引用本文： 申杰, 贾唯艺, 黄庆文, 冯圣杰, 刘亮. DAB2IP调控盐霉素对结肠癌细胞增殖影响的研究. 中国普外基础与临床杂志, 2022, 29(7): 857-861. doi: 10.7507/1007-9424.202111014 复制
结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，尽管目前外科手术联合放射和（或）化学药物治疗可以明显提高患者的5年生存率，但仍有约40%~50%的结直肠癌患者最终死于肿瘤转移[1-2]。越来越多的研究[3-6]表明，肿瘤干细胞在许多类型的肿瘤中都存在，在驱动肿瘤生长和转移的过程中发挥着关键作用。DAB2IP又名DOC-2/DAB2结合蛋白或ASK1结合蛋白，在人类多种肿瘤中被作为一个公认的抑癌蛋白，其通过抑制Ras-Raf-ERK及磷脂酰肌醇3激酶-Akt活性，激活ASK1-JNK/p38通路，调节肿瘤细胞生长、增殖与死亡[7-9]；此外，DAB2IP还可以抑制肿瘤干细胞的特性获得[10-11]。盐霉素是一种小分子载体抗生素，被证实对肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌等具有明显的抑制作用[12-18]。自从2009年Gupta等[19]首次报道盐霉素可以选择性地杀伤乳腺癌干细胞以来，后有许多研究[20-25]结果均表明，盐霉素还可以有效杀伤结直肠癌、肺癌、胃癌、骨肉瘤、胶质母细胞瘤等肿瘤干细胞，但其机制并不明确。因此，本研究旨在探讨DAB2IP在盐霉素对结肠癌细胞的增殖影响中的作用及可能的机制，并且本研究根据既往的文献[12-18]报道，盐霉素对多种实体肿瘤具有抑制作用，为了进一步验证盐霉素对结肠癌细胞的抑制作用及明确盐霉素对结肠癌细胞的半数抑制浓度（median inhibitory concentration，IC50），故本研究选取了2株结肠癌细胞系HT29和SW480进行研究。
1 材料与方法
1.1 主要材料
结肠癌细胞HT29和SW480均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，HT29细胞使用McCOY’s 5A培养基（Hyclone公司）培养、SW480细胞使用DMEM培养基（Hyclone公司）培养，以上两种细胞均使用含有10%的胎牛血清（Gibco公司）、1%青-链霉素的培养基培养。盐霉素购自MedChemExpress公司（货号：CAS53003-10-4），用二甲基亚砜配制成10 mmol/L于–20 ℃保存备用。pCI-neo质粒、pCI-DAB2IP质粒、pGIPZ-DAB2IP-shRNA质粒和pGIPZ-con-shRNA质粒由美国西南医学中心Jer-Tsong Hsieh赠送。Lipofectamine3000转染试剂购自Invitrogen公司。DAB2IP抗体购自Abcam公司，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体购自Santa Cruz公司；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK8）购自MedChemExpress公司；Trizol、逆转录试剂盒和实时定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）试剂盒购自Takara公司。
1.2 采用CCK8检测细胞毒性及增殖实验
细胞毒性实验检测盐霉素的IC50，取对数生长期的结肠癌细胞经胰酶消化后并计数，以5 000个细胞/孔接种于96孔板中，每组重复6个复孔，待细胞贴壁后以0.0、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L浓度的盐霉素处理细胞24 h后加入CCK8试剂，具体操作按试剂盒说明书进行，用酶标仪检测450 nm波长的吸光度（absorbance，A）以计数细胞活力，其公式为“（实验组A值–空白对照组A值）/（对照组A值–空白对照组A值）×100%” 。其中实验组是稳定低表达或高表达DAB2IP的结肠癌细胞，对照组是其相应对照细胞，计算6个复孔的平均数。
