引用本文： 李晶晶, 朱成章, 史新龙, 杜斌斌, 杨熊飞. 基于16S rDNA测序分析胆囊结石及胆囊切除对结直肠癌患者肠道菌群的影响. 中国普外基础与临床杂志, 2022, 29(12): 1573-1582. doi: 10.7507/1007-9424.202203003 复制
随着代谢组学和基因测序技术在分子生物学中的应用及发展，发现肠道菌群改变与结直肠癌的发生发展关系紧密[1]。胆囊结石是胆道系统的常见疾病，从无症状的胆囊结石（多由体检发现）到有症状的胆囊结石（胆绞痛、上腹隐痛、恶心、呕吐），再到有并发症的胆囊结石（包括胆囊炎、继发性胆总管结石、胆源性胰腺炎、Mirizzi综合征及胆囊癌）。腹腔镜胆囊切除术是治疗胆囊结石的有效手段。胆囊切除术后未浓缩的胆汁大量流入肠道影响胆汁酸的肠肝循环，结肠内胆汁酸的增加改变肠黏膜的通透性，影响肠道微生物群，增加了结直肠癌的发生风险[2]。然而，有关胆囊切除术后胆汁酸代谢途径改变进而引起患者肠道菌群发生变化，是否会导致某种具有致癌潜力的微生物群落发展，以及是否直接导致结直肠癌的发生发展知之甚少。为此，本研究采用16S rDNA高通量测序技术测定粪便微生物群组成，旨在探究胆囊结石及胆囊切除术后引起肠道菌群失调与结直肠癌发病的相关性，为预防和治疗结直肠癌提供新思路。
1 资料与方法
1.1 研究对象
采用前瞻性研究方法，收集2020年6月至2021年3月期间就诊于甘肃省人民医院肛肠科的168例患者，所有患者均进行电子结肠镜检查及病理活检确诊为结直肠癌，经彩色多普勒超声证实无胆管结石和胆石性息肉，收集患者的临床资料、实验室检查结果和粪便样本。所有患者均签署知情同意书，本研究通过了甘肃省人民医院医学伦理委员会的审批（批文编号：2021-278）。
1.1.1 纳入标准
① 男女分布均衡、年龄46～74岁、体质量指数（body mass index，BMI） 18～23 kg/m2；② 结直肠癌患者（病理活检确诊）；③ 腹部B超、胸腹部CT或MRI检查提示无远处转移；④ 患者均为在甘肃生活20年以上的本地居民，饮食结构均衡；⑤ 胆囊结石伴胆囊炎或胆囊切除病史15年以上；⑥ 胆囊切除术后2年无胆管损伤、伤口感染、胆结石残留、脓肿形成和（或）胆管狭窄。
1.1.2 排除标准
① 年龄 <46岁或 >74岁、BMI <18 kg/m2或 >23 kg/m2；② 既往有结直肠癌手术史、胃癌手术史及妇科肿瘤手术史；③ 行新辅助放化疗；④ 既往有炎症性肠病、肠易激综合征、慢性腹痛、腹泻、肠梗阻、高血压等疾病；⑤ 既往有内分泌疾病病史（如2型糖尿病、库欣综合征、甲状腺功能亢进等）；⑥ 3个月内服用过免疫抑制剂、抗生素、益生菌、微生态活菌制剂、质子泵抑制剂、二甲双胍等相关药物；⑦ 既往有吸烟、饮酒史。
根据上述纳入及排除标准，本研究最终纳入29例结直肠癌患者作为研究对象，其中结直肠癌合并胆囊结石伴胆囊炎患者10例（胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组），胆囊切除术后结直肠癌患者10例（胆囊切除+结直肠癌组），胆囊正常结直肠癌患者9例（正常胆囊+结直肠癌组）。研究对象筛选流程见图1。
图1
示研究对象筛选流程
1.2 16S rDNA高通量测序方法
1.2.1 大便标本采集
纳入研究患者于入院后第1次自然排便时用无菌勺采集患者的新鲜大便标本约10 g，尽量避免尿液、灰尘等污染，装入已灭菌的大便收集管，立即存放于–30 ℃的冰柜中，并在6 h内置于–80 ℃冰箱冷冻保存备检。
1.2.2 主要试剂和仪器
① 主要试剂：DNA 抽提试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生化科技有限公司），FastPfu DNA 聚合酶（北京全式金生物技术股份有限公司），MiSeq试剂盒v3试剂盒和TruSeq纳米DNA LT文库制备试剂盒（美国Illumina 公司），Quant-iT PicoGreen双链DNA荧光定量检测试剂盒（北京诺为生物技术有限公司）。② 主要仪器：移液器（法国Gilson公司），离心机（长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司），电泳仪（北京六一生物科技有限公司），PCR仪（美国应用生物系统公司），MiSeq测序仪（美国Illumina 公司）， 微孔板阅读器 FLx800（美国BioTek仪器有限公司）， 超微量分光光度计（北京凯奥科技发展有限公司）；生物分析仪 ［安捷伦科技（中国）有限公司］。
1.2.3 DNA 提取、PCR 扩增
① DNA提取：称取大便样本200 mg至2 mL离心管中，然后按DNA抽提试剂盒（离心柱型）说明书进行DNA提取。② PCR扩增：抽取DNA对其定量，凝胶电泳检测其完整性，利用引物对16S rDNA V3～V4区进行PCR扩增，PCR正向引物（V3区）为：5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3′；反向引物（V4区）为：5′-GTCTCGTGGGCTCGG AGATGTGTATAAGAGACAGGACTAC HVGGGTATCTAATCC-3′。
1.2.4 文库制备及基因测序
采用TruSeq纳米DNA LT文库制备试剂盒（TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit）制备测序文库，在DNA序列的3′ 端添加A碱基以防止DNA片段自连，在序列5′ 端添加含有文库特异性标签（即Index序列）的测序接头，使DNA分子能被固定；先通过磁珠对文库纯化，再通过2%琼脂糖凝胶电泳回收，使用DNA凝胶回收试剂盒说明进行纯化，对文库做最终片段的选择与纯化。然后在生物分析仪上进行质检，并使用Quant-iT PicoGreen双链DNA荧光定量检测试剂盒对文库进行定量检测，将合格的测序文库按所需测序量等比例混合后在Illumina MiSeq平台上进行高通量测序。
1.3 生物信息学分析
1.3.1 操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）的聚类分析
使用MiSeq测序仪进行双端测序，为提高分析结果的准确性，使用DADA2方法进行序列去引物、质量过滤、去噪、拼接和去嵌合体，进行序列分析，将相似性 ≥97%的序列归为相同的OTU，运用数据分析平台进行样本肠道菌群的相关性分析。
1.3.2 稀释曲线
稀释曲线基于Chao1、Shannon和Simpson这 3个指数值，由R软件绘制。稀释曲线可以用来评估所得到的数据是否足以覆盖群落中的所有物种。当曲线趋于平缓时，表明产生的数据已足够。否则，当曲线随着测序工作量的增加而继续攀升时，表明样本的复杂性很高，仍然会有测序数据未发现的物种。
1.3.3 OTU维恩图
