引用本文： 钟勇辉, 谢福川, 魏宜胜, 黄学军. eIF6 基因表达对结直肠癌细胞侵袭转移及Wnt/β-catenin 信号通路的影响. 中国普外基础与临床杂志, 2021, 28(9): 1148-1154. doi: 10.7507/1007-9424.202012136 复制
在我国，结直肠癌位居肿瘤病死率的第 5 位，威胁人们的健康生活。针对结直肠癌发生发展相关基因的研究，有利于筛选针对结直肠癌的防治靶标。真核起始因子 6（eukaryotic initiation factor 6，eIF6）参与核糖体合成，并且在蛋白质翻译过程中发挥重要的调控作用[1-2]。有研究[3]报道，eIF6 可通过调控相关信号通路促进结直肠癌的发展，肿瘤的发生发展与上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）过程密切相关，EMT 促进肿瘤细胞的侵袭和迁移，而 Wnt/β-catenin 通路则调节 EMT 的发生。本研究回顾性分析了结直肠癌组织中 eIF6 的表达情况，并通过体外细胞实验，探究调控 Wnt/β-catenin 通路的分子机制以及在结直肠癌发展中的作用。
1 材料与方法
1.1 主要材料
100 例组织标本（癌组织和癌旁组织）收集于惠州市中心人民医院 2020 年 1～12 月期间诊治的结直肠癌患者；人正常结直肠黏膜细胞 FHC 和人结直肠癌细胞 SW837 购自上海 ATCC 细胞库；eIF6 基因表达腺病毒、eIF6 shRNA 干扰腺病毒和空质粒腺病毒购自云舟生物科技（广州）有限公司；4～5 周龄 BALB/C 裸鼠购自成都达硕实验动物有限公司；兔抗人 eIF6 抗体、兔抗人 β-连环蛋白（β-catenin）抗体、兔抗人糖原合成酶激酶 3β（GSK-3β）抗体、兔抗人腺瘤性息肉蛋白（APC）抗体、兔抗人锌指转录因子 1（Snail）抗体、兔抗人上皮钙依赖黏附蛋白（E-cadherin）抗体、兔抗人波形蛋白（Vimentin）抗体和羊抗兔 IgG（HRP）抗体均购自艾博抗（上海）贸易有限公司。
1.2 检测指标及方法
1.2.1 结直肠癌组织及其癌旁组织中 eIF6 蛋白表达检测
采用免疫组化方法（IHC）。主要步骤：① 取结直肠癌组织及其癌旁组织常规脱水后，进行透明和石蜡包埋，4 µm 厚连续切片，于 60 ℃ 恒温箱中烘烤 12 h。② 将切片浸入二甲苯和各梯度乙醇，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）冲洗 3 次。③ 用柠檬酸盐溶液浸没切片，置于高压蒸汽锅中加热 3 min，冷却至室温。④ 向切片上滴加 3 % 双氧水，避光 10 min，PBS 冲洗。⑤ 向切片上滴加兔抗人 eIF6 抗体稀释液（1∶200），室温 4 h，PBS 冲洗。⑥ 再滴加羊抗兔 IgG 抗体稀释液（1∶1 000），室温 30 min，PBS 冲洗。⑦ 经 DAB 显色、水洗后，进行苏木精复染，0.1 % 稀盐酸用作分化处理，水洗；梯度乙醇脱水，透明后封片，光镜观察。结果判定标准：细胞无着色，记作 0 分；呈淡黄色，记作 1 分；呈棕黄色，记作 2 分；呈棕褐色，记作 3 分。阳性细胞占比<5%，记作 0 分；阳性细胞占比 5%～30%，记作 1 分；阳性细胞占比 30%～70%，记作 2 分；阳性细胞占比>70%，记作 3 分。最终计算细胞着色评分×阳性细胞占比评分，评分≤3 分判为阴性，评分>3 分判为阳性。
1.2.2 细胞转染
分别取 FHC 细胞和 SW837 细胞以 1×106 个/mL 接种到 96 孔细胞培养板中，37 ℃、5 %CO2 条件下培养过夜。SW837 细胞分为对照组、空质粒组、过表达组和敲低组。对照组不做转染；空质粒组转入空质粒腺病毒；过表达组转入 eIF6 基因过表达腺病毒；敲低组转入 eIF6 shRNA 干扰腺病毒。转染后细胞置于细胞培养箱中培养 48 h 以备后续实验。实验重复检测 6 次。
1.2.3 qRT-PCR 实验检测 eIF6 mRNA 表达情况
收集 1.2.2 中 4 组 SW837 细胞提取总 RNA，逆转录为 cDNA，用于 qRT-PCR 反应，以上操作均严格按照试剂盒说明书进行，设置 GAPDH 为内参，数据处理采用 2−ΔΔCt 法，引物序列见表 1。