1.3 稳定敲减或外源性高表达DAB2IP结肠癌细胞株的建立及鉴定
在内源性高表达DAB2IP的HT29细胞中，采用慢病毒转染的方法分别转染pGIPZ-DAB2IP-shRNA质粒和pGIPZ-con-shRNA质粒，用嘌呤霉素筛选稳定克隆，建立HT29-shDAB2IP和对照组HT29-shcon细胞株；在内源性低表达DAB2IP的SW480细胞中，采用Lipofectamine3000分别转染pCI-DAB2IP质粒和pCI-neo质粒，用G418筛选稳定克隆，建立SW480-DAB2IP和对照组SW480-con细胞株。采用Western blot法鉴定DAB2IP的表达。将以上稳定株细胞以5×105个/孔接种于6孔板，24 h贴壁培养后经胰酶消化收集细胞沉淀，加入适量含苯甲基磺酰氟的NP40裂解液冰上裂解，然后12 000 r/min（r=0.125 cm）离心后取上清，经二喹啉甲酸法检测浓度后加入上样缓冲液水浴（100 ℃）5 min。蛋白样品以每孔30 μg上样电泳后，硝酸纤维素膜转膜2 h，并用脱脂牛奶封闭非特异性结合，4 ℃孵育一抗过夜（DAB2IP抗体浓度为1∶1 000，GAPDH抗体浓度为1∶2 000），TBST洗膜后孵育二抗1 h，最后用电化学发光法显影。
1.4 RT-PCR法检测结肠癌细胞的肿瘤干细胞相关标志物CD24、CD44和CD133的表达情况
为了进一步探究DAB2IP是如何影响盐霉素对结肠癌细胞增殖的抑制作用，本研究采用RT-PCR法检测结肠癌细胞的肿瘤干细胞相关标志物CD24、CD44和CD133的表达情况。将以上稳定株细胞以5×105个/孔接种于6孔板，24 h贴壁培养后经胰酶消化收集细胞沉淀，利用Trizol法提取细胞总RNA（具体操作参照产品说明书），按照Takara公司的逆转录试剂盒说明书操作进行逆转录合成cDNA。根据基因序列用NCBI Primer-BLAST设计引物，引物序列见表1。按照试剂盒说明书进行RT-PCR反应，用2–ΔΔCt法分析RT-PCR检测结果，每组重复3个复孔，结果取均值。
表1
各标志物引物序列
1.5 统计学方法
利用Graphpad Prism软件作图。采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，实验数据通过正态分布检验，符合正态分布者用均数±标准差表示并采用配对t检验。RT-PCR法检测结果分析采用单向方差分析进行各个样本间2–ΔΔCt的比较。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 盐霉素对结肠癌细胞增殖的影响
通过细胞毒性及增殖实验发现，随着盐霉素浓度增加，细胞活力呈降低趋势，提示其对结肠癌细胞HT29和SW480增殖具有抑制作用，其IC50值分别为20.0和10.0 μmol/L，见图1a、1b。
图1
示主要实验结果
a、b：分别为CCK8检测盐霉素对HT29（a）和SW480（b）细胞的IC50值；c~f：分别为Western blot法检测SW480和HT29细胞中DAB2IP的蛋白质表达量（c、e）及CCK8检测盐霉素对DAB2IP表达不同水平的细胞活力（d、f）的影响，c、d中1代表SW480-con细胞、2代表SW480-DAB2IP细胞，e、f中1代表HT29-shcon细胞、2代表HT29-shDAB2IP细胞；g、h：分别为RT-PCR检测DAB2IP对HT29（g）和SW480（h）结肠癌干细胞标志物的表达
2.2 DAB2IP表达下调后盐霉素对结肠癌细胞增殖的抑制作用增强
