引用本文： 刘文能, 杨百仞, 李东, 向立历, 阳川华. 外周血中miRNA-196a在进展期胃癌中的表达及其临床及生物学意义. 中国普外基础与临床杂志, 2021, 28(8): 1025-1030. doi: 10.7507/1007-9424.202011033 复制
胃癌是最为常见的消化道恶性肿瘤之一，具有发病率高、早期诊断率低、转移率高等特点[1-3]。发现新的用于胃癌早期诊断、揭示预后的生物标志物有望改变上述现状[4-6]。miRNA 是一类长度为 20～25 个碱基的非编码 RNA，通过不完全碱基互补配对方式结合到靶基因 RNA 3′ 非翻译区以直接降解或者抑制 RNA 翻译方式发挥基因表达调控作用。miRNA 几乎参与了机体所有的生理、病理进程，包括肿瘤的发生发展[7-10]，在肿瘤发生发展过程中，miRNA 扮演促癌基因和抑癌基因的双重角色[11-13]。由于 miRNA 具有在组织及各种体液中的表达极其稳定的特性，因此越来越多的研究将其作为一种候选的疾病诊断标志物[14-16]。其中 miRNA-196a 被发现在许多肿瘤中异常表达，包括结直肠癌[17-18]、乳腺癌[19]、胰腺癌[20]、肺癌[21]、胃癌[22]等。有研究[23]认为，miRNA-196a 有望作为一种潜在的早期胃癌诊断标志物。本研究旨在进一步明确胃癌患者外周血浆中 miRNA-196a 的表达变化情况，以及其表达水平与胃癌临床病理学特征特别是转移、侵袭之间的关系；同时通过体外实验观察 miRNA-196a 对胃癌细胞株 MGC-803 侵袭能力的影响。
1 资料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 胃癌组纳入标准
① 经病理学检查证实为胃癌患者；② 术前未接受放疗、化疗；③ 接受手术治疗者；④ 具有完整资料者。排除标准：① 合并其他肿瘤患者；② 术前接受过放疗、化疗；③ 围手术期 1 个月内死亡者；④ 资料不全者。
1.1.2 胃良性病变组纳入标准
① 经病理学检查证实为胃良性病变患者；② 未合并其他肿瘤；③ 接受手术治疗者。排除标准：① 合并其他肿瘤患者；② 围手术期 1 个月内死亡者。
1.1.3 研究对象的资料
胃癌的诊断基于术前、术中及术后 3 个环节的检查结果：术前有关肿瘤的常规血液学检查包括肿瘤标志物检查、影像学检查（胸腹部 CT、MRI）；术中开腹探查；术后组织病理学检查。根据上述纳入及排除标准，回顾性选取 2015–2017 年期间入住四川大学华西第四医院和宜宾市第一人民医院的胃癌患者共 75 例，其中男 49 例，女 26 例，年龄 29～76 岁，中位年龄 63 岁。75 例胃癌患者的具体资料见表 1。同时选取同期因良性胃溃疡穿孔行手术治疗的患者 35 例作为胃良性病变组，均经术中活检取材行病理学检查证实，且在术后 3 个月随访经胃镜活检取材排除恶性病变。本研究均经患者及家属知情同意并签字授权，同时通过了四川大学华西第四医院和宜宾市第一人民医院伦理委员会的审核并予以批准。
表1
75 例胃癌患者的临床资料（例）
1.2 主要试剂和设备
人胃癌 MGC-803 细胞系购于美国模式菌种收集中心（ATCC）；RPMI 1640 培养基和胎牛血清购于美国 HyClone 公司；抗生素和胰酶消化液购于碧云天公司；RNA 提取试剂盒购于 Invitrogen 公司；miRNeasy Serum/Plasma 试剂盒和 QuantiTect SYBR® Green PCR 试剂盒购于德国 QIAGEN 公司；引物合成服务购于上海生工；cDNA 逆转录试剂盒和 37 ℃ 恒温孵箱购于美国 Thermo Fishier 公司；倒置显微镜购于徕卡显微镜中国有限公司；7900HT 实时荧光定量 PCR 仪购于 ABI 公司。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 组织及血液标本的采集及制备
① 标本采集：本研究中所有胃癌组织和良性病变组织标本均于术中采集；术前血液标本于入院后、手术前1 d 采集，术后血液标本于术后 1 个月患者随访复查时采集。② 血浆制备：使用枸橼酸钠抗凝管收集患者血液，室温下 2 000 g、离心 10 min，小心转移血浆上清到新鲜无菌 EP 管中，2 000 g、再次离心 15 min 去除残留在血浆中的血小板以避免后期检测污染。上述所有操作在 4 h 内完成，分装血浆样品于 −80 ℃ 保存。③ 组织制备：使用预先用 DEPC 水处理过的碾钵、镊子等接触组织样品所需器械，使用液氮研磨法将组织研磨成固态粉剂，然后进行后续 RNA 提取操作。