表1
各基因引物序列
1.2.4 蛋白质免疫印迹技术（WB）实验检测 eIF6、β-catenin、GSK-3β、APC、Snail、E-cadherin、Vimentin 蛋白表达情况
收集 1.2.2 中 FHC 细胞及 4 组 SW83 细胞经裂解液裂解后，离心 15 min，条件为 4 ℃、15 000 r/min，离心半径 10 cm。取上清，行 eIF6 蛋白定量检测：① 取 50 μg 与上样缓冲液混合，沸水浴 10 min，上样电泳。② 取凝胶进行 PVDF 转膜，结束后浸于 5% 脱脂奶封闭，洗涤后加入稀释一抗（1∶500 稀释的 eIF6 抗体、β-catenin 抗体、GSK-3β 抗体、APC 抗体、Snail 抗体、E-cadherin 抗体和 Vimentin 抗体），置于 4 ℃ 摇床，过夜孵育。③ 洗涤，加入稀释二抗（1∶1 000 稀释的羊抗兔 IgG 抗体），置于室温摇床，1 h 孵育。④ 洗涤，显色后通过成像系统获取结果图，ImageJ 软件进行分析，以目的蛋白与 GAPDH 蛋白的条带灰度值比值表示目的蛋白表达水平。
1.2.5 Transwell 侵袭实验
基质胶包被 Transwell 小室，凝固后备用。取 1.2.2 中 4 组 SW83 细胞经胰酶消化、离心（15 000 r/min、15 min、离心半径 10 cm）收集，重悬为 5×105 个/mL，取 100 μL 加入 Transwell 小室内层，取 500 μL 10% 胎牛血清细胞培养基加入 Transwell 小室外层，细胞培养箱中培养 48 h，取出 Transwell 小室，轻拭去内层面细胞，经固定和结晶紫染色，晾干后用显微镜观察侵袭细胞数。
1.2.6 划痕实验
取 1.2.2 中 4 组 SW83 细胞，借助灭菌直尺，使用无菌 10 μL 枪头在培养板底部垂直划过细胞层，加入细胞培养基清洗去除未贴壁细胞和细胞碎片，倒置显微镜下拍照，此时划痕距离记作 0 h。在细胞培养箱中培养 24 h 后，再次拍照，划痕距离记作 24 h。Image Pro Plus 6.0 软件分析图片，划痕愈合率=（0 h 距离−24 h 距离）/0 h 距离×100%。
1.2.7 皮下成瘤实验
取 1.2.2 中 4 组 SW83 细胞，经胰酶消化、离心（15 000 r/min、15 min、离心半径 10 cm）收集，重悬为 5×106 个/mL，取 200 μL 注射于 BALB/C 裸鼠右腋窝皮下，分别记录为对照组、空质粒组、过表达组和敲低组，每组 6 只。接种细胞后，对裸鼠进行密切观察，每间隔 2 d 进行 1 次瘤体直径测量，共测量 10 次，肿瘤体积=1/2（短径2×长径）。
1.2.8 移植肿瘤病理学改变
皮下成瘤实验结束，麻醉并处死裸鼠，取肿瘤组织用 4% 多聚甲醛固定，PBS 冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、切片，厚度为 5 μm。将切片进行脱蜡、水化后，苏木精染色，水洗，1% 盐酸乙醇分化，水洗，伊红染色，脱水并透明，树胶封片，显微镜观察。
1.3 统计学方法
SPSS20.0 统计学软件用以分析数据。计数资料以例（%）的形式呈现，行配对卡方检验；计量资料经正态分布检验均符合正态分布，以（
±s）的形式呈现，多组间行单因素方差分析（One-Way ANOVA），进一步两两分析行 SNK-q 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 结直肠癌组织及其癌旁组织、人正常结直肠黏膜细胞 FHC 和人结直肠癌细胞 SW837 中 eIF6 蛋白表达检测结果
结直肠癌组织及其癌旁组织中 eIF6 蛋白表达阳性呈棕褐色颗粒（图 1a、1b）。本研究 100 例结直肠癌患者中，结直肠癌组织中 eIF6 蛋白表达阳性者 83 例（83.00%），癌旁组织中 eIF6 蛋白表达阳性者 29 例（29.00%），差异具有统计学意义（配对 χ2 检验，χ2=59.712，P<0.001）。人结直肠癌细胞 SW837 中 eIF6 蛋白相对表达量高于人正常结直肠黏膜细胞 FHC（2.53±0.26 比 0.97±0.13，P<0.001），见图 1c、1d。