根据OTU丰度，列出各组的OTU，用R软件的Venn Diagram绘制韦恩图。维恩图可以直观地显示多样本中常见及唯一OTU的数量，结合代表物种的OTU，可以获得不同环境的核心微生物组。
1.3.4 物种注释
对各样本在各分类水平 ［如门（phylum）、纲（class）、目（order）、科（family）、属（genus）和种（species）］ 的鉴定结果进行统计，并使用R软件绘制直方图。基于Greengene数据库，使用QIIME2的classify-sklearn算法，将获得的每个OTU的代表序列与数据库进行相似性和物种注释比较，计算每个样本在不同分类水平上的群落组成，并用直方图可视化。
1.3.5 单一样本的多样性分析即Alpha多样性分析
通过多个指标来分析样本物种多样性的复杂性，包括observed species指数、 Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数、Faith’s PD指数、Pielou’s evenness指数和Good’s coverage指数。 observed species指数和Chao1指数反映群落的物种丰富度；Shannon指数、Simpson指数和Faith’s PD指数反映群落的物种多样性；Pielou’s evenness指数反映群落的均匀度；Good’s coverage指数反映群落的覆盖度。在物种丰富度相同的情况下，物种均匀度越大，群落多样性越高。使用R软件将数据绘制成箱式图，以直观地展示不同样本组之间Alpha多样性的差异，通过Kruskal-Wallis H秩和检验验证差异的显著性，P<0.05表示差异有统计学意义。
1.3.6 样本间多样性分析
评估样本间物种多样性方面的差异采用Beta多样性分析，即用不同的值来衡量Beta多样性，如Bray-Curtis、加权UniFrac、未加权UniFrac、Jaccard和Pearson，尤其是前3个值。Bray-Curtis距离是反映2个群落差异的常用指标；UniFrac是利用系统进化信息来比较样本间的群落物种组成，UniFrac距离可作为Beta多样性的衡量指标。它考虑了物种间的进化距离，指数越大，样本间的差异越大。
1.3.7 主坐标分析（principal coordinate analysis，PCoA）
PCoA是一种多元统计分析方法，基于样本距离矩阵进行降维处理，并将结果直观地呈现在二维坐标图中以反映组间的差异。利用QIIME2软件中的迭代算法，根据上述计算得到的Beta多样性指数矩阵行PCoA分析。2点在坐标轴上的投影距离越近，表明这2个样本在相应维度中的物种组成结构越相似，故群落差异较大的样本会远远分开，群落结构相似度高的样本则倾向于聚集在一起。
1.3.8 主成分分析（principal component analysis，PCA）
为了显示不同样本中OTU组成的差异，采用基于物种丰度矩阵进行降维处理的PCA构建二维图，2点在坐标轴上的投影距离越近，表明这2个样本间的物种丰度组成在相应维度中越相似。
1.4 统计学方法
采用SPSS 26.0统计软件进行人口资料及实验数据分析。 正态分布的计量资料使用均数±标准差（
±s）表示，3组间比较采用Tukey-Kramer单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用LSD-t检验；偏态分布的计量资料用中位数和四分位间距 ［M（IQR）］ 表示，组间比较使用Kruskal-Wallis H秩和检验。计数资料使用R×C 的Fisher精确检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 纳入患者的基本特征
本研究前瞻性纳入符合标准的结直肠癌患者29例，根据是否合并胆囊疾病分为3组，3组患者的人口特征见表1，由表1提示3组患者具有可比性。
表1
3组患者的基本特征
2.2 纳入患者的实验室检查结果
本研究3组患者的血清白细胞介素-6、降钙素原和总胆汁酸相比差异有统计学意义（P<0.05），但血清总胆汁酸值均在正常范围内。其余实验室检查结果在3组间相比差异均无统计学意义（P>0.05），具体见表2。
表2
3组患者的实验室检查结果
2.3 样本数据分析结果
通过16S rDNA高通量测序总共得到375.037 4万条原始序列，通过质控、去噪、拼接和去嵌合体后，得到242.251 1万条高质量扩增特征序列。通过稀释曲线可以看出，样本测序数据量合理，能够反映样本中绝大多数的微生物信息（图2a、2b）。
图2
示稀释曲线（a）、Shannon曲线（b）和3组间OUT组成的韦恩图（c）
a b c
2.4 OTU水平的韦恩分析结果
选用相似水平为97%的OTU样本表，进行聚类，绘制韦恩图。 3组29个样本共产生18 039个OTU（图2c）。
2.5 Alpha多样性分析结果
本研究对3组样本微生物群落多样性进行分析比较。由observed species指数和Chao1指数可知：胆囊切除+结直肠癌组和正常胆囊+结直肠癌组的群落丰度较胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组低，但差异无统计学意义（P>0.05），由Shannon指数、Simpson指数、Faith’s PD指数、Pielou’s evenness指数和Good’s coverage指数可知，群落的物种多样性、均匀度及覆盖度的差异均无统计学意义（P>0.05）。具体见图3a～3g。
图3
示Alpha多样性分析、PCoA、PCA以及3组在门和属水平上的菌群组成及相对丰度分析结果
a～g：Alpha多样性分析中各指数分析结果，Chao1指数（a）、Simpson指数（b）、Shannon指数（c）、Pielou’s evenness 指数（d）、observed species指数（e）、Faith’s PD指数（f）、Good’s coverage指数（g）；h：基于Weighted Unifrac距离的PCoA结果；i：3组在OTU水平上的PCA结果；j、k：3组在门（j）和属（k）水平上的菌群组成及相对丰度分析结果
2.6 Beta多样性分析结果
为了进一步显示样本间物种多样性的差异，采用PCoA来显示样本间的差异。PCoA结果中：坐标轴括号中的百分比代表了对应的坐标轴所能解释的样本差异数据（距离矩阵）的比例。具体见图3h，图中1个点代表1个样本，不同的颜色代表不同的组。其结果显示3组之间的细菌群落组成区分不明显。
2.7 PCA结果
PCA结果中：X轴代表第一主成分，Y轴代表第二主成分；括号中的47.7%代表PC1成分对样本的贡献，19.8%代表PC2成分对样本的贡献，具体见图3i，图中1个点代表1个样本，不同的颜色代表不同的组。其结果显示3组之间的物种丰度组成区分不明显。
2.8 群落结构分析结果
2.8.1 门水平的群落组成分析结果