1.3.2 RNA 提取、cDNA 制备
参照说明书使用 miRNeasy Serum/Plasma 试剂盒提取血浆 RNA。按照 Trizol 说明书提取血浆、组织和细胞样品的 RNA。利用 Nanodrop 测定 RNA 浓度。参照操作说明书利用 Thermo Fishier 逆转录试剂盒将上述来自血浆、组织和细胞的 RNA 反转录生成 cDNA，反应体系为 20 μL，RNA 逆转录量为 1 μg。随后 cDNA模板稀释 5 倍。
1.3.3 miRNA 检测逆转录引物设计
引物设计采取颈环逆转录引物法（Stem-loop RT 法） [25-26]，人 miRNA-196a 逆转录引物序列为：GTCGTATCC-AGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATAC-GACCCCAAC，人 miR-103a-3p 逆转录引物序列为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT-ATTCGCACTGGATACGACTCATAG；miRNA-196a PCR 上游引物为 5′ -GCGCTAGGTAGTTT-CATGTT-3′ ，miR-103a-3p 上游引物为 5′ -GCACAG-CAGCAUUGUACAGGG-3′ ，下游引物为通用引物，引物序列为 5′ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3′ 。
1.3.4 实时荧光定量 PCR 法检测 miRNA-196a 表达
采用 QuantiTect SYBR® Green PCR 试剂盒检测血浆、组织和细胞样品中人源 miRNA-196a 的表达，选用体液中表达高度稳定的人 miR-103a-3p 作为内参基因用于校准计算。使用实时 7900HT 荧光定量 PCR 仪进行检测，PCR 反应程序如下：94 ℃ 预变性 2 min，94 ℃ 变性 5 s，60 ℃ 退火/延伸 10 s，热循环 40 个循环数。溶解曲线：95 ℃、2 min，60 ℃、20 s，95 ℃、15 s，从 60 ℃ 缓慢加热到 99 ℃。用 2−ΔCt 表示组织和血浆中 miRNA-196a 的相对表达量，其计算公式：ΔCt=目的基因 Ct 值–内参基因 Ct 值；用 2−ΔΔCt表示胃癌细胞株中 miRNA-196a 的过表达和敲减之后的倍数变化关系，计算公式：ΔΔCt=（处理组目的基因 Ct 值–处理组内参基因 Ct 值）–（对照组目的基因 Ct 值–对照组内参基因 Ct 值）。
1.4 体外实验方法及检测指标
1.4.1 肿瘤细胞系培养及细胞转染
配置含 10% 胎牛血清和青霉素/链霉素的 RPMI 1640 培养基用于培养人胃癌 MGC-803 细胞，培养环境为含 5% CO2、37 ℃ 湿润的细胞培养箱。融合度在 70% 左右且处于对数生长期的细胞用于后续实验。
1.4.2 细胞转染实现过表达或下调 miRNA-196a 表达
取 2.0×105 个/mL MGC-803 细胞接种到 6 孔板中，16～18 h 后待细胞融合度达到 60% 左右，参考说明书，利用 Lipofectine 3000 将化学合成的人 miRNA-196a 模拟物、人 miRNA-196a 抑制物以及人 miRNA-196a 对照导入提前进行随机分组（miRNA-196a 过表达组、miRNA-196a 敲减组和对照组，每组样本量为 6）的各组细胞中。24 h 后收集细胞用于 Transwell 和 RNA 提取检测 miRNA-196a 表达情况。
1.4.3 Transwell 小室检测 MGC-803 细胞的侵袭能力
滤膜孔径为 8 μm 的 24 孔板用于检测胃癌细胞株 MGC-803 的侵袭能力。将转染 miRNA-196a 模拟物 24 h 后的细胞及对照组细胞接种到预先用200 mg/mL 基质胶处理的上腔室中，所使用培养基为正常 MGC-803 培养基，体积为 0.1 mL；下腔室中加入 0.65 mL 培养基，血清浓度设置为 30%，作为趋化因子。37 ℃ 培养箱中孵育 24 h 后，用棉签将滤膜上腔室侧残留细胞去除，用 100% 乙醇将侵袭到滤膜下腔室侧的细胞固定 10 min，用 1% 的结晶紫染色 10 min，显微镜 10 倍物镜下随机选取 5 个视野进行细胞计数，取平均数作为结果。