图1
示 eIF6 蛋白在结直肠癌组织（a）及其癌旁组织（b）中的表达（IHC ×100）以及在 FHC 细胞和 SW837 细胞中表达的电泳图（c）和相对表达量检测结果（d）
2.2 各组 SW837 细胞中 eIF6 mRNA 和蛋白表达检测结果
相较于对照组，过表达组 SW837 细胞中 eIF6 mRNA 和蛋白的表达水平升高，差异有统计学意义（P<0.05），敲低组 SW837 细胞中的 eIF6 mRNA 和蛋白的表达水平则降低，差异有统计学意义（P<0.05）；空质粒组 SW837 细胞中的 eIF6 mRNA 和蛋白表达水平与对照组的差异无统计学意义（P>0.05）。提示过表达/敲低 eIF6 的 SW837 细胞株构建成功，可用于后续实验。具体见表 2 和图 2a、2b。
表2
各组 SW837 细胞中 eIF6 mRNA 和蛋白表达检测结果（
，n=6）
图2
各组 SW837 细胞中 eIF6 蛋白表达电泳图（a）及相对表达量结果（b）
2.3 各组 SW837 细胞中 Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白表达检测结果
相较于对照组，过表达组的 SW837 细胞中 β-catenin 和 Snail 蛋白表达水平增高，GSK-3β 和 APC 蛋白表达水平降低（P<0.05）；敲低组 SW837 细胞中 β-catenin 和 Snail 蛋白表达水平降低，GSK-3β 和 APC 蛋白表达水平增高（P<0.05）；空质粒组 4 种蛋白的表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。具体见表 3。
表3
各组 SW837 细胞中 Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白表达及 EMT 标志物检测结果（
，n=6）
2.4 各组 SW837 细胞中 EMT 标志物检测结果
相较于对照组，过表达组 SW837 细胞中 EMT 标志物 E-cadherin 蛋白表达降低，Vimentin 蛋白表达升高（P<0.05）；敲低组 SW837 细胞中 E-cadherin 蛋白表达升高，Vimentin 蛋白表达降低（P<0.05）；空质粒组 SW837 细胞中 E-cadherin 和 Vimentin 蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。具体见表 3。
2.5 各组 SW837 细胞侵袭迁移能力检测结果
相较于对照组，过表达组 SW837 细胞侵袭数增多，划痕愈合率升高（P<0.05），敲低组 SW837 细胞侵袭数减少，划痕愈合率降低（P<0.05），空质粒组 SW837 细胞侵袭数和划痕愈合率差异无统计学意义（P>0.05）。具体见表 4 和图 3a。
表4
各组 SW837 细胞侵袭迁移能力检测结果（
，n=6）
图3
示各组 SW837 细胞侵袭实验和划痕实验结果以及体内成瘤情况及其病理学检查结果
a：Transwell 侵袭实验结果（结晶紫染色 ×200）及划痕实验结果（×100）；b：各组肿瘤体积；c：各组移植瘤大体观，从左到右依次为对照组、空质粒组、过表达组、敲低组；d–g：对照组（d）、空质粒组（e）、过表达组（f）和敲低组（g）移植瘤病理学检查结果（HE ×200）
2.6 各组 SW837 细胞体内成瘤情况
对照组肿瘤体积随时间推移不断增大，空质粒组肿瘤体积基本与对照组同步增加，过表达组肿瘤体积相较于对照组有所增大，敲低组肿瘤体积相较于对照组有所减小（图 3b、3c）。
2.7 各组 SW837 细胞的移植瘤病理学检查结果
HE 染色可观察到呈现圆形或椭圆形的癌细胞，排列紊乱、核大、深染，具有病理性核分裂像，并且组织间含有丰富的间质血管（图 3d-3g）。
3 讨论