在门水平上，3组样本中拟杆菌（Bacteroidetes）门、厚壁菌（Firmicutes）门、变形杆菌（Proteobacteria）门、梭杆菌（Fusobacteria）门和疣微菌（Verrucomicrobia）门的相对丰度都较高，几乎占据了肠道细菌总量的95%以上。其中梭杆菌门的相对丰度在胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组较正常胆囊+结直肠癌组升高（Z=–2.104，P=0.035）；疣微菌门的相对丰度在正常胆囊+结直肠癌组较胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组和胆囊切除+结直肠癌组升高（Z=–2.207，P=0.027；Z=–2.027，P=0.042）；胆囊切除+结直肠癌组的互养菌（Synergistetes）门的相对丰度较胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组和正常胆囊+结直肠癌组增高（Z=–2.304，P=0.021；Z=–2.410，P=0.016），见图3j。
2.8.2 属水平的群落组成分析
在属水平上，拟杆菌属的相对丰度在胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组较胆囊切除+结直肠癌组和正常胆囊+结直肠癌组降低（Z=–2.268，P=0.023；Z=–2.342，P=0.019）；罗斯菌（Roseburia）属的相对丰度在胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组较胆囊切除+结直肠癌组和正常胆囊+结直肠癌组降低（Z=–2.297，P=0.021；Z=–1.988，P=0.047）；志贺杆菌（Shigella）属的相对丰度在胆囊切除+结直肠癌组较胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组增高（Z=–2.192，P=0.028）；毛螺旋菌（Lachnospira）属的相对丰度在胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组较正常胆囊+结直肠癌组降低（Z=–1.967，P=0.049）；普氏菌（Prevotella）属的相对丰度在胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组较胆囊切除+结直肠癌组和正常胆囊+结直肠癌组增高（Z=–2.859，P=0.004；Z=–2.843，P=0.004）；梭杆菌属的相对丰度在胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组较胆囊切除+结直肠癌组和正常胆囊+结直肠癌组增高（Z=–2.085，P=0.037；Z=–2.170，P=0.030）；梭菌（Clostridium）属的相对丰度在胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组和胆囊切除+结直肠癌组较正常胆囊+结直肠癌组降低（Z=–2.043，P=0.041；Z=–2.043，P=0.041）；肠球菌（Enterococcus）属的相对丰度在正常胆囊+结直肠癌组较胆囊切除+结直肠癌组增高（Z=–2.121，P=0.033）；阿克曼菌（Akkermansia）属的相对丰度在正常胆囊+结直肠癌组较胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组和胆囊切除+结直肠癌组增高（Z=–2.134，P=0.032；Z=–2.067，P=0.038）。具体见图3k。
3 讨论
肠道菌群作为人体内最大的微生物群体，在人类疾病预防和治疗中的作用逐渐被重视。伴随着高通量测序技术的广泛使用，人们逐渐发现肠道菌群参与人体内环境稳态及皮脂溢出、肾脏疾病、炎症性肠病、妇科肿瘤等疾病的发生与发展[3-5]。此外，不良的饮食习惯、医源性抗生素等药物的滥用及益生菌的广泛使用也会影响肠道菌群结构的变化。
已经有动物实验证实肠道微生物群落的改变可以促进结直肠癌的发生和发展。 Wong等[6]和Jobin等[7]的研究将结直肠癌患者和健康自愿者的粪便菌群移植到无菌小鼠和常规小鼠体内，喂食结直肠癌患者粪便的常规小鼠与喂食健康自愿者粪便的常规小鼠相比，表现为肠道细胞高度不典型增生和肉眼可见的息肉明显增多；与喂食健康自愿者粪便的无菌小鼠相比，喂食结直肠癌患者粪便的无菌小鼠表现为结肠细胞异常增殖，但两种小鼠的粪便菌群丰度均下降。因此有充分理由认为，将结直肠癌患者的粪便样本进行灌胃会促进无菌小鼠和常规小鼠的肠道发生癌变。有研究[8-10]发现，与健康自愿者相比，结直肠癌患者肠道中梭杆菌门、变形菌门、梭杆菌属、脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）属、肠球菌属、大肠杆菌/志贺菌（Escherichia/Shigella）属、克雷伯杆菌（Klebsiella）属、链球菌（Streptococcus）属、瘤胃球菌属、粪芽孢菌（Coprobacillus）属、伯克霍尔德菌（Burkholderia）属、卟啉单胞菌（Porphyromonas）属、副球菌（Paracoccus）、嗜胨菌属（Peptoniphilus）属、聚球藻（Synechococcus）属、蓝丝菌（Cyanothece）属、梭菌属、消化链球菌（Peptostreptococcus）属等菌群丰度显著升高，而罗斯菌属和毛螺旋菌属菌群丰度显著降低。胆囊结石可导致多种消化系统并发症并导致炎症。有研究[11-13]表明，与健康自愿者相比，胆囊结石患者肠道微生物群中变形杆菌、蓝细菌门、梭杆菌门、螺旋体（Spirochaetes）门等菌群丰度显著增加，而粪杆菌（Faecalibacterium）属、毛螺旋菌属和罗斯菌属菌群丰度明显降低。本研究比较了结直肠癌患者中正常胆囊、胆囊结石伴胆囊炎和胆囊切除术后患者的微生物组成，进一步确定与结直肠癌发展密切相关的菌群。