1.5 统计学方法
采用 GraphPad Prism 6 和 SPSS 20.0 软件对数据进行分析。计量资料符合正态分布，用均数±标准差（
±s）表示，多组间指标比较采用单因素方差分析，2 组间比较采用独立样本t 检验，胃癌患者手术前后血浆中 miRNA-196a 表达水平的比较采用配对 t 检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 胃癌患者和胃良性病变患者组织和外周血浆中 miRNA-196a 表达检测结果
结果见图 1。由图 1 所示，与胃良性病变组比较，胃癌患者肿瘤组织中 miRNA-196a 的相对表达量升高（4.77±2.84 比 0.54±0.26，P<0.000 1），上调了约 7.8 倍；胃癌患者外周血浆中 miRNA-196a 的相对表达量也呈现相同的升高趋势（4.13±2.47比 0.43±0.24，P<0.000 1），上调了约 8.6 倍。
图1
示 2 组患者肿瘤组织（a）和外周血浆（b）中 miRNA-196a 表达检测结果
2.2 胃癌患者外周血浆中 miRNA-196a 的表达与其临床病理特征的相关性分析结果
结果见表 2。由表 2 可见，伴有浆膜侵犯、淋巴结转移和远处转移的胃癌患者外周血浆中的 miRNA-196a 表达水平高于无浆膜侵犯、无淋巴结转移和无远处转移者（P<0.001、P=0.004、P<0.001），临床分期为Ⅲ～Ⅳ期患者高于Ⅰ～Ⅱ期患者（P<0.001）；胃癌患者外周血浆中的 miRNA-196a 表达水平虽随肿瘤直径的增大呈递增趋势，但不同肿瘤直径间的差异无统计学意义（P>0.05）；外周血浆中 miRNA-196a 的表达水平与患者年龄、性别、肿瘤部位及分化程度均无相关性（P>0.05）。
表2
75 例胃癌患者外周血浆中 miRNA-196a 的表达水平与其临床病理特征的关系
2.3 胃癌患者手术前后外周血浆中 miRNA-196a 表达情况比较
为进一步验证胃癌患者外周血浆中上调的 miRNA-196a 是否主要是通过胃癌组织释放所致，本研究通过系统随机方法再将 75 例胃癌患者利用研究序列号交替随机分组，选取其中一组 25 例进行手术前后外周血浆中 miRNA-196a 表达情况的对照研究。其结果见图 2a，由图 2a 可见，胃癌患者外周血浆 miRNA-196a 的相对表达量术前为 4.54±2.71，较良性病变组的 0.43±0.24 增高约 9.5 倍（P<0.000 1）；胃癌手术后为 1.20±0.86，较术前下降了约 2.8 倍（P<0.000 1），接近但仍略高于良性对照组（P>0.05）。进一步比较 25 例胃癌患者每个个体手术前后外周血浆中的 miRNA-196a 相对表达量发现，手术后外周血浆中 miRNA-196a 相对表达量整体上呈现出下调趋势（P<0.000 1），见图 2b。该结果提示，胃癌患者外周血浆中上调的 miRNA-196a 绝大部分系原发肿瘤病灶释放所致。
图2
示 25 例胃癌患者手术前后外周血浆中 miRNA-196a 的表达情况以及体外实验中 miRNA-196a 对 MGC-803 细胞侵袭能力的影响
a：25 例胃癌患者手术前后血浆中的 miRNA-196a 表达水平；b：25 例胃癌患者每个个体手术前后血浆中 miRNA-196a 表达水平的变化情况；c：qRT-PCR 检测 3 组 MGC-803 细胞中的 miRNA-196a 表达结果；d、e：Transwell 小室检测 3 组 MGC-803 细胞的侵袭能力，d 图为细胞计数结果，e 图为染色结果（结晶紫染色 ×100）
2.4 miRNA-196a 在体外对胃癌细胞株 MGC-803 侵袭能力的影响
过表达组 miRNA-196a 相对表达量为 1 025.57±193.42，相较对照组的 1.03±0.17 上调了约 994.7 倍（P<0.01），miRNA-196a 敲减组的 miRNA-196a 相对表达量为 0.47±0.08，下降了约 1.2 倍（P<0.05），见图 2c。细胞侵袭实验（图 2d、2e）结果显示，miRNA-196a 过表达组与对照组相比增强了 MGC-803 细胞的侵袭能力 ［ （354±43）个比（225±35）个，P<0.05］， miRNA-196a 敲减组的 MGC-803 细胞侵袭能力 ［ （125±26）个］ 则受到抑制（P<0.05）。
3 讨论