结直肠癌是我国常见恶性肿瘤，确诊时多已为中晚期，预后较差。寻找有效监控结直肠癌发生发展的分子标志物，是其防治和预后判断的关键。研究[3-4]表明，eIF6 是翻译起始的限速因子，对肿瘤的发生发展具有重要的调节作用。Gantenbein 等[5]研究发现，肺腺癌和肺鳞状细胞癌中 eIF6 蛋白表达明显高于健康组织，高水平 eIF6 与腺癌患者的总生存期缩短相关，敲除 eIF6 可抑制癌细胞增殖并诱导其凋亡。Golob-Schwarzl 等[6]研究报道，与非肿瘤性组织相比，胆囊癌组织中 eIF6 的表达水平显著升高，在胆囊癌细胞系中敲除 eIF6 可抑制癌细胞增殖。本研究发现，在 100 例结直肠癌组织中 83 例 eIF6 蛋白表达阳性，在其对应的癌旁组织中 eIF6 蛋白表达阳性者 29 例，同时人结直肠癌细胞 SW837 中 eIF6 蛋白相对表达量高于人正常结直肠黏膜细胞，其差异均有统计学意义（P<0.001），该结果提示结直肠癌的发生发展可能与 eIF6 表达异常相关。本研究还发现，过表达 eIF6 组结直肠癌细胞的体内成瘤能力相比于对照组有所增强，敲低 eIF6 组结直肠癌细胞的体内成瘤能力相比于对照组有所减弱，提示 eIF6 对癌细胞成瘤能力具有调控作用，但具体机制还需进一步研究。
有研究[7-9]报道，Wnt 信号通路在结直肠癌发生发展中起重要作用，约 90 % 的结直肠癌患者体内存在 Wnt 信号通路的异常激活，其中以 β-catenin 和 APC 异常最为常见。Wnt 信号通路未激活时，细胞质中一部分 β-catenin 与 E-cadherin 和细胞骨架肌动蛋白丝结合在一起[10-12]；一部分与 GSK-3β、APC、酪蛋白激酶 1、体轴抑制蛋白 1（Axin1）和体轴抑制蛋白 2（Axin2）形成复合体，从而 β-catenin 被磷酸化、泛素化，并最终降解[13-15]；以游离形式存在的 β-catenin 较少，因此无法进入细胞核中激活相应靶基因。当 Wnt 信号通路被激活后，上述复合体解离，释放大量 β-catenin 进入细胞核后激活靶基因，诱导 EMT，促进肿瘤发生发展[16-18]。Li 等[19]研究发现，抑制 β-catenin 入核活性，下调 Wnt 信号通路，可抑制结直肠癌细胞的干细胞样潜能。Chen 等[20]研究报道，激活 AKT/GSK-3β/β-catenin 信号通路可诱导结直肠癌细胞生长和侵袭。在本研究中，过表达 eIF6 组细胞相比于对照组细胞，β-catenin 蛋白和通路下游 Snail 蛋白的表达增加，GSK-3β 和 APC 蛋白表达减少；敲低 eIF6 组细胞 β-catenin 及 Snail 蛋白表达减少，GSK-3β 和 APC 蛋白表达增加。该结果提示 eIF6 对癌细胞成瘤能力的调控机制可能是通过激活 Wnt/β-catenin 信号通路，调控通路下游蛋白的表达发挥作用的。
现已知 Wnt/β-catenin 信号通路异常激活，可促进 EMT 进程，加速肿瘤的发生发展[21]。Guo 等[22]研究报道，使骨肉瘤中 Wnt/β-catenin 信号通路失活能够抑制肿瘤生长和转移。Gu 等[23]研究发现，药物抑制 Wnt/β-catenin 信号通路的激活，可抑制 EMT，并且进一步体内研究证实调控 Wnt/β-catenin 信号通路可抑制 EMT，抑制肿瘤生长。Wu 等[24]研究发现，降低 β-catenin 磷酸化水平来增强 β-catenin 的表达和核转位，可调控 EMT 并促进结直肠癌转移。本研究结果显示，过表达 eIF6 组细胞相比于对照组细胞，E-cadherin 蛋白表达降低，Vimentin 蛋白表达升高，细胞侵袭数增多，划痕愈合率升高；敲低 eIF6 的细胞 E-cadherin 蛋白表达升高，Vimentin 蛋白表达降低，细胞侵袭数减少，划痕愈合率降低。结合之前实验结果，推测 eIF6 可能通过 Wnt/β-catenin 信号通路调控 EMT，影响结直肠癌细胞的侵袭迁移能力。
综上所述，结直肠癌组织中存在 eIF6 表达上调，eIF6 可能促进 Wnt/β-catenin 信号通路的激活，加速 EMT 进程，提高结直肠癌细胞迁移侵袭能力和体内成瘤能力。本研究结果提示，eIF6 可能为筛选结直肠癌治疗药物及预后评估的潜在分子标志物。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们不存在相互竞争的利益。
作者贡献声明：钟勇辉参与实验设计及实验研究，谢福川及魏宜胜参与部分实验研究及数据的统计分许，黄学军参与文章的校对及修改。