人体内肠道菌群组成复杂，其中主要为拟杆菌门和厚壁菌门 [14]。本研究也证实3组样本的优势菌门分别为拟杆菌门、厚壁菌门、变形杆菌门、梭杆菌门和疣微菌门。高丰度的瘤胃球菌和拟杆菌会促进肠道炎症反应，增加患结直肠癌的风险，而乳酸杆菌、双歧杆菌和产丁酸盐细菌能够保护肠黏膜，减轻肠道炎症反应[15-16]。Ohigashi等[17]分析结直肠癌患者肠道菌群变化发现，常见的菌群改变特点是条件致病菌的数量明显增加和产丁酸盐细菌的数量明显减少。产丁酸盐细菌是肠道内通过发酵膳食纤维产生大量短链脂肪酸的一类细菌。短链脂肪酸尤其是丁酸盐、丙酸盐和乙酸盐，通过调节局部免疫反应和保护肠道屏障，在维持结肠黏膜的正常生理功能方面发挥着至关重要的作用[18]。丁酸盐的抗肿瘤作用与丁酸盐抑制结肠细胞和免疫细胞中的组蛋白去乙酰化酶活性，从而下调促炎细胞因子并诱导结直肠癌细胞凋亡有关，丁酸盐和丙酸盐通过调节结肠T细胞分化来塑造黏膜免疫系统[19]。除了抗癌作用外，短链脂肪酸在肠道中还具有抗炎作用，丁酸盐在肠上皮细胞中通过降低白细胞介素-8的表达和抑制诱导型一氧化氮合酶的表达来调节结肠炎症[20]。丁酸盐通过影响自由基清除蛋白质的表达和谷胱甘肽S-转移酶（一种负责代谢潜在致癌物的蛋白质）活性来减轻氧化应激，保护肠黏膜细胞免受DNA氧化损伤[21]。已知产丁酸盐的细菌有瘤胃球菌属、梭菌属、粪球菌属和罗斯菌属 [22]。Wu等[11]分析胆囊结石患者与健康自愿者肠道微生物群发现，粪杆菌属、毛螺旋菌属和罗斯菌属在胆囊结石患者组菌群丰度明显降低。本研究中，与正常胆囊+结直肠癌组相比，胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组的拟杆菌属、罗斯菌属、梭菌属、毛螺旋菌属及疣微菌门的相对丰度均降低，而普氏菌属、梭杆菌属和梭杆菌门的相对丰度均增高。该结果提示，长期患胆囊结石伴胆囊炎会引起肠道菌群紊乱，但是否直接影响结直肠癌的发生发展仍需要进一步的大规模研究来验证。
胆囊具有吸收和分泌功能，有助于胆汁流入肠道，因此胆囊疾病患者易患消化道肿瘤[23]。胆囊结石患者常伴有慢性胆囊炎，长期反复的炎症刺激易引起胆汁酸代谢紊乱，导致肠黏膜结构的改变，从而诱发肠炎，而肠炎反复发作则会导致肠道组织产生息肉，增加结直肠癌的发病率风险[24]。Keren等[12]分析比较胆囊结石患者胆囊切除术前后粪便微生物群变化发现，拟杆菌门的丰度在胆囊切除术后明显增加。Grigor’eva等[25]研究表明，胆囊切除术前后拟杆菌门丰度几乎没有变化，本研究结果与此相同。Wang等[26]研究比较了胆囊切除术后患者粪便微生物与健康人群发现的细菌种类没有差异，但群落丰度显著降低，在胆囊切除术患者中，拟杆菌属、普氏菌属、脱硫弧菌（Desulfovibrio）属、巴尼斯菌（Barnesiella）属、帕鲁菌（Paludibacter）属和另枝菌（Alistipes）属的群落丰度均降低，而厌氧棒状菌（Anaerostipes）属、多尔菌（Dorea）属和肠球菌属的丰度均增高。本研究中，与正常胆囊+结直肠癌组相比，胆囊切除+结直肠癌组的梭菌属、肠球菌属、阿克曼菌属和疣微菌门的相对丰度降低，互养菌门的相对丰度增高。
拟杆菌属是重要的临床病原体，存在于大多数厌氧感染中，相关死亡率超过19%，当这些细菌停留在肠道中时，它们通常与宿主保持着一种复杂且有益的关系，当它们脱离这种共生状态时会导致严重的病理状态，包括在身体多个部位形成菌血症和脓肿[27]。基因组学和蛋白质组学的分析极大地加深了我们对拟杆菌属等物种适应人类肠道环境并在其中生长方式的理解[28]。例如：① 感知和适应营养供应的复杂系统；② 多泵系统排出有毒物质；③ 影响宿主免疫系统以控制其他（竞争的）病原体的能力。在所有厌氧病原体中，拟杆菌属具有最高的耐药率[29]。临床上，拟杆菌属对许多抗生素的耐药性增加，包括头孢西丁、克林霉素、甲硝唑、碳青霉烯类和氟喹诺酮类药物（如加替沙星、左氧氟沙星和莫西沙星）。本研究中，拟杆菌属的相对丰度在胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组较胆囊切除+结直肠癌组和正常胆囊+结直肠癌组降低。提示长期患胆囊结石伴胆囊炎可能会破坏人体与肠道菌群互利共生的平衡状态，从而影响疾病的发生发展。
梭杆菌属是一种革兰阴性厌氧菌，是健康人口腔和胃肠道微生物群中天然存在的共生微生物之一，一直被认为是一种条件致病菌[30-31]。有研究[32]发现，梭杆菌属可以穿透肿瘤细胞并引起促炎细胞因子的释放，包括IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α，帮助构建结直肠癌发生的免疫微环境。梭杆菌属相关结直肠癌的潜在机制[33]包括：① 突变的上皮细胞导致局部肠道屏障受损，这使梭杆菌属有机会黏附并侵入上皮细胞。一旦梭杆菌黏附素A（fusobacterium adhesin A，FadA；梭杆菌属的一种膜蛋白）与E-钙黏蛋白结合并被上皮细胞内化，β-连环蛋白信号通路就会被激活。② 磷酸化的β-catenin会从细胞质进入细胞核，促进核转录因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）基因、促炎基因和许多其他癌基因的表达。 ③ 恶性肿瘤的肠道微环境是缺氧和酸性的，梭杆菌属比其他细菌更适合在此条件下繁殖。梭杆菌属引起髓系来源抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）的富集，进而抑制抗肿瘤免疫并促进结直肠黏膜细胞癌变的发生。Keren等[12]研究发现，梭杆菌门在健康自愿者组的相对丰度较胆囊切除术组明显降低。本研究发现，梭杆菌门的相对丰度在胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组增高，与胆囊切除+结直肠癌组相比差异无统计学意义（P>0.05），与正常胆囊+结直肠癌组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。与胆囊切除+结直肠癌组和正常胆囊+结直肠癌组相比，梭杆菌属和白细胞介素-6在胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组明显增高，且差异均具有统计学意义（P<0.05）。由此提示：长期患胆囊结石伴胆囊炎的患者，肠道中梭杆菌属的富集可能促进了炎症细胞因子（如白细胞介素-6）的释放，为肠道创造了一个肿瘤发生的免疫微环境，引起肠道长期的慢性炎症，进而促进结直肠癌的发生发展。这与之前的研究认为胆囊切除术后梭杆菌属富集促进结直肠癌的发生发展的研究结论不一致。可能的原因是胆囊切除术之前长期胆囊结石伴胆囊炎已经引起肠道菌群的改变，甚至导致癌前病变。
综上所述，肠道菌群的种类与数量平衡状态发生改变在结直肠癌的发生发展及治疗机制中起着关键作用，肠道菌群失调会影响免疫和化学治疗，以及药物的疗效。所以，临床医生在结直肠癌的诊治过程中，不仅要尽量全面评估患者肠道微生态，还要尽量谨慎、严格地使用抗生素等药物，避免破坏肠道菌群。本研究结果提示：长期患胆囊结石伴胆囊炎及胆囊切除术后会导致肠道菌群种类和数量的改变，但是否会增加患结直肠癌的风险，还需大规模的长期随访研究加以验证；更加深入探讨胆囊结石伴胆囊炎和胆囊切除术后特定菌群改变与结直肠癌发生发展的机制，为肠道微生态相关疾病的预防、诊断和治疗提供新思路。调节肠道菌群或添加益生菌对免疫和化学治疗有益，甚至在未来的某一天，益生菌会在致癌过程中破坏肿瘤细胞。建议临床医生应尝试使用益生菌来维持和改善肠道微生态平衡，从而预防结直肠癌的发生。
重要声明
利益冲突声明： 本研究中的全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。