胃癌是我国乃至世界范围内最为常见的消化道恶性肿瘤之一，尽管各种治疗方法不断取得新的进展，但是其发病率高、早期诊断率低以及转移率高的特点导致目前的治疗以及预后仍然不尽如人意。CEA、CA19-9 等血清学指标在术前检测阳性率偏低，影响其在术前的预测价值，主要用于术后复发的评估。所以，寻找有效的术前预测指标对胃癌患者个体化治疗非常重要。发现新的用于早期诊断、揭示预后的生物标志物有望改变上述现状。
研究[27]发现，miRNA 参与了调控机体正常生命活动包括发育、生长、增殖、分化等，不仅如此还参与了各种疾病（包括肿瘤）的发生发展过程。本研究比较了胃癌和胃良性疾病患者组织及外周血中的 miRNA-196a 表达情况，结果显示胃癌患者外周血浆（P<0.000 1）和癌组织（P<0.000 1）中 miRNA-196a 的表达均上调。Chen 等[23]研究显示，与健康志愿者相比，胃肠上皮化生、低度不典型增生和高度不典型增生患者血浆中 miRNA-196a 的表达均上调，当进展到早期胃癌阶段， miRNA-196a 的表达则进一步上调，提示 miRNA-196a 可作为胃癌癌前病变和早期胃癌的预测性生物标志物。本研究则在此基础之上进一步证实了与胃良性病变组比较，胃癌患者癌组织和外周血浆中的 miRNA-196a 呈现显著且高度类似的上调趋势，上调幅度在 7 倍以上。提示 miRNA-196a 随着胃组织病变程度变化其表达呈现逐步递增的趋势。
早期胃癌因不易被发现，随时间推移病情逐步发展到中晚期，此时肿瘤体积逐渐增大，进而发生局部侵袭和浆膜受侵、淋巴结转移以及通过血液方式的远处转移。本研究分析了 75 例胃癌患者外周血浆中 miRNA-196a 的表达与其临床病理特征的关系，发现伴有浆膜受侵（P<0.001）、淋巴结转移（P=0.004）和远处转移（P<0.001）的胃癌患者外周血浆中 miRNA-196a 的表达水平均上调，临床分期为Ⅲ～Ⅳ期患者外周血浆中 miRNA-196a 的表达较Ⅰ～Ⅱ期患者上调（P<0.001）。该结果提示 miRNA-196a 与胃癌原发肿瘤生长、局部侵袭和远处转移相关。miRNA-196a 有望成为一种新的重要的胃癌转移和进展的预后生物标志物。
本研究对胃癌患者手术前后外周血浆中的 miRNA-196a 表达情况进行分析，发现手术切除胃癌组织后血浆中 miRNA-196a 的表达显著下调，提示血浆中上升的 miRNA-196a 主要系肿瘤组织释放所致。该结果提示血浆 miRNA-196a 可作为临床胃癌诊断和预后的标志物，可以很好地反映胃癌组织中 miRNA-196a 的水平。
为进一步明确 miRNA-196a 与胃癌转移是否有直接关系，本研究通过体外实验观察了 miRNA-196a 对胃癌 MGC-803 细胞侵袭能力的影响，结果发现：miRNA-196a 过表达可增强胃癌 MGC-803 细胞的侵袭能力，而 miRNA-196a 敲减后则减弱了胃癌 MGC-803 细胞的侵袭能力。Tsai 等[22]在胃癌细胞系 TSGH 中通过慢病毒方式过表达和敲减 miRNA-196a 后发现，过表达 miRNA-196a 显著增加了 TSGH 细胞的迁移和侵袭能力。本研究用不同的胃癌细胞系 MGC-803 得到相同的结果，提示 miRNA-196a 在胃癌细胞中的促进转移侵袭功能具有普遍性。体外实验结果进一步提示胃癌患者高表达 miRNA-196a 与肿瘤的转移侵袭不仅有相关性，可能还存在一定的因果效应。
综上，本研究结果显示胃癌患者外周血浆中 miRNA-196a 表达水平与胃癌进展呈现正相关效应，并且在有局部侵袭、淋巴结转移和远处转移者中的表达显著上调，胃癌患者外周血浆中升高的 miRNA-196a 主要源自原发肿瘤的释放。体外 miRNA-196a 能够显著促进胃癌细胞的侵袭。本研究尚存在如下不足：虽然提示 miRNA-196a 有望成为进展性胃癌的预后标志物以及潜在的治疗靶点，但是尚需进行受试者工作特征曲线（ROC 曲线）来分析其灵敏度和特异度，尚需扩大病例数来分析 miRNA-196a 表达水平同生存率的关系。尽管体外实验证明了 miRNA-196a 可以促进胃癌细胞的侵袭，但具体机制还需阐明。未来将围绕上述不足进行更深入的研究和探讨。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：刘文能和阳川华负责研究设计及实施、数据采集和分析、撰写并审校论文及获取经费支持；杨百仞负责研究实施、数据采集和分析、起草论文；李东和向立历负责研究实施、数据采集、统计分析和起草论文。