结果见图1c~1f。本研究成功构建了外源性稳定高表达DAB2IP的结肠癌细胞（SW480-DAB2IP）和对照组细胞（SW480-con）及稳定敲减DAB2IP表达的结肠癌细胞（HT29-shDAB2IP）和对照组细胞（HT29-shcon），见图1c、1e。再利用CCK8法检测盐霉素对稳定高表达或敲减DAB2IP表达后结肠癌细胞增殖的影响，结果发现，在SW480细胞中外源性高表达DAB2IP后，盐霉素对SW480细胞增殖的抑制作用较对照组细胞明显减弱（细胞活力均数62%比50%，t=18.13、P<0.000 1），见图1d；在HT29细胞中稳定敲减DAB2IP表达后，盐霉素对HT29细胞增殖的抑制作用较对照组细胞明显增强（细胞活力均数38%比51%，t=2.98、P=0.031），见图1f，结果提示，DAB2IP的表达下调可以增强盐霉素对直肠癌细胞增殖的抑制作用。
2.3 RT-PCR法检测结肠癌细胞中肿瘤干细胞相关标志物的表达结果
在HT29细胞中稳定敲减DAB2IP后即HT29-shDAB2IP细胞中肿瘤干细胞标志分子CD24（4.09倍，t=12.58、P=0.0063）、CD44（3.26倍，t=38.99、P=0.0007）和CD133（3.42倍，t=14.92、P=0.0045）表达均较对照组即HT29-shcon细胞明显增强（图1g），而在SW480细胞中外源性高表达DAB2IP后即SW480-DAB2IP细胞中肿瘤干细胞标志分子CD24（0.29倍，t=70.82、P=0.0002）、CD44（0.42倍，t=26.66、P=0.0014）和CD133（0.56倍，t=4.368、P=0.0486）表达均较对照组即SW480-con细胞降低（图1h），结果提示，DAB2IP可能是通过抑制结肠癌细胞的干性而影响盐霉素对结肠癌增殖的抑制作用。
3 讨论
2009年有文献[19]报道，在乳腺癌中盐霉素较传统化疗药物紫杉醇具有更强的杀伤乳腺癌肿瘤干细胞的作用。盐霉素杀伤肿瘤干细胞的作用机制涉及溶酶体铁隔离，导致活性氧的产生及溶酶体膜渗透，进而引起铁死亡[20]。当然，盐霉素对肿瘤干细胞的杀伤作用可能还涉及其他方面的机制。本研究对此进一步进行了探索，首先通过细胞毒性及增殖实验发现，盐霉素对结肠癌细胞HT29和SW480细胞的增殖具有明显抑制作用；然后进一步在内源性高表达DAB2IP的HT29细胞中稳定敲减DAB2IP后可显著增强盐霉素对结肠癌细胞增殖的抑制作用，而在内源性低表达DAB2IP的SW480细胞中稳定高表达DAB2IP后可显著抑制盐霉素对结肠癌细胞增殖的抑制作用。既往的研究[19, 21-24]表明，盐霉素可以有效地杀伤乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、骨肉瘤等肿瘤干细胞，而CD24、CD44和CD133是结直肠癌干细胞的常用标志物[26]，本研究为了进一步探究这些肿瘤干细胞相关标志物在DAB2IP影响盐霉素对结肠癌细胞增殖影响可能机制中的作用，采用RT-PCR法检测结肠癌细胞稳定敲减或稳定高表达DAB2IP后肿瘤干细胞相关标志物的表达情况变化，结果显示，在内源性高表达DAB2IP的HT29细胞中稳定敲减DAB2IP后可明显增强肿瘤干细胞标志分子CD24、CD44和CD133的表达，而在内源性低表达DAB2IP的SW480细胞中稳定高表达DAB2IP后可显著降低其表达。据此推测，DAB2IP抑制盐霉素对结肠癌细胞增殖的抑制作用可能是通过抑制结直癌干细胞的获得实现的，这也符合既往文献关于盐霉素可以杀伤多种肿瘤干细胞的报道。
尽管本研究初步研究结果提示DAB2IP可能是通过抑制结肠癌细胞的干性而影响盐霉素对结肠癌增殖的抑制作用，也预示着在DAB2IP表达较低或缺失的结肠癌中盐霉素可能具有更好的增殖抑制作用，此结论也需进一步研究，因为本研究只限于细胞水平的研究，尚缺乏体内动物实验的验证；此外，关于DAB2IP是如何影响结肠癌肿瘤干细胞获得的确切分子机制目前尚不明确，因此，需在后续的研究中进一步证实盐霉素在结肠癌中的作用及机制。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：申杰主要完成具体实验的实施及作图；贾唯艺主要负责细胞的培养；黄庆文主要负责统计分析；冯圣杰主要负责数据整理；刘亮主要负责研究的设计与论文书写。