作者贡献声明： 李晶晶负责文章撰写及数据收集；朱成章负责辅助撰稿及统计学分析；史新龙和杜斌斌负责伦理审批及稿件修改；杨熊飞负责跟进整个研究进度。
伦理声明： 本研究方案通过了甘肃省人民医院医学伦理委员会的审批（批文编号： 2021-278）。
随着代谢组学和基因测序技术在分子生物学中的应用及发展，发现肠道菌群改变与结直肠癌的发生发展关系紧密[1]。胆囊结石是胆道系统的常见疾病，从无症状的胆囊结石（多由体检发现）到有症状的胆囊结石（胆绞痛、上腹隐痛、恶心、呕吐），再到有并发症的胆囊结石（包括胆囊炎、继发性胆总管结石、胆源性胰腺炎、Mirizzi综合征及胆囊癌）。腹腔镜胆囊切除术是治疗胆囊结石的有效手段。胆囊切除术后未浓缩的胆汁大量流入肠道影响胆汁酸的肠肝循环，结肠内胆汁酸的增加改变肠黏膜的通透性，影响肠道微生物群，增加了结直肠癌的发生风险[2]。然而，有关胆囊切除术后胆汁酸代谢途径改变进而引起患者肠道菌群发生变化，是否会导致某种具有致癌潜力的微生物群落发展，以及是否直接导致结直肠癌的发生发展知之甚少。为此，本研究采用16S rDNA高通量测序技术测定粪便微生物群组成，旨在探究胆囊结石及胆囊切除术后引起肠道菌群失调与结直肠癌发病的相关性，为预防和治疗结直肠癌提供新思路。
1 资料与方法
1.1 研究对象
采用前瞻性研究方法，收集2020年6月至2021年3月期间就诊于甘肃省人民医院肛肠科的168例患者，所有患者均进行电子结肠镜检查及病理活检确诊为结直肠癌，经彩色多普勒超声证实无胆管结石和胆石性息肉，收集患者的临床资料、实验室检查结果和粪便样本。所有患者均签署知情同意书，本研究通过了甘肃省人民医院医学伦理委员会的审批（批文编号：2021-278）。
1.1.1 纳入标准
① 男女分布均衡、年龄46～74岁、体质量指数（body mass index，BMI） 18～23 kg/m2；② 结直肠癌患者（病理活检确诊）；③ 腹部B超、胸腹部CT或MRI检查提示无远处转移；④ 患者均为在甘肃生活20年以上的本地居民，饮食结构均衡；⑤ 胆囊结石伴胆囊炎或胆囊切除病史15年以上；⑥ 胆囊切除术后2年无胆管损伤、伤口感染、胆结石残留、脓肿形成和（或）胆管狭窄。
1.1.2 排除标准
① 年龄 <46岁或 >74岁、BMI <18 kg/m2或 >23 kg/m2；② 既往有结直肠癌手术史、胃癌手术史及妇科肿瘤手术史；③ 行新辅助放化疗；④ 既往有炎症性肠病、肠易激综合征、慢性腹痛、腹泻、肠梗阻、高血压等疾病；⑤ 既往有内分泌疾病病史（如2型糖尿病、库欣综合征、甲状腺功能亢进等）；⑥ 3个月内服用过免疫抑制剂、抗生素、益生菌、微生态活菌制剂、质子泵抑制剂、二甲双胍等相关药物；⑦ 既往有吸烟、饮酒史。
根据上述纳入及排除标准，本研究最终纳入29例结直肠癌患者作为研究对象，其中结直肠癌合并胆囊结石伴胆囊炎患者10例（胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组），胆囊切除术后结直肠癌患者10例（胆囊切除+结直肠癌组），胆囊正常结直肠癌患者9例（正常胆囊+结直肠癌组）。研究对象筛选流程见图1。
图1
示研究对象筛选流程
1.2 16S rDNA高通量测序方法
1.2.1 大便标本采集
纳入研究患者于入院后第1次自然排便时用无菌勺采集患者的新鲜大便标本约10 g，尽量避免尿液、灰尘等污染，装入已灭菌的大便收集管，立即存放于–30 ℃的冰柜中，并在6 h内置于–80 ℃冰箱冷冻保存备检。
1.2.2 主要试剂和仪器
① 主要试剂：DNA 抽提试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生化科技有限公司），FastPfu DNA 聚合酶（北京全式金生物技术股份有限公司），MiSeq试剂盒v3试剂盒和TruSeq纳米DNA LT文库制备试剂盒（美国Illumina 公司），Quant-iT PicoGreen双链DNA荧光定量检测试剂盒（北京诺为生物技术有限公司）。② 主要仪器：移液器（法国Gilson公司），离心机（长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司），电泳仪（北京六一生物科技有限公司），PCR仪（美国应用生物系统公司），MiSeq测序仪（美国Illumina 公司）， 微孔板阅读器 FLx800（美国BioTek仪器有限公司）， 超微量分光光度计（北京凯奥科技发展有限公司）；生物分析仪 ［安捷伦科技（中国）有限公司］。
1.2.3 DNA 提取、PCR 扩增
① DNA提取：称取大便样本200 mg至2 mL离心管中，然后按DNA抽提试剂盒（离心柱型）说明书进行DNA提取。② PCR扩增：抽取DNA对其定量，凝胶电泳检测其完整性，利用引物对16S rDNA V3～V4区进行PCR扩增，PCR正向引物（V3区）为：5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3′；反向引物（V4区）为：5′-GTCTCGTGGGCTCGG AGATGTGTATAAGAGACAGGACTAC HVGGGTATCTAATCC-3′。
1.2.4 文库制备及基因测序
采用TruSeq纳米DNA LT文库制备试剂盒（TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit）制备测序文库，在DNA序列的3′ 端添加A碱基以防止DNA片段自连，在序列5′ 端添加含有文库特异性标签（即Index序列）的测序接头，使DNA分子能被固定；先通过磁珠对文库纯化，再通过2%琼脂糖凝胶电泳回收，使用DNA凝胶回收试剂盒说明进行纯化，对文库做最终片段的选择与纯化。然后在生物分析仪上进行质检，并使用Quant-iT PicoGreen双链DNA荧光定量检测试剂盒对文库进行定量检测，将合格的测序文库按所需测序量等比例混合后在Illumina MiSeq平台上进行高通量测序。
1.3 生物信息学分析
1.3.1 操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）的聚类分析
使用MiSeq测序仪进行双端测序，为提高分析结果的准确性，使用DADA2方法进行序列去引物、质量过滤、去噪、拼接和去嵌合体，进行序列分析，将相似性 ≥97%的序列归为相同的OTU，运用数据分析平台进行样本肠道菌群的相关性分析。
1.3.2 稀释曲线
稀释曲线基于Chao1、Shannon和Simpson这 3个指数值，由R软件绘制。稀释曲线可以用来评估所得到的数据是否足以覆盖群落中的所有物种。当曲线趋于平缓时，表明产生的数据已足够。否则，当曲线随着测序工作量的增加而继续攀升时，表明样本的复杂性很高，仍然会有测序数据未发现的物种。
1.3.3 OTU维恩图
根据OTU丰度，列出各组的OTU，用R软件的Venn Diagram绘制韦恩图。维恩图可以直观地显示多样本中常见及唯一OTU的数量，结合代表物种的OTU，可以获得不同环境的核心微生物组。