伦理声明：本研究已通过四川大学华西第四医院（批文编号：Gwll2019041） 和宜宾市第一人民医院伦理委员会的审批。
胃癌是最为常见的消化道恶性肿瘤之一，具有发病率高、早期诊断率低、转移率高等特点[1-3]。发现新的用于胃癌早期诊断、揭示预后的生物标志物有望改变上述现状[4-6]。miRNA 是一类长度为 20～25 个碱基的非编码 RNA，通过不完全碱基互补配对方式结合到靶基因 RNA 3′ 非翻译区以直接降解或者抑制 RNA 翻译方式发挥基因表达调控作用。miRNA 几乎参与了机体所有的生理、病理进程，包括肿瘤的发生发展[7-10]，在肿瘤发生发展过程中，miRNA 扮演促癌基因和抑癌基因的双重角色[11-13]。由于 miRNA 具有在组织及各种体液中的表达极其稳定的特性，因此越来越多的研究将其作为一种候选的疾病诊断标志物[14-16]。其中 miRNA-196a 被发现在许多肿瘤中异常表达，包括结直肠癌[17-18]、乳腺癌[19]、胰腺癌[20]、肺癌[21]、胃癌[22]等。有研究[23]认为，miRNA-196a 有望作为一种潜在的早期胃癌诊断标志物。本研究旨在进一步明确胃癌患者外周血浆中 miRNA-196a 的表达变化情况，以及其表达水平与胃癌临床病理学特征特别是转移、侵袭之间的关系；同时通过体外实验观察 miRNA-196a 对胃癌细胞株 MGC-803 侵袭能力的影响。
1 资料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 胃癌组纳入标准
① 经病理学检查证实为胃癌患者；② 术前未接受放疗、化疗；③ 接受手术治疗者；④ 具有完整资料者。排除标准：① 合并其他肿瘤患者；② 术前接受过放疗、化疗；③ 围手术期 1 个月内死亡者；④ 资料不全者。
1.1.2 胃良性病变组纳入标准
① 经病理学检查证实为胃良性病变患者；② 未合并其他肿瘤；③ 接受手术治疗者。排除标准：① 合并其他肿瘤患者；② 围手术期 1 个月内死亡者。
1.1.3 研究对象的资料
胃癌的诊断基于术前、术中及术后 3 个环节的检查结果：术前有关肿瘤的常规血液学检查包括肿瘤标志物检查、影像学检查（胸腹部 CT、MRI）；术中开腹探查；术后组织病理学检查。根据上述纳入及排除标准，回顾性选取 2015–2017 年期间入住四川大学华西第四医院和宜宾市第一人民医院的胃癌患者共 75 例，其中男 49 例，女 26 例，年龄 29～76 岁，中位年龄 63 岁。75 例胃癌患者的具体资料见表 1。同时选取同期因良性胃溃疡穿孔行手术治疗的患者 35 例作为胃良性病变组，均经术中活检取材行病理学检查证实，且在术后 3 个月随访经胃镜活检取材排除恶性病变。本研究均经患者及家属知情同意并签字授权，同时通过了四川大学华西第四医院和宜宾市第一人民医院伦理委员会的审核并予以批准。
表1
75 例胃癌患者的临床资料（例）
1.2 主要试剂和设备
人胃癌 MGC-803 细胞系购于美国模式菌种收集中心（ATCC）；RPMI 1640 培养基和胎牛血清购于美国 HyClone 公司；抗生素和胰酶消化液购于碧云天公司；RNA 提取试剂盒购于 Invitrogen 公司；miRNeasy Serum/Plasma 试剂盒和 QuantiTect SYBR® Green PCR 试剂盒购于德国 QIAGEN 公司；引物合成服务购于上海生工；cDNA 逆转录试剂盒和 37 ℃ 恒温孵箱购于美国 Thermo Fishier 公司；倒置显微镜购于徕卡显微镜中国有限公司；7900HT 实时荧光定量 PCR 仪购于 ABI 公司。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 组织及血液标本的采集及制备
① 标本采集：本研究中所有胃癌组织和良性病变组织标本均于术中采集；术前血液标本于入院后、手术前1 d 采集，术后血液标本于术后 1 个月患者随访复查时采集。② 血浆制备：使用枸橼酸钠抗凝管收集患者血液，室温下 2 000 g、离心 10 min，小心转移血浆上清到新鲜无菌 EP 管中，2 000 g、再次离心 15 min 去除残留在血浆中的血小板以避免后期检测污染。上述所有操作在 4 h 内完成，分装血浆样品于 −80 ℃ 保存。③ 组织制备：使用预先用 DEPC 水处理过的碾钵、镊子等接触组织样品所需器械，使用液氮研磨法将组织研磨成固态粉剂，然后进行后续 RNA 提取操作。
1.3.2 RNA 提取、cDNA 制备