结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，尽管目前外科手术联合放射和（或）化学药物治疗可以明显提高患者的5年生存率，但仍有约40%~50%的结直肠癌患者最终死于肿瘤转移[1-2]。越来越多的研究[3-6]表明，肿瘤干细胞在许多类型的肿瘤中都存在，在驱动肿瘤生长和转移的过程中发挥着关键作用。DAB2IP又名DOC-2/DAB2结合蛋白或ASK1结合蛋白，在人类多种肿瘤中被作为一个公认的抑癌蛋白，其通过抑制Ras-Raf-ERK及磷脂酰肌醇3激酶-Akt活性，激活ASK1-JNK/p38通路，调节肿瘤细胞生长、增殖与死亡[7-9]；此外，DAB2IP还可以抑制肿瘤干细胞的特性获得[10-11]。盐霉素是一种小分子载体抗生素，被证实对肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌等具有明显的抑制作用[12-18]。自从2009年Gupta等[19]首次报道盐霉素可以选择性地杀伤乳腺癌干细胞以来，后有许多研究[20-25]结果均表明，盐霉素还可以有效杀伤结直肠癌、肺癌、胃癌、骨肉瘤、胶质母细胞瘤等肿瘤干细胞，但其机制并不明确。因此，本研究旨在探讨DAB2IP在盐霉素对结肠癌细胞的增殖影响中的作用及可能的机制，并且本研究根据既往的文献[12-18]报道，盐霉素对多种实体肿瘤具有抑制作用，为了进一步验证盐霉素对结肠癌细胞的抑制作用及明确盐霉素对结肠癌细胞的半数抑制浓度（median inhibitory concentration，IC50），故本研究选取了2株结肠癌细胞系HT29和SW480进行研究。
1 材料与方法
1.1 主要材料
结肠癌细胞HT29和SW480均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，HT29细胞使用McCOY’s 5A培养基（Hyclone公司）培养、SW480细胞使用DMEM培养基（Hyclone公司）培养，以上两种细胞均使用含有10%的胎牛血清（Gibco公司）、1%青-链霉素的培养基培养。盐霉素购自MedChemExpress公司（货号：CAS53003-10-4），用二甲基亚砜配制成10 mmol/L于–20 ℃保存备用。pCI-neo质粒、pCI-DAB2IP质粒、pGIPZ-DAB2IP-shRNA质粒和pGIPZ-con-shRNA质粒由美国西南医学中心Jer-Tsong Hsieh赠送。Lipofectamine3000转染试剂购自Invitrogen公司。DAB2IP抗体购自Abcam公司，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体购自Santa Cruz公司；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK8）购自MedChemExpress公司；Trizol、逆转录试剂盒和实时定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）试剂盒购自Takara公司。
1.2 采用CCK8检测细胞毒性及增殖实验
细胞毒性实验检测盐霉素的IC50，取对数生长期的结肠癌细胞经胰酶消化后并计数，以5 000个细胞/孔接种于96孔板中，每组重复6个复孔，待细胞贴壁后以0.0、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L浓度的盐霉素处理细胞24 h后加入CCK8试剂，具体操作按试剂盒说明书进行，用酶标仪检测450 nm波长的吸光度（absorbance，A）以计数细胞活力，其公式为“（实验组A值–空白对照组A值）/（对照组A值–空白对照组A值）×100%” 。其中实验组是稳定低表达或高表达DAB2IP的结肠癌细胞，对照组是其相应对照细胞，计算6个复孔的平均数。