伦理声明：本研究已通过惠州市中心人民医院伦理委员会的审核批准（审批文号：kyll2019052）。
在我国，结直肠癌位居肿瘤病死率的第 5 位，威胁人们的健康生活。针对结直肠癌发生发展相关基因的研究，有利于筛选针对结直肠癌的防治靶标。真核起始因子 6（eukaryotic initiation factor 6，eIF6）参与核糖体合成，并且在蛋白质翻译过程中发挥重要的调控作用[1-2]。有研究[3]报道，eIF6 可通过调控相关信号通路促进结直肠癌的发展，肿瘤的发生发展与上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）过程密切相关，EMT 促进肿瘤细胞的侵袭和迁移，而 Wnt/β-catenin 通路则调节 EMT 的发生。本研究回顾性分析了结直肠癌组织中 eIF6 的表达情况，并通过体外细胞实验，探究调控 Wnt/β-catenin 通路的分子机制以及在结直肠癌发展中的作用。
1 材料与方法
1.1 主要材料
100 例组织标本（癌组织和癌旁组织）收集于惠州市中心人民医院 2020 年 1～12 月期间诊治的结直肠癌患者；人正常结直肠黏膜细胞 FHC 和人结直肠癌细胞 SW837 购自上海 ATCC 细胞库；eIF6 基因表达腺病毒、eIF6 shRNA 干扰腺病毒和空质粒腺病毒购自云舟生物科技（广州）有限公司；4～5 周龄 BALB/C 裸鼠购自成都达硕实验动物有限公司；兔抗人 eIF6 抗体、兔抗人 β-连环蛋白（β-catenin）抗体、兔抗人糖原合成酶激酶 3β（GSK-3β）抗体、兔抗人腺瘤性息肉蛋白（APC）抗体、兔抗人锌指转录因子 1（Snail）抗体、兔抗人上皮钙依赖黏附蛋白（E-cadherin）抗体、兔抗人波形蛋白（Vimentin）抗体和羊抗兔 IgG（HRP）抗体均购自艾博抗（上海）贸易有限公司。
1.2 检测指标及方法
1.2.1 结直肠癌组织及其癌旁组织中 eIF6 蛋白表达检测
采用免疫组化方法（IHC）。主要步骤：① 取结直肠癌组织及其癌旁组织常规脱水后，进行透明和石蜡包埋，4 µm 厚连续切片，于 60 ℃ 恒温箱中烘烤 12 h。② 将切片浸入二甲苯和各梯度乙醇，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）冲洗 3 次。③ 用柠檬酸盐溶液浸没切片，置于高压蒸汽锅中加热 3 min，冷却至室温。④ 向切片上滴加 3 % 双氧水，避光 10 min，PBS 冲洗。⑤ 向切片上滴加兔抗人 eIF6 抗体稀释液（1∶200），室温 4 h，PBS 冲洗。⑥ 再滴加羊抗兔 IgG 抗体稀释液（1∶1 000），室温 30 min，PBS 冲洗。⑦ 经 DAB 显色、水洗后，进行苏木精复染，0.1 % 稀盐酸用作分化处理，水洗；梯度乙醇脱水，透明后封片，光镜观察。结果判定标准：细胞无着色，记作 0 分；呈淡黄色，记作 1 分；呈棕黄色，记作 2 分；呈棕褐色，记作 3 分。阳性细胞占比<5%，记作 0 分；阳性细胞占比 5%～30%，记作 1 分；阳性细胞占比 30%～70%，记作 2 分；阳性细胞占比>70%，记作 3 分。最终计算细胞着色评分×阳性细胞占比评分，评分≤3 分判为阴性，评分>3 分判为阳性。
1.2.2 细胞转染
分别取 FHC 细胞和 SW837 细胞以 1×106 个/mL 接种到 96 孔细胞培养板中，37 ℃、5 %CO2 条件下培养过夜。SW837 细胞分为对照组、空质粒组、过表达组和敲低组。对照组不做转染；空质粒组转入空质粒腺病毒；过表达组转入 eIF6 基因过表达腺病毒；敲低组转入 eIF6 shRNA 干扰腺病毒。转染后细胞置于细胞培养箱中培养 48 h 以备后续实验。实验重复检测 6 次。
1.2.3 qRT-PCR 实验检测 eIF6 mRNA 表达情况
收集 1.2.2 中 4 组 SW837 细胞提取总 RNA，逆转录为 cDNA，用于 qRT-PCR 反应，以上操作均严格按照试剂盒说明书进行，设置 GAPDH 为内参，数据处理采用 2−ΔΔCt 法，引物序列见表 1。
表1
各基因引物序列