参照说明书使用 miRNeasy Serum/Plasma 试剂盒提取血浆 RNA。按照 Trizol 说明书提取血浆、组织和细胞样品的 RNA。利用 Nanodrop 测定 RNA 浓度。参照操作说明书利用 Thermo Fishier 逆转录试剂盒将上述来自血浆、组织和细胞的 RNA 反转录生成 cDNA，反应体系为 20 μL，RNA 逆转录量为 1 μg。随后 cDNA模板稀释 5 倍。
1.3.3 miRNA 检测逆转录引物设计
引物设计采取颈环逆转录引物法（Stem-loop RT 法） [25-26]，人 miRNA-196a 逆转录引物序列为：GTCGTATCC-AGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATAC-GACCCCAAC，人 miR-103a-3p 逆转录引物序列为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT-ATTCGCACTGGATACGACTCATAG；miRNA-196a PCR 上游引物为 5′ -GCGCTAGGTAGTTT-CATGTT-3′ ，miR-103a-3p 上游引物为 5′ -GCACAG-CAGCAUUGUACAGGG-3′ ，下游引物为通用引物，引物序列为 5′ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3′ 。
1.3.4 实时荧光定量 PCR 法检测 miRNA-196a 表达
采用 QuantiTect SYBR® Green PCR 试剂盒检测血浆、组织和细胞样品中人源 miRNA-196a 的表达，选用体液中表达高度稳定的人 miR-103a-3p 作为内参基因用于校准计算。使用实时 7900HT 荧光定量 PCR 仪进行检测，PCR 反应程序如下：94 ℃ 预变性 2 min，94 ℃ 变性 5 s，60 ℃ 退火/延伸 10 s，热循环 40 个循环数。溶解曲线：95 ℃、2 min，60 ℃、20 s，95 ℃、15 s，从 60 ℃ 缓慢加热到 99 ℃。用 2−ΔCt 表示组织和血浆中 miRNA-196a 的相对表达量，其计算公式：ΔCt=目的基因 Ct 值–内参基因 Ct 值；用 2−ΔΔCt表示胃癌细胞株中 miRNA-196a 的过表达和敲减之后的倍数变化关系，计算公式：ΔΔCt=（处理组目的基因 Ct 值–处理组内参基因 Ct 值）–（对照组目的基因 Ct 值–对照组内参基因 Ct 值）。
1.4 体外实验方法及检测指标
1.4.1 肿瘤细胞系培养及细胞转染
配置含 10% 胎牛血清和青霉素/链霉素的 RPMI 1640 培养基用于培养人胃癌 MGC-803 细胞，培养环境为含 5% CO2、37 ℃ 湿润的细胞培养箱。融合度在 70% 左右且处于对数生长期的细胞用于后续实验。
1.4.2 细胞转染实现过表达或下调 miRNA-196a 表达
取 2.0×105 个/mL MGC-803 细胞接种到 6 孔板中，16～18 h 后待细胞融合度达到 60% 左右，参考说明书，利用 Lipofectine 3000 将化学合成的人 miRNA-196a 模拟物、人 miRNA-196a 抑制物以及人 miRNA-196a 对照导入提前进行随机分组（miRNA-196a 过表达组、miRNA-196a 敲减组和对照组，每组样本量为 6）的各组细胞中。24 h 后收集细胞用于 Transwell 和 RNA 提取检测 miRNA-196a 表达情况。
1.4.3 Transwell 小室检测 MGC-803 细胞的侵袭能力
滤膜孔径为 8 μm 的 24 孔板用于检测胃癌细胞株 MGC-803 的侵袭能力。将转染 miRNA-196a 模拟物 24 h 后的细胞及对照组细胞接种到预先用200 mg/mL 基质胶处理的上腔室中，所使用培养基为正常 MGC-803 培养基，体积为 0.1 mL；下腔室中加入 0.65 mL 培养基，血清浓度设置为 30%，作为趋化因子。37 ℃ 培养箱中孵育 24 h 后，用棉签将滤膜上腔室侧残留细胞去除，用 100% 乙醇将侵袭到滤膜下腔室侧的细胞固定 10 min，用 1% 的结晶紫染色 10 min，显微镜 10 倍物镜下随机选取 5 个视野进行细胞计数，取平均数作为结果。
1.5 统计学方法