1.3.4 物种注释
对各样本在各分类水平 ［如门（phylum）、纲（class）、目（order）、科（family）、属（genus）和种（species）］ 的鉴定结果进行统计，并使用R软件绘制直方图。基于Greengene数据库，使用QIIME2的classify-sklearn算法，将获得的每个OTU的代表序列与数据库进行相似性和物种注释比较，计算每个样本在不同分类水平上的群落组成，并用直方图可视化。
1.3.5 单一样本的多样性分析即Alpha多样性分析
通过多个指标来分析样本物种多样性的复杂性，包括observed species指数、 Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数、Faith’s PD指数、Pielou’s evenness指数和Good’s coverage指数。 observed species指数和Chao1指数反映群落的物种丰富度；Shannon指数、Simpson指数和Faith’s PD指数反映群落的物种多样性；Pielou’s evenness指数反映群落的均匀度；Good’s coverage指数反映群落的覆盖度。在物种丰富度相同的情况下，物种均匀度越大，群落多样性越高。使用R软件将数据绘制成箱式图，以直观地展示不同样本组之间Alpha多样性的差异，通过Kruskal-Wallis H秩和检验验证差异的显著性，P<0.05表示差异有统计学意义。
1.3.6 样本间多样性分析
评估样本间物种多样性方面的差异采用Beta多样性分析，即用不同的值来衡量Beta多样性，如Bray-Curtis、加权UniFrac、未加权UniFrac、Jaccard和Pearson，尤其是前3个值。Bray-Curtis距离是反映2个群落差异的常用指标；UniFrac是利用系统进化信息来比较样本间的群落物种组成，UniFrac距离可作为Beta多样性的衡量指标。它考虑了物种间的进化距离，指数越大，样本间的差异越大。
1.3.7 主坐标分析（principal coordinate analysis，PCoA）
PCoA是一种多元统计分析方法，基于样本距离矩阵进行降维处理，并将结果直观地呈现在二维坐标图中以反映组间的差异。利用QIIME2软件中的迭代算法，根据上述计算得到的Beta多样性指数矩阵行PCoA分析。2点在坐标轴上的投影距离越近，表明这2个样本在相应维度中的物种组成结构越相似，故群落差异较大的样本会远远分开，群落结构相似度高的样本则倾向于聚集在一起。
1.3.8 主成分分析（principal component analysis，PCA）
为了显示不同样本中OTU组成的差异，采用基于物种丰度矩阵进行降维处理的PCA构建二维图，2点在坐标轴上的投影距离越近，表明这2个样本间的物种丰度组成在相应维度中越相似。
1.4 统计学方法
采用SPSS 26.0统计软件进行人口资料及实验数据分析。 正态分布的计量资料使用均数±标准差（±s）表示，3组间比较采用Tukey-Kramer单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用LSD-t检验；偏态分布的计量资料用中位数和四分位间距 ［M（IQR）］ 表示，组间比较使用Kruskal-Wallis H秩和检验。计数资料使用R×C 的Fisher精确检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 纳入患者的基本特征
本研究前瞻性纳入符合标准的结直肠癌患者29例，根据是否合并胆囊疾病分为3组，3组患者的人口特征见表1，由表1提示3组患者具有可比性。
表1
3组患者的基本特征
2.2 纳入患者的实验室检查结果
本研究3组患者的血清白细胞介素-6、降钙素原和总胆汁酸相比差异有统计学意义（P<0.05），但血清总胆汁酸值均在正常范围内。其余实验室检查结果在3组间相比差异均无统计学意义（P>0.05），具体见表2。
表2
3组患者的实验室检查结果
2.3 样本数据分析结果
通过16S rDNA高通量测序总共得到375.037 4万条原始序列，通过质控、去噪、拼接和去嵌合体后，得到242.251 1万条高质量扩增特征序列。通过稀释曲线可以看出，样本测序数据量合理，能够反映样本中绝大多数的微生物信息（图2a、2b）。
图2
示稀释曲线（a）、Shannon曲线（b）和3组间OUT组成的韦恩图（c）
a b c
2.4 OTU水平的韦恩分析结果
选用相似水平为97%的OTU样本表，进行聚类，绘制韦恩图。 3组29个样本共产生18 039个OTU（图2c）。
2.5 Alpha多样性分析结果
本研究对3组样本微生物群落多样性进行分析比较。由observed species指数和Chao1指数可知：胆囊切除+结直肠癌组和正常胆囊+结直肠癌组的群落丰度较胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组低，但差异无统计学意义（P>0.05），由Shannon指数、Simpson指数、Faith’s PD指数、Pielou’s evenness指数和Good’s coverage指数可知，群落的物种多样性、均匀度及覆盖度的差异均无统计学意义（P>0.05）。具体见图3a～3g。
图3
示Alpha多样性分析、PCoA、PCA以及3组在门和属水平上的菌群组成及相对丰度分析结果
a～g：Alpha多样性分析中各指数分析结果，Chao1指数（a）、Simpson指数（b）、Shannon指数（c）、Pielou’s evenness 指数（d）、observed species指数（e）、Faith’s PD指数（f）、Good’s coverage指数（g）；h：基于Weighted Unifrac距离的PCoA结果；i：3组在OTU水平上的PCA结果；j、k：3组在门（j）和属（k）水平上的菌群组成及相对丰度分析结果
2.6 Beta多样性分析结果
为了进一步显示样本间物种多样性的差异，采用PCoA来显示样本间的差异。PCoA结果中：坐标轴括号中的百分比代表了对应的坐标轴所能解释的样本差异数据（距离矩阵）的比例。具体见图3h，图中1个点代表1个样本，不同的颜色代表不同的组。其结果显示3组之间的细菌群落组成区分不明显。
2.7 PCA结果
PCA结果中：X轴代表第一主成分，Y轴代表第二主成分；括号中的47.7%代表PC1成分对样本的贡献，19.8%代表PC2成分对样本的贡献，具体见图3i，图中1个点代表1个样本，不同的颜色代表不同的组。其结果显示3组之间的物种丰度组成区分不明显。
2.8 群落结构分析结果
2.8.1 门水平的群落组成分析结果