1.3 稳定敲减或外源性高表达DAB2IP结肠癌细胞株的建立及鉴定
在内源性高表达DAB2IP的HT29细胞中，采用慢病毒转染的方法分别转染pGIPZ-DAB2IP-shRNA质粒和pGIPZ-con-shRNA质粒，用嘌呤霉素筛选稳定克隆，建立HT29-shDAB2IP和对照组HT29-shcon细胞株；在内源性低表达DAB2IP的SW480细胞中，采用Lipofectamine3000分别转染pCI-DAB2IP质粒和pCI-neo质粒，用G418筛选稳定克隆，建立SW480-DAB2IP和对照组SW480-con细胞株。采用Western blot法鉴定DAB2IP的表达。将以上稳定株细胞以5×105个/孔接种于6孔板，24 h贴壁培养后经胰酶消化收集细胞沉淀，加入适量含苯甲基磺酰氟的NP40裂解液冰上裂解，然后12 000 r/min（r=0.125 cm）离心后取上清，经二喹啉甲酸法检测浓度后加入上样缓冲液水浴（100 ℃）5 min。蛋白样品以每孔30 μg上样电泳后，硝酸纤维素膜转膜2 h，并用脱脂牛奶封闭非特异性结合，4 ℃孵育一抗过夜（DAB2IP抗体浓度为1∶1 000，GAPDH抗体浓度为1∶2 000），TBST洗膜后孵育二抗1 h，最后用电化学发光法显影。
1.4 RT-PCR法检测结肠癌细胞的肿瘤干细胞相关标志物CD24、CD44和CD133的表达情况
为了进一步探究DAB2IP是如何影响盐霉素对结肠癌细胞增殖的抑制作用，本研究采用RT-PCR法检测结肠癌细胞的肿瘤干细胞相关标志物CD24、CD44和CD133的表达情况。将以上稳定株细胞以5×105个/孔接种于6孔板，24 h贴壁培养后经胰酶消化收集细胞沉淀，利用Trizol法提取细胞总RNA（具体操作参照产品说明书），按照Takara公司的逆转录试剂盒说明书操作进行逆转录合成cDNA。根据基因序列用NCBI Primer-BLAST设计引物，引物序列见表1。按照试剂盒说明书进行RT-PCR反应，用2–ΔΔCt法分析RT-PCR检测结果，每组重复3个复孔，结果取均值。
表1
各标志物引物序列
1.5 统计学方法
利用Graphpad Prism软件作图。采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，实验数据通过正态分布检验，符合正态分布者用均数±标准差表示并采用配对t检验。RT-PCR法检测结果分析采用单向方差分析进行各个样本间2–ΔΔCt的比较。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 盐霉素对结肠癌细胞增殖的影响
通过细胞毒性及增殖实验发现，随着盐霉素浓度增加，细胞活力呈降低趋势，提示其对结肠癌细胞HT29和SW480增殖具有抑制作用，其IC50值分别为20.0和10.0 μmol/L，见图1a、1b。
图1
示主要实验结果
a、b：分别为CCK8检测盐霉素对HT29（a）和SW480（b）细胞的IC50值；c~f：分别为Western blot法检测SW480和HT29细胞中DAB2IP的蛋白质表达量（c、e）及CCK8检测盐霉素对DAB2IP表达不同水平的细胞活力（d、f）的影响，c、d中1代表SW480-con细胞、2代表SW480-DAB2IP细胞，e、f中1代表HT29-shcon细胞、2代表HT29-shDAB2IP细胞；g、h：分别为RT-PCR检测DAB2IP对HT29（g）和SW480（h）结肠癌干细胞标志物的表达
2.2 DAB2IP表达下调后盐霉素对结肠癌细胞增殖的抑制作用增强