1.2.4 蛋白质免疫印迹技术（WB）实验检测 eIF6、β-catenin、GSK-3β、APC、Snail、E-cadherin、Vimentin 蛋白表达情况
收集 1.2.2 中 FHC 细胞及 4 组 SW83 细胞经裂解液裂解后，离心 15 min，条件为 4 ℃、15 000 r/min，离心半径 10 cm。取上清，行 eIF6 蛋白定量检测：① 取 50 μg 与上样缓冲液混合，沸水浴 10 min，上样电泳。② 取凝胶进行 PVDF 转膜，结束后浸于 5% 脱脂奶封闭，洗涤后加入稀释一抗（1∶500 稀释的 eIF6 抗体、β-catenin 抗体、GSK-3β 抗体、APC 抗体、Snail 抗体、E-cadherin 抗体和 Vimentin 抗体），置于 4 ℃ 摇床，过夜孵育。③ 洗涤，加入稀释二抗（1∶1 000 稀释的羊抗兔 IgG 抗体），置于室温摇床，1 h 孵育。④ 洗涤，显色后通过成像系统获取结果图，ImageJ 软件进行分析，以目的蛋白与 GAPDH 蛋白的条带灰度值比值表示目的蛋白表达水平。
1.2.5 Transwell 侵袭实验
基质胶包被 Transwell 小室，凝固后备用。取 1.2.2 中 4 组 SW83 细胞经胰酶消化、离心（15 000 r/min、15 min、离心半径 10 cm）收集，重悬为 5×105 个/mL，取 100 μL 加入 Transwell 小室内层，取 500 μL 10% 胎牛血清细胞培养基加入 Transwell 小室外层，细胞培养箱中培养 48 h，取出 Transwell 小室，轻拭去内层面细胞，经固定和结晶紫染色，晾干后用显微镜观察侵袭细胞数。
1.2.6 划痕实验
取 1.2.2 中 4 组 SW83 细胞，借助灭菌直尺，使用无菌 10 μL 枪头在培养板底部垂直划过细胞层，加入细胞培养基清洗去除未贴壁细胞和细胞碎片，倒置显微镜下拍照，此时划痕距离记作 0 h。在细胞培养箱中培养 24 h 后，再次拍照，划痕距离记作 24 h。Image Pro Plus 6.0 软件分析图片，划痕愈合率=（0 h 距离−24 h 距离）/0 h 距离×100%。
1.2.7 皮下成瘤实验
取 1.2.2 中 4 组 SW83 细胞，经胰酶消化、离心（15 000 r/min、15 min、离心半径 10 cm）收集，重悬为 5×106 个/mL，取 200 μL 注射于 BALB/C 裸鼠右腋窝皮下，分别记录为对照组、空质粒组、过表达组和敲低组，每组 6 只。接种细胞后，对裸鼠进行密切观察，每间隔 2 d 进行 1 次瘤体直径测量，共测量 10 次，肿瘤体积=1/2（短径2×长径）。
1.2.8 移植肿瘤病理学改变
皮下成瘤实验结束，麻醉并处死裸鼠，取肿瘤组织用 4% 多聚甲醛固定，PBS 冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、切片，厚度为 5 μm。将切片进行脱蜡、水化后，苏木精染色，水洗，1% 盐酸乙醇分化，水洗，伊红染色，脱水并透明，树胶封片，显微镜观察。
1.3 统计学方法
SPSS20.0 统计学软件用以分析数据。计数资料以例（%）的形式呈现，行配对卡方检验；计量资料经正态分布检验均符合正态分布，以（±s）的形式呈现，多组间行单因素方差分析（One-Way ANOVA），进一步两两分析行 SNK-q 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 结直肠癌组织及其癌旁组织、人正常结直肠黏膜细胞 FHC 和人结直肠癌细胞 SW837 中 eIF6 蛋白表达检测结果
结直肠癌组织及其癌旁组织中 eIF6 蛋白表达阳性呈棕褐色颗粒（图 1a、1b）。本研究 100 例结直肠癌患者中，结直肠癌组织中 eIF6 蛋白表达阳性者 83 例（83.00%），癌旁组织中 eIF6 蛋白表达阳性者 29 例（29.00%），差异具有统计学意义（配对 χ2 检验，χ2=59.712，P<0.001）。人结直肠癌细胞 SW837 中 eIF6 蛋白相对表达量高于人正常结直肠黏膜细胞 FHC（2.53±0.26 比 0.97±0.13，P<0.001），见图 1c、1d。
图1