采用 GraphPad Prism 6 和 SPSS 20.0 软件对数据进行分析。计量资料符合正态分布，用均数±标准差（±s）表示，多组间指标比较采用单因素方差分析，2 组间比较采用独立样本t 检验，胃癌患者手术前后血浆中 miRNA-196a 表达水平的比较采用配对 t 检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 胃癌患者和胃良性病变患者组织和外周血浆中 miRNA-196a 表达检测结果
结果见图 1。由图 1 所示，与胃良性病变组比较，胃癌患者肿瘤组织中 miRNA-196a 的相对表达量升高（4.77±2.84 比 0.54±0.26，P<0.000 1），上调了约 7.8 倍；胃癌患者外周血浆中 miRNA-196a 的相对表达量也呈现相同的升高趋势（4.13±2.47比 0.43±0.24，P<0.000 1），上调了约 8.6 倍。
图1
示 2 组患者肿瘤组织（a）和外周血浆（b）中 miRNA-196a 表达检测结果
2.2 胃癌患者外周血浆中 miRNA-196a 的表达与其临床病理特征的相关性分析结果
结果见表 2。由表 2 可见，伴有浆膜侵犯、淋巴结转移和远处转移的胃癌患者外周血浆中的 miRNA-196a 表达水平高于无浆膜侵犯、无淋巴结转移和无远处转移者（P<0.001、P=0.004、P<0.001），临床分期为Ⅲ～Ⅳ期患者高于Ⅰ～Ⅱ期患者（P<0.001）；胃癌患者外周血浆中的 miRNA-196a 表达水平虽随肿瘤直径的增大呈递增趋势，但不同肿瘤直径间的差异无统计学意义（P>0.05）；外周血浆中 miRNA-196a 的表达水平与患者年龄、性别、肿瘤部位及分化程度均无相关性（P>0.05）。
表2
75 例胃癌患者外周血浆中 miRNA-196a 的表达水平与其临床病理特征的关系
2.3 胃癌患者手术前后外周血浆中 miRNA-196a 表达情况比较
为进一步验证胃癌患者外周血浆中上调的 miRNA-196a 是否主要是通过胃癌组织释放所致，本研究通过系统随机方法再将 75 例胃癌患者利用研究序列号交替随机分组，选取其中一组 25 例进行手术前后外周血浆中 miRNA-196a 表达情况的对照研究。其结果见图 2a，由图 2a 可见，胃癌患者外周血浆 miRNA-196a 的相对表达量术前为 4.54±2.71，较良性病变组的 0.43±0.24 增高约 9.5 倍（P<0.000 1）；胃癌手术后为 1.20±0.86，较术前下降了约 2.8 倍（P<0.000 1），接近但仍略高于良性对照组（P>0.05）。进一步比较 25 例胃癌患者每个个体手术前后外周血浆中的 miRNA-196a 相对表达量发现，手术后外周血浆中 miRNA-196a 相对表达量整体上呈现出下调趋势（P<0.000 1），见图 2b。该结果提示，胃癌患者外周血浆中上调的 miRNA-196a 绝大部分系原发肿瘤病灶释放所致。
图2
示 25 例胃癌患者手术前后外周血浆中 miRNA-196a 的表达情况以及体外实验中 miRNA-196a 对 MGC-803 细胞侵袭能力的影响
a：25 例胃癌患者手术前后血浆中的 miRNA-196a 表达水平；b：25 例胃癌患者每个个体手术前后血浆中 miRNA-196a 表达水平的变化情况；c：qRT-PCR 检测 3 组 MGC-803 细胞中的 miRNA-196a 表达结果；d、e：Transwell 小室检测 3 组 MGC-803 细胞的侵袭能力，d 图为细胞计数结果，e 图为染色结果（结晶紫染色 ×100）
2.4 miRNA-196a 在体外对胃癌细胞株 MGC-803 侵袭能力的影响
过表达组 miRNA-196a 相对表达量为 1 025.57±193.42，相较对照组的 1.03±0.17 上调了约 994.7 倍（P<0.01），miRNA-196a 敲减组的 miRNA-196a 相对表达量为 0.47±0.08，下降了约 1.2 倍（P<0.05），见图 2c。细胞侵袭实验（图 2d、2e）结果显示，miRNA-196a 过表达组与对照组相比增强了 MGC-803 细胞的侵袭能力 ［ （354±43）个比（225±35）个，P<0.05］， miRNA-196a 敲减组的 MGC-803 细胞侵袭能力 ［ （125±26）个］ 则受到抑制（P<0.05）。
3 讨论