在门水平上，3组样本中拟杆菌（Bacteroidetes）门、厚壁菌（Firmicutes）门、变形杆菌（Proteobacteria）门、梭杆菌（Fusobacteria）门和疣微菌（Verrucomicrobia）门的相对丰度都较高，几乎占据了肠道细菌总量的95%以上。其中梭杆菌门的相对丰度在胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组较正常胆囊+结直肠癌组升高（Z=–2.104，P=0.035）；疣微菌门的相对丰度在正常胆囊+结直肠癌组较胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组和胆囊切除+结直肠癌组升高（Z=–2.207，P=0.027；Z=–2.027，P=0.042）；胆囊切除+结直肠癌组的互养菌（Synergistetes）门的相对丰度较胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组和正常胆囊+结直肠癌组增高（Z=–2.304，P=0.021；Z=–2.410，P=0.016），见图3j。
2.8.2 属水平的群落组成分析
在属水平上，拟杆菌属的相对丰度在胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组较胆囊切除+结直肠癌组和正常胆囊+结直肠癌组降低（Z=–2.268，P=0.023；Z=–2.342，P=0.019）；罗斯菌（Roseburia）属的相对丰度在胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组较胆囊切除+结直肠癌组和正常胆囊+结直肠癌组降低（Z=–2.297，P=0.021；Z=–1.988，P=0.047）；志贺杆菌（Shigella）属的相对丰度在胆囊切除+结直肠癌组较胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组增高（Z=–2.192，P=0.028）；毛螺旋菌（Lachnospira）属的相对丰度在胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组较正常胆囊+结直肠癌组降低（Z=–1.967，P=0.049）；普氏菌（Prevotella）属的相对丰度在胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组较胆囊切除+结直肠癌组和正常胆囊+结直肠癌组增高（Z=–2.859，P=0.004；Z=–2.843，P=0.004）；梭杆菌属的相对丰度在胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组较胆囊切除+结直肠癌组和正常胆囊+结直肠癌组增高（Z=–2.085，P=0.037；Z=–2.170，P=0.030）；梭菌（Clostridium）属的相对丰度在胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组和胆囊切除+结直肠癌组较正常胆囊+结直肠癌组降低（Z=–2.043，P=0.041；Z=–2.043，P=0.041）；肠球菌（Enterococcus）属的相对丰度在正常胆囊+结直肠癌组较胆囊切除+结直肠癌组增高（Z=–2.121，P=0.033）；阿克曼菌（Akkermansia）属的相对丰度在正常胆囊+结直肠癌组较胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组和胆囊切除+结直肠癌组增高（Z=–2.134，P=0.032；Z=–2.067，P=0.038）。具体见图3k。
3 讨论
肠道菌群作为人体内最大的微生物群体，在人类疾病预防和治疗中的作用逐渐被重视。伴随着高通量测序技术的广泛使用，人们逐渐发现肠道菌群参与人体内环境稳态及皮脂溢出、肾脏疾病、炎症性肠病、妇科肿瘤等疾病的发生与发展[3-5]。此外，不良的饮食习惯、医源性抗生素等药物的滥用及益生菌的广泛使用也会影响肠道菌群结构的变化。
已经有动物实验证实肠道微生物群落的改变可以促进结直肠癌的发生和发展。 Wong等[6]和Jobin等[7]的研究将结直肠癌患者和健康自愿者的粪便菌群移植到无菌小鼠和常规小鼠体内，喂食结直肠癌患者粪便的常规小鼠与喂食健康自愿者粪便的常规小鼠相比，表现为肠道细胞高度不典型增生和肉眼可见的息肉明显增多；与喂食健康自愿者粪便的无菌小鼠相比，喂食结直肠癌患者粪便的无菌小鼠表现为结肠细胞异常增殖，但两种小鼠的粪便菌群丰度均下降。因此有充分理由认为，将结直肠癌患者的粪便样本进行灌胃会促进无菌小鼠和常规小鼠的肠道发生癌变。有研究[8-10]发现，与健康自愿者相比，结直肠癌患者肠道中梭杆菌门、变形菌门、梭杆菌属、脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）属、肠球菌属、大肠杆菌/志贺菌（Escherichia/Shigella）属、克雷伯杆菌（Klebsiella）属、链球菌（Streptococcus）属、瘤胃球菌属、粪芽孢菌（Coprobacillus）属、伯克霍尔德菌（Burkholderia）属、卟啉单胞菌（Porphyromonas）属、副球菌（Paracoccus）、嗜胨菌属（Peptoniphilus）属、聚球藻（Synechococcus）属、蓝丝菌（Cyanothece）属、梭菌属、消化链球菌（Peptostreptococcus）属等菌群丰度显著升高，而罗斯菌属和毛螺旋菌属菌群丰度显著降低。胆囊结石可导致多种消化系统并发症并导致炎症。有研究[11-13]表明，与健康自愿者相比，胆囊结石患者肠道微生物群中变形杆菌、蓝细菌门、梭杆菌门、螺旋体（Spirochaetes）门等菌群丰度显著增加，而粪杆菌（Faecalibacterium）属、毛螺旋菌属和罗斯菌属菌群丰度明显降低。本研究比较了结直肠癌患者中正常胆囊、胆囊结石伴胆囊炎和胆囊切除术后患者的微生物组成，进一步确定与结直肠癌发展密切相关的菌群。
人体内肠道菌群组成复杂，其中主要为拟杆菌门和厚壁菌门 [14]。本研究也证实3组样本的优势菌门分别为拟杆菌门、厚壁菌门、变形杆菌门、梭杆菌门和疣微菌门。高丰度的瘤胃球菌和拟杆菌会促进肠道炎症反应，增加患结直肠癌的风险，而乳酸杆菌、双歧杆菌和产丁酸盐细菌能够保护肠黏膜，减轻肠道炎症反应[15-16]。Ohigashi等[17]分析结直肠癌患者肠道菌群变化发现，常见的菌群改变特点是条件致病菌的数量明显增加和产丁酸盐细菌的数量明显减少。产丁酸盐细菌是肠道内通过发酵膳食纤维产生大量短链脂肪酸的一类细菌。短链脂肪酸尤其是丁酸盐、丙酸盐和乙酸盐，通过调节局部免疫反应和保护肠道屏障，在维持结肠黏膜的正常生理功能方面发挥着至关重要的作用[18]。丁酸盐的抗肿瘤作用与丁酸盐抑制结肠细胞和免疫细胞中的组蛋白去乙酰化酶活性，从而下调促炎细胞因子并诱导结直肠癌细胞凋亡有关，丁酸盐和丙酸盐通过调节结肠T细胞分化来塑造黏膜免疫系统[19]。除了抗癌作用外，短链脂肪酸在肠道中还具有抗炎作用，丁酸盐在肠上皮细胞中通过降低白细胞介素-8的表达和抑制诱导型一氧化氮合酶的表达来调节结肠炎症[20]。丁酸盐通过影响自由基清除蛋白质的表达和谷胱甘肽S-转移酶（一种负责代谢潜在致癌物的蛋白质）活性来减轻氧化应激，保护肠黏膜细胞免受DNA氧化损伤[21]。已知产丁酸盐的细菌有瘤胃球菌属、梭菌属、粪球菌属和罗斯菌属 [22]。Wu等[11]分析胆囊结石患者与健康自愿者肠道微生物群发现，粪杆菌属、毛螺旋菌属和罗斯菌属在胆囊结石患者组菌群丰度明显降低。本研究中，与正常胆囊+结直肠癌组相比，胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组的拟杆菌属、罗斯菌属、梭菌属、毛螺旋菌属及疣微菌门的相对丰度均降低，而普氏菌属、梭杆菌属和梭杆菌门的相对丰度均增高。该结果提示，长期患胆囊结石伴胆囊炎会引起肠道菌群紊乱，但是否直接影响结直肠癌的发生发展仍需要进一步的大规模研究来验证。