示 eIF6 蛋白在结直肠癌组织（a）及其癌旁组织（b）中的表达（IHC ×100）以及在 FHC 细胞和 SW837 细胞中表达的电泳图（c）和相对表达量检测结果（d）
2.2 各组 SW837 细胞中 eIF6 mRNA 和蛋白表达检测结果
相较于对照组，过表达组 SW837 细胞中 eIF6 mRNA 和蛋白的表达水平升高，差异有统计学意义（P<0.05），敲低组 SW837 细胞中的 eIF6 mRNA 和蛋白的表达水平则降低，差异有统计学意义（P<0.05）；空质粒组 SW837 细胞中的 eIF6 mRNA 和蛋白表达水平与对照组的差异无统计学意义（P>0.05）。提示过表达/敲低 eIF6 的 SW837 细胞株构建成功，可用于后续实验。具体见表 2 和图 2a、2b。
表2
各组 SW837 细胞中 eIF6 mRNA 和蛋白表达检测结果（，n=6）
图2
各组 SW837 细胞中 eIF6 蛋白表达电泳图（a）及相对表达量结果（b）
2.3 各组 SW837 细胞中 Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白表达检测结果
相较于对照组，过表达组的 SW837 细胞中 β-catenin 和 Snail 蛋白表达水平增高，GSK-3β 和 APC 蛋白表达水平降低（P<0.05）；敲低组 SW837 细胞中 β-catenin 和 Snail 蛋白表达水平降低，GSK-3β 和 APC 蛋白表达水平增高（P<0.05）；空质粒组 4 种蛋白的表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。具体见表 3。
表3
各组 SW837 细胞中 Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白表达及 EMT 标志物检测结果（，n=6）
2.4 各组 SW837 细胞中 EMT 标志物检测结果
相较于对照组，过表达组 SW837 细胞中 EMT 标志物 E-cadherin 蛋白表达降低，Vimentin 蛋白表达升高（P<0.05）；敲低组 SW837 细胞中 E-cadherin 蛋白表达升高，Vimentin 蛋白表达降低（P<0.05）；空质粒组 SW837 细胞中 E-cadherin 和 Vimentin 蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。具体见表 3。
2.5 各组 SW837 细胞侵袭迁移能力检测结果
相较于对照组，过表达组 SW837 细胞侵袭数增多，划痕愈合率升高（P<0.05），敲低组 SW837 细胞侵袭数减少，划痕愈合率降低（P<0.05），空质粒组 SW837 细胞侵袭数和划痕愈合率差异无统计学意义（P>0.05）。具体见表 4 和图 3a。
表4
各组 SW837 细胞侵袭迁移能力检测结果（，n=6）
图3
示各组 SW837 细胞侵袭实验和划痕实验结果以及体内成瘤情况及其病理学检查结果
a：Transwell 侵袭实验结果（结晶紫染色 ×200）及划痕实验结果（×100）；b：各组肿瘤体积；c：各组移植瘤大体观，从左到右依次为对照组、空质粒组、过表达组、敲低组；d–g：对照组（d）、空质粒组（e）、过表达组（f）和敲低组（g）移植瘤病理学检查结果（HE ×200）
2.6 各组 SW837 细胞体内成瘤情况
对照组肿瘤体积随时间推移不断增大，空质粒组肿瘤体积基本与对照组同步增加，过表达组肿瘤体积相较于对照组有所增大，敲低组肿瘤体积相较于对照组有所减小（图 3b、3c）。
2.7 各组 SW837 细胞的移植瘤病理学检查结果
HE 染色可观察到呈现圆形或椭圆形的癌细胞，排列紊乱、核大、深染，具有病理性核分裂像，并且组织间含有丰富的间质血管（图 3d-3g）。
3 讨论