结果见图1c~1f。本研究成功构建了外源性稳定高表达DAB2IP的结肠癌细胞（SW480-DAB2IP）和对照组细胞（SW480-con）及稳定敲减DAB2IP表达的结肠癌细胞（HT29-shDAB2IP）和对照组细胞（HT29-shcon），见图1c、1e。再利用CCK8法检测盐霉素对稳定高表达或敲减DAB2IP表达后结肠癌细胞增殖的影响，结果发现，在SW480细胞中外源性高表达DAB2IP后，盐霉素对SW480细胞增殖的抑制作用较对照组细胞明显减弱（细胞活力均数62%比50%，t=18.13、P<0.000 1），见图1d；在HT29细胞中稳定敲减DAB2IP表达后，盐霉素对HT29细胞增殖的抑制作用较对照组细胞明显增强（细胞活力均数38%比51%，t=2.98、P=0.031），见图1f，结果提示，DAB2IP的表达下调可以增强盐霉素对直肠癌细胞增殖的抑制作用。
2.3 RT-PCR法检测结肠癌细胞中肿瘤干细胞相关标志物的表达结果
在HT29细胞中稳定敲减DAB2IP后即HT29-shDAB2IP细胞中肿瘤干细胞标志分子CD24（4.09倍，t=12.58、P=0.0063）、CD44（3.26倍，t=38.99、P=0.0007）和CD133（3.42倍，t=14.92、P=0.0045）表达均较对照组即HT29-shcon细胞明显增强（图1g），而在SW480细胞中外源性高表达DAB2IP后即SW480-DAB2IP细胞中肿瘤干细胞标志分子CD24（0.29倍，t=70.82、P=0.0002）、CD44（0.42倍，t=26.66、P=0.0014）和CD133（0.56倍，t=4.368、P=0.0486）表达均较对照组即SW480-con细胞降低（图1h），结果提示，DAB2IP可能是通过抑制结肠癌细胞的干性而影响盐霉素对结肠癌增殖的抑制作用。
3 讨论
2009年有文献[19]报道，在乳腺癌中盐霉素较传统化疗药物紫杉醇具有更强的杀伤乳腺癌肿瘤干细胞的作用。盐霉素杀伤肿瘤干细胞的作用机制涉及溶酶体铁隔离，导致活性氧的产生及溶酶体膜渗透，进而引起铁死亡[20]。当然，盐霉素对肿瘤干细胞的杀伤作用可能还涉及其他方面的机制。本研究对此进一步进行了探索，首先通过细胞毒性及增殖实验发现，盐霉素对结肠癌细胞HT29和SW480细胞的增殖具有明显抑制作用；然后进一步在内源性高表达DAB2IP的HT29细胞中稳定敲减DAB2IP后可显著增强盐霉素对结肠癌细胞增殖的抑制作用，而在内源性低表达DAB2IP的SW480细胞中稳定高表达DAB2IP后可显著抑制盐霉素对结肠癌细胞增殖的抑制作用。既往的研究[19, 21-24]表明，盐霉素可以有效地杀伤乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、骨肉瘤等肿瘤干细胞，而CD24、CD44和CD133是结直肠癌干细胞的常用标志物[26]，本研究为了进一步探究这些肿瘤干细胞相关标志物在DAB2IP影响盐霉素对结肠癌细胞增殖影响可能机制中的作用，采用RT-PCR法检测结肠癌细胞稳定敲减或稳定高表达DAB2IP后肿瘤干细胞相关标志物的表达情况变化，结果显示，在内源性高表达DAB2IP的HT29细胞中稳定敲减DAB2IP后可明显增强肿瘤干细胞标志分子CD24、CD44和CD133的表达，而在内源性低表达DAB2IP的SW480细胞中稳定高表达DAB2IP后可显著降低其表达。据此推测，DAB2IP抑制盐霉素对结肠癌细胞增殖的抑制作用可能是通过抑制结直癌干细胞的获得实现的，这也符合既往文献关于盐霉素可以杀伤多种肿瘤干细胞的报道。
尽管本研究初步研究结果提示DAB2IP可能是通过抑制结肠癌细胞的干性而影响盐霉素对结肠癌增殖的抑制作用，也预示着在DAB2IP表达较低或缺失的结肠癌中盐霉素可能具有更好的增殖抑制作用，此结论也需进一步研究，因为本研究只限于细胞水平的研究，尚缺乏体内动物实验的验证；此外，关于DAB2IP是如何影响结肠癌肿瘤干细胞获得的确切分子机制目前尚不明确，因此，需在后续的研究中进一步证实盐霉素在结肠癌中的作用及机制。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：申杰主要完成具体实验的实施及作图；贾唯艺主要负责细胞的培养；黄庆文主要负责统计分析；冯圣杰主要负责数据整理；刘亮主要负责研究的设计与论文书写。