胃癌是我国乃至世界范围内最为常见的消化道恶性肿瘤之一，尽管各种治疗方法不断取得新的进展，但是其发病率高、早期诊断率低以及转移率高的特点导致目前的治疗以及预后仍然不尽如人意。CEA、CA19-9 等血清学指标在术前检测阳性率偏低，影响其在术前的预测价值，主要用于术后复发的评估。所以，寻找有效的术前预测指标对胃癌患者个体化治疗非常重要。发现新的用于早期诊断、揭示预后的生物标志物有望改变上述现状。
研究[27]发现，miRNA 参与了调控机体正常生命活动包括发育、生长、增殖、分化等，不仅如此还参与了各种疾病（包括肿瘤）的发生发展过程。本研究比较了胃癌和胃良性疾病患者组织及外周血中的 miRNA-196a 表达情况，结果显示胃癌患者外周血浆（P<0.000 1）和癌组织（P<0.000 1）中 miRNA-196a 的表达均上调。Chen 等[23]研究显示，与健康志愿者相比，胃肠上皮化生、低度不典型增生和高度不典型增生患者血浆中 miRNA-196a 的表达均上调，当进展到早期胃癌阶段， miRNA-196a 的表达则进一步上调，提示 miRNA-196a 可作为胃癌癌前病变和早期胃癌的预测性生物标志物。本研究则在此基础之上进一步证实了与胃良性病变组比较，胃癌患者癌组织和外周血浆中的 miRNA-196a 呈现显著且高度类似的上调趋势，上调幅度在 7 倍以上。提示 miRNA-196a 随着胃组织病变程度变化其表达呈现逐步递增的趋势。
早期胃癌因不易被发现，随时间推移病情逐步发展到中晚期，此时肿瘤体积逐渐增大，进而发生局部侵袭和浆膜受侵、淋巴结转移以及通过血液方式的远处转移。本研究分析了 75 例胃癌患者外周血浆中 miRNA-196a 的表达与其临床病理特征的关系，发现伴有浆膜受侵（P<0.001）、淋巴结转移（P=0.004）和远处转移（P<0.001）的胃癌患者外周血浆中 miRNA-196a 的表达水平均上调，临床分期为Ⅲ～Ⅳ期患者外周血浆中 miRNA-196a 的表达较Ⅰ～Ⅱ期患者上调（P<0.001）。该结果提示 miRNA-196a 与胃癌原发肿瘤生长、局部侵袭和远处转移相关。miRNA-196a 有望成为一种新的重要的胃癌转移和进展的预后生物标志物。
本研究对胃癌患者手术前后外周血浆中的 miRNA-196a 表达情况进行分析，发现手术切除胃癌组织后血浆中 miRNA-196a 的表达显著下调，提示血浆中上升的 miRNA-196a 主要系肿瘤组织释放所致。该结果提示血浆 miRNA-196a 可作为临床胃癌诊断和预后的标志物，可以很好地反映胃癌组织中 miRNA-196a 的水平。
为进一步明确 miRNA-196a 与胃癌转移是否有直接关系，本研究通过体外实验观察了 miRNA-196a 对胃癌 MGC-803 细胞侵袭能力的影响，结果发现：miRNA-196a 过表达可增强胃癌 MGC-803 细胞的侵袭能力，而 miRNA-196a 敲减后则减弱了胃癌 MGC-803 细胞的侵袭能力。Tsai 等[22]在胃癌细胞系 TSGH 中通过慢病毒方式过表达和敲减 miRNA-196a 后发现，过表达 miRNA-196a 显著增加了 TSGH 细胞的迁移和侵袭能力。本研究用不同的胃癌细胞系 MGC-803 得到相同的结果，提示 miRNA-196a 在胃癌细胞中的促进转移侵袭功能具有普遍性。体外实验结果进一步提示胃癌患者高表达 miRNA-196a 与肿瘤的转移侵袭不仅有相关性，可能还存在一定的因果效应。
综上，本研究结果显示胃癌患者外周血浆中 miRNA-196a 表达水平与胃癌进展呈现正相关效应，并且在有局部侵袭、淋巴结转移和远处转移者中的表达显著上调，胃癌患者外周血浆中升高的 miRNA-196a 主要源自原发肿瘤的释放。体外 miRNA-196a 能够显著促进胃癌细胞的侵袭。本研究尚存在如下不足：虽然提示 miRNA-196a 有望成为进展性胃癌的预后标志物以及潜在的治疗靶点，但是尚需进行受试者工作特征曲线（ROC 曲线）来分析其灵敏度和特异度，尚需扩大病例数来分析 miRNA-196a 表达水平同生存率的关系。尽管体外实验证明了 miRNA-196a 可以促进胃癌细胞的侵袭，但具体机制还需阐明。未来将围绕上述不足进行更深入的研究和探讨。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：刘文能和阳川华负责研究设计及实施、数据采集和分析、撰写并审校论文及获取经费支持；杨百仞负责研究实施、数据采集和分析、起草论文；李东和向立历负责研究实施、数据采集、统计分析和起草论文。
伦理声明：本研究已通过四川大学华西第四医院（批文编号：Gwll2019041） 和宜宾市第一人民医院伦理委员会的审批。