结直肠癌是我国常见恶性肿瘤，确诊时多已为中晚期，预后较差。寻找有效监控结直肠癌发生发展的分子标志物，是其防治和预后判断的关键。研究[3-4]表明，eIF6 是翻译起始的限速因子，对肿瘤的发生发展具有重要的调节作用。Gantenbein 等[5]研究发现，肺腺癌和肺鳞状细胞癌中 eIF6 蛋白表达明显高于健康组织，高水平 eIF6 与腺癌患者的总生存期缩短相关，敲除 eIF6 可抑制癌细胞增殖并诱导其凋亡。Golob-Schwarzl 等[6]研究报道，与非肿瘤性组织相比，胆囊癌组织中 eIF6 的表达水平显著升高，在胆囊癌细胞系中敲除 eIF6 可抑制癌细胞增殖。本研究发现，在 100 例结直肠癌组织中 83 例 eIF6 蛋白表达阳性，在其对应的癌旁组织中 eIF6 蛋白表达阳性者 29 例，同时人结直肠癌细胞 SW837 中 eIF6 蛋白相对表达量高于人正常结直肠黏膜细胞，其差异均有统计学意义（P<0.001），该结果提示结直肠癌的发生发展可能与 eIF6 表达异常相关。本研究还发现，过表达 eIF6 组结直肠癌细胞的体内成瘤能力相比于对照组有所增强，敲低 eIF6 组结直肠癌细胞的体内成瘤能力相比于对照组有所减弱，提示 eIF6 对癌细胞成瘤能力具有调控作用，但具体机制还需进一步研究。
有研究[7-9]报道，Wnt 信号通路在结直肠癌发生发展中起重要作用，约 90 % 的结直肠癌患者体内存在 Wnt 信号通路的异常激活，其中以 β-catenin 和 APC 异常最为常见。Wnt 信号通路未激活时，细胞质中一部分 β-catenin 与 E-cadherin 和细胞骨架肌动蛋白丝结合在一起[10-12]；一部分与 GSK-3β、APC、酪蛋白激酶 1、体轴抑制蛋白 1（Axin1）和体轴抑制蛋白 2（Axin2）形成复合体，从而 β-catenin 被磷酸化、泛素化，并最终降解[13-15]；以游离形式存在的 β-catenin 较少，因此无法进入细胞核中激活相应靶基因。当 Wnt 信号通路被激活后，上述复合体解离，释放大量 β-catenin 进入细胞核后激活靶基因，诱导 EMT，促进肿瘤发生发展[16-18]。Li 等[19]研究发现，抑制 β-catenin 入核活性，下调 Wnt 信号通路，可抑制结直肠癌细胞的干细胞样潜能。Chen 等[20]研究报道，激活 AKT/GSK-3β/β-catenin 信号通路可诱导结直肠癌细胞生长和侵袭。在本研究中，过表达 eIF6 组细胞相比于对照组细胞，β-catenin 蛋白和通路下游 Snail 蛋白的表达增加，GSK-3β 和 APC 蛋白表达减少；敲低 eIF6 组细胞 β-catenin 及 Snail 蛋白表达减少，GSK-3β 和 APC 蛋白表达增加。该结果提示 eIF6 对癌细胞成瘤能力的调控机制可能是通过激活 Wnt/β-catenin 信号通路，调控通路下游蛋白的表达发挥作用的。
现已知 Wnt/β-catenin 信号通路异常激活，可促进 EMT 进程，加速肿瘤的发生发展[21]。Guo 等[22]研究报道，使骨肉瘤中 Wnt/β-catenin 信号通路失活能够抑制肿瘤生长和转移。Gu 等[23]研究发现，药物抑制 Wnt/β-catenin 信号通路的激活，可抑制 EMT，并且进一步体内研究证实调控 Wnt/β-catenin 信号通路可抑制 EMT，抑制肿瘤生长。Wu 等[24]研究发现，降低 β-catenin 磷酸化水平来增强 β-catenin 的表达和核转位，可调控 EMT 并促进结直肠癌转移。本研究结果显示，过表达 eIF6 组细胞相比于对照组细胞，E-cadherin 蛋白表达降低，Vimentin 蛋白表达升高，细胞侵袭数增多，划痕愈合率升高；敲低 eIF6 的细胞 E-cadherin 蛋白表达升高，Vimentin 蛋白表达降低，细胞侵袭数减少，划痕愈合率降低。结合之前实验结果，推测 eIF6 可能通过 Wnt/β-catenin 信号通路调控 EMT，影响结直肠癌细胞的侵袭迁移能力。
综上所述，结直肠癌组织中存在 eIF6 表达上调，eIF6 可能促进 Wnt/β-catenin 信号通路的激活，加速 EMT 进程，提高结直肠癌细胞迁移侵袭能力和体内成瘤能力。本研究结果提示，eIF6 可能为筛选结直肠癌治疗药物及预后评估的潜在分子标志物。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们不存在相互竞争的利益。
作者贡献声明：钟勇辉参与实验设计及实验研究，谢福川及魏宜胜参与部分实验研究及数据的统计分许，黄学军参与文章的校对及修改。
伦理声明：本研究已通过惠州市中心人民医院伦理委员会的审核批准（审批文号：kyll2019052）。
