异存在统计学意义（P<0.05），而混合型与弥漫型的 CRYAB 蛋白的高表达率比较差异无统计学意义（P>0.05），也就是说，CRYAB 蛋白的高表达与胃癌病理组织学分级密切相关，可能对胃癌的进展起到至关重要的作用。本研究除了我们熟知并且常用来统计的分类外，在新加入的 Borrmann 分型和病理 Lauren 分类这两项中也有了新的发现。就 Borrmann 分型来讲，其分级越高，越能体现胃癌组织的肿瘤界限的不确定性，更具有侵袭性，并且分化程度通常较低，与术后肿瘤复发转移密切相关，本研究结果侧面也印证了这一点。从对病理 Lauren 分类的分析来看，肠型腺癌与弥漫型（低分化癌）中 CRYAB 蛋白的表达情况存在差异，通常肠型腺癌的恶性程度较后者较低，预后也较好。加上诸多的研究[26-28]证实，CRYAB 蛋白可作为多种肿瘤预后的独立因素，可作为评估患者预后的指标，由此可以推断出，CRYAB 与胃癌的预后也是相关的，这都与本研究推断一致。因而检测 CRYAB 蛋白在胃癌组织中的表达情况可以对临床治疗起到一定的指导作用。
有学者[14]在人类恶性黑色素瘤细胞株中进行顺铂、依托泊苷、福莫司汀及三者衍生物的耐药性实验，研究发现，富含半胱氨酸蛋白 61（cysteine rich 61，CYR61）、腺苷高半胱氨酸酶 1（Adenosylhomocysteinase1，AHCYL1）、膜棕榈酰化蛋白 1（membrane-palmitoylated protein，MPP1）以及几个与凋亡相关的基因，尤其是 CRYAB 基因，在耐药实验中均体现出表达差异，展示出其显著的对抗 DNA 损伤药物的耐药性。Kase 等[15]研究发现，CRYAB 蛋白在化疗后视网膜母细胞瘤中高表达，能减少抗癌药物产生的凋亡信号，从而保护肿瘤细胞。也有研究[29]发现，在卵巢癌中顺铂诱导的细胞凋亡程度由于 CRYAB 蛋白表达的上调而明显下降。研究[30]证实，miR-491 通过靶向 CRYAB 蛋白可抑制骨肉瘤肺转移和化疗耐药，过表达 miR-491 可通过作用于 CRYAB 蛋白而抑制骨肉瘤细胞的肺转移，而增强顺铂诱导的肿瘤生长抑制和凋亡。以上这些研究都证实了 CRYAB 蛋白在细胞保护方面及抗凋亡方面中的作用。本研究针对 21 例新辅助化疗后行胃癌根治术患者的癌组织以及 26 例未行新辅助化疗患者的癌组织标本，采用 qPCR 法检测 CRYAB mRNA 的表达水平，结果发现，化疗后癌组织中 CRYAB mRNA 的表达水平明显高于未行化疗患者，二者比较差异有统计学意义（P<0.001）。这与前人的研究[14-15, 29-30]结果相一致，即化疗后 CRYAB 蛋白在恶性肿瘤中的表达将会上调。可以看出，使用化疗药物后，肿瘤细胞可能会通过多种不同的途径激发其自我保护功能，降低凋亡信号对自身的影响，上调 CRYAB 蛋白的表达，有助于肿瘤细胞的自我保护，一定程度上减少细胞的凋亡，由此推论，化疗药物耐药的原因之一也正是因为不同患者 CRYAB mRNA 的表达水平有所不同导致的，CRYAB mRNA 通过多途径对化疗效果起到不同程度的影响。有研究[31]指出，CRYAB 蛋白可保护机体免受异常折叠蛋白或氧化炎症环境的毒害，体现了 CRYAB 蛋白具有保护细胞的作用，同时其在癌细胞中表达时具有致瘤性。目前一些新兴策略提出，可刺激蛋白的有益表达或者改变其在病理情况下所起到的作用，从而达到临床治疗的效果。例如，可通过模拟合成特定的组成 CRYAB 蛋白的低聚化合物来达到对 CRYAB 蛋白表达进行调节的目的，并且在不久的将来实现药物的临床试验，最终用于临床治疗。也有研究[32]对宫颈癌相关转录组数据进行 meta 分析，将基因表达谱与基因组级生物分子网络相结合，在 RNA（mRNA 和 miRNA）、蛋白（受体、转录因子等）、代谢物水平等方面揭示了宫颈癌中 CRYAB 蛋白是新的候选生物标志物和潜在的治疗靶点。所以，研制 CRYAB 基因位点靶向抑制药物，并与化疗药物合用，能实现更优化有效的胃癌化疗用药策略，可能对改善化疗药物的耐药、提高术前及术后化疗疗效有巨大帮助。
综上，本研究在蛋白及基因层面探索了 CRYAB 蛋白在胃癌组织中的表达情况，发现胃癌的发生发展与 CRYAB 蛋白的高水平表达密切相关，同时推测化疗耐药的原因之一可能与使用化疗药物后肿瘤细胞中 CRYAB mRNA 表达上调相关，从而保护肿瘤细胞，体现出其抗凋亡特性，但需要更大的样本量来降低偏倚以及对实际化疗效果进行评价，从而证实这一观点。但可以指出的是，CRYAB 蛋白不论是在胃癌的诊断、临床治疗等方面具有重要意义和广阔的应用前景，同时在评估患者预后及提供个体化随诊方案方面也有着指导作用。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：肖国，实验设计、资料采集、各项实验的具体实施和论文编撰；姜淮芜，主持科研施行、实验指导和科研质量控制；徐亮，实验指导和协助临床资料采集；明锐，协助实施实验和资料采集；马波，协助实施实验。
伦理声明：本研究已通过西南医科大学附属第一医院（批文编号：KY2020185）和四川绵阳四〇四医院的伦理审核批准（批文编号：005）。
志谢：非常感谢伏阳燕老师和陈俐巧老师对实验的指导和对具体实验操作的协助，感谢许婷婷老师的指导和对切片观察的协助。