胆囊具有吸收和分泌功能，有助于胆汁流入肠道，因此胆囊疾病患者易患消化道肿瘤[23]。胆囊结石患者常伴有慢性胆囊炎，长期反复的炎症刺激易引起胆汁酸代谢紊乱，导致肠黏膜结构的改变，从而诱发肠炎，而肠炎反复发作则会导致肠道组织产生息肉，增加结直肠癌的发病率风险[24]。Keren等[12]分析比较胆囊结石患者胆囊切除术前后粪便微生物群变化发现，拟杆菌门的丰度在胆囊切除术后明显增加。Grigor’eva等[25]研究表明，胆囊切除术前后拟杆菌门丰度几乎没有变化，本研究结果与此相同。Wang等[26]研究比较了胆囊切除术后患者粪便微生物与健康人群发现的细菌种类没有差异，但群落丰度显著降低，在胆囊切除术患者中，拟杆菌属、普氏菌属、脱硫弧菌（Desulfovibrio）属、巴尼斯菌（Barnesiella）属、帕鲁菌（Paludibacter）属和另枝菌（Alistipes）属的群落丰度均降低，而厌氧棒状菌（Anaerostipes）属、多尔菌（Dorea）属和肠球菌属的丰度均增高。本研究中，与正常胆囊+结直肠癌组相比，胆囊切除+结直肠癌组的梭菌属、肠球菌属、阿克曼菌属和疣微菌门的相对丰度降低，互养菌门的相对丰度增高。
拟杆菌属是重要的临床病原体，存在于大多数厌氧感染中，相关死亡率超过19%，当这些细菌停留在肠道中时，它们通常与宿主保持着一种复杂且有益的关系，当它们脱离这种共生状态时会导致严重的病理状态，包括在身体多个部位形成菌血症和脓肿[27]。基因组学和蛋白质组学的分析极大地加深了我们对拟杆菌属等物种适应人类肠道环境并在其中生长方式的理解[28]。例如：① 感知和适应营养供应的复杂系统；② 多泵系统排出有毒物质；③ 影响宿主免疫系统以控制其他（竞争的）病原体的能力。在所有厌氧病原体中，拟杆菌属具有最高的耐药率[29]。临床上，拟杆菌属对许多抗生素的耐药性增加，包括头孢西丁、克林霉素、甲硝唑、碳青霉烯类和氟喹诺酮类药物（如加替沙星、左氧氟沙星和莫西沙星）。本研究中，拟杆菌属的相对丰度在胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组较胆囊切除+结直肠癌组和正常胆囊+结直肠癌组降低。提示长期患胆囊结石伴胆囊炎可能会破坏人体与肠道菌群互利共生的平衡状态，从而影响疾病的发生发展。
梭杆菌属是一种革兰阴性厌氧菌，是健康人口腔和胃肠道微生物群中天然存在的共生微生物之一，一直被认为是一种条件致病菌[30-31]。有研究[32]发现，梭杆菌属可以穿透肿瘤细胞并引起促炎细胞因子的释放，包括IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α，帮助构建结直肠癌发生的免疫微环境。梭杆菌属相关结直肠癌的潜在机制[33]包括：① 突变的上皮细胞导致局部肠道屏障受损，这使梭杆菌属有机会黏附并侵入上皮细胞。一旦梭杆菌黏附素A（fusobacterium adhesin A，FadA；梭杆菌属的一种膜蛋白）与E-钙黏蛋白结合并被上皮细胞内化，β-连环蛋白信号通路就会被激活。② 磷酸化的β-catenin会从细胞质进入细胞核，促进核转录因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）基因、促炎基因和许多其他癌基因的表达。 ③ 恶性肿瘤的肠道微环境是缺氧和酸性的，梭杆菌属比其他细菌更适合在此条件下繁殖。梭杆菌属引起髓系来源抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）的富集，进而抑制抗肿瘤免疫并促进结直肠黏膜细胞癌变的发生。Keren等[12]研究发现，梭杆菌门在健康自愿者组的相对丰度较胆囊切除术组明显降低。本研究发现，梭杆菌门的相对丰度在胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组增高，与胆囊切除+结直肠癌组相比差异无统计学意义（P>0.05），与正常胆囊+结直肠癌组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。与胆囊切除+结直肠癌组和正常胆囊+结直肠癌组相比，梭杆菌属和白细胞介素-6在胆囊结石伴胆囊炎+结直肠癌组明显增高，且差异均具有统计学意义（P<0.05）。由此提示：长期患胆囊结石伴胆囊炎的患者，肠道中梭杆菌属的富集可能促进了炎症细胞因子（如白细胞介素-6）的释放，为肠道创造了一个肿瘤发生的免疫微环境，引起肠道长期的慢性炎症，进而促进结直肠癌的发生发展。这与之前的研究认为胆囊切除术后梭杆菌属富集促进结直肠癌的发生发展的研究结论不一致。可能的原因是胆囊切除术之前长期胆囊结石伴胆囊炎已经引起肠道菌群的改变，甚至导致癌前病变。
综上所述，肠道菌群的种类与数量平衡状态发生改变在结直肠癌的发生发展及治疗机制中起着关键作用，肠道菌群失调会影响免疫和化学治疗，以及药物的疗效。所以，临床医生在结直肠癌的诊治过程中，不仅要尽量全面评估患者肠道微生态，还要尽量谨慎、严格地使用抗生素等药物，避免破坏肠道菌群。本研究结果提示：长期患胆囊结石伴胆囊炎及胆囊切除术后会导致肠道菌群种类和数量的改变，但是否会增加患结直肠癌的风险，还需大规模的长期随访研究加以验证；更加深入探讨胆囊结石伴胆囊炎和胆囊切除术后特定菌群改变与结直肠癌发生发展的机制，为肠道微生态相关疾病的预防、诊断和治疗提供新思路。调节肠道菌群或添加益生菌对免疫和化学治疗有益，甚至在未来的某一天，益生菌会在致癌过程中破坏肿瘤细胞。建议临床医生应尝试使用益生菌来维持和改善肠道微生态平衡，从而预防结直肠癌的发生。
重要声明
利益冲突声明： 本研究中的全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。
作者贡献声明： 李晶晶负责文章撰写及数据收集；朱成章负责辅助撰稿及统计学分析；史新龙和杜斌斌负责伦理审批及稿件修改；杨熊飞负责跟进整个研究进度。
伦理声明： 本研究方案通过了甘肃省人民医院医学伦理委员会的审批（批文编号： 2021-278）。
