引用本文： 叶宝龙, 丁凯, 嵇武. 胆囊癌类器官的研究进展与挑战. 中国普外基础与临床杂志, 2022, 29(12): 1648-1652. doi: 10.7507/1007-9424.202206023 复制
传统的肿瘤研究模型有肿瘤细胞系模型、多细胞肿瘤球模型及动物模型。肿瘤细胞系模型作为传统的二维细胞培养模型，具有易培养、繁殖周期短等优势，主要用于药物筛选、功能分析等方面的研究，但是不能模拟肿瘤细胞与微环境的内在联系，在培养过程中存在突变累积效应，也使它无法完全保持原始肿瘤细胞的特性[1]。多细胞肿瘤球模型开创了三维细胞培养模型的先河，可用于研究肿瘤代谢、转移等机制及相关信号通路，其缺陷在于它无法反映肿瘤的组织形态特征以及无法模拟肿瘤微环境[2]。动物模型被认为是系统研究肿瘤的发生及发展过程较为合适的模型，但建立时间长、费用高，并且有限的可用性及物种特异性差异，也使它无法完全模拟人体肿瘤的特征[3]。因此，亟需一种既能再现原始肿瘤的特征，又能规避传统研究模型缺陷的研究模型。类器官的出现给研究者们提供了新的方向。
“类器官”概念于2014年提出[4]，自此类器官的研究便逐渐成为热点并取得了一定的成果。2017年Nature杂志评选类器官技术为年度最佳生物技术，2019年The New England Journal of Medicine杂志确定类器官可作为最佳的临床前模型，确立了类器官研究在生物医学中的地位。肿瘤类器官是由肿瘤组织或正常组织经基因编辑等快速培育而来，与原始肿瘤的分子及细胞的组成高度相似，不仅具有传统肿瘤研究模型的优点，还可再现原始肿瘤的相关特性以及基因特征，能更好地符合体内生理条件。目前，类器官已被应用于如胃肠道疾病、肝脏疾病、卵巢疾病等[5-6]多种疾病的研究。近年来，笔者所在医院对肠道类器官的研究取得了一定的成果[7-11]，认为类器官的研究在探索肿瘤的发生及发展过程、个体化治疗方案的制定、药物筛选、发现诊断标志物等方面可能具有巨大潜力。受限于胆囊癌患者数量相对较少等因素，目前关于胆囊癌的发病机制、疾病进展、治疗等方面的研究进展缓慢，而类器官的出现，或许能加快对胆囊癌的认识。但胆囊癌类器官的研究处于起步阶段，故笔者将近年来胆囊癌类器官相关的研究进展及面临的挑战做一综述，并探讨可能的应对策略。
1 胆囊癌类器官的构建
1.1 不同取材的培养基成分
由人来源和动物来源组织构建的胆囊癌类器官，完全培养基所添加的成分不尽相同，其相同点在于，都是以Dulbecco改良eagle培养基（Dulbecco modified eagle medium，DMEM）/F12为基础培养基，添加R-Sponding 1、B27、N2、烟酰胺、A-8301、青-链霉素双抗、Y-27632、表皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子等；不同点在于，人类来源的胆囊癌类器官完全培养基还需加入胰岛素样生长因子-2、Wnt/β连环蛋白抑制剂IWP-2、Wnt/β连环蛋白信号通路中重要配体Wnt3a等因子，而动物胆囊癌类器官通常是先构建正常胆囊类器官，再通过基因工程技术诱导胆囊类器官癌变，因此无需加入这些因子[12-15]。
1.2 不同取材的构建方式
目前胆囊癌类器官的构建大多数是取材于人类胆囊癌手术切除后的肿瘤组织，构建的基本步骤是：先将肿瘤组织用无菌生理盐水冲洗2～3次后切碎成小块；随后用Ⅳ型胶原蛋白消化30～60 min，消化成单个肿瘤细胞或少许聚集细胞，DMEM（含10%磷酸盐缓冲溶液）中止消化；消化后的悬液经100 μm的细胞筛过滤，并将过滤液体以1 000 r/min离心5 min；离心后的细胞用DMEM/F12重悬，Matrigel基质胶与完全培养基比例为1∶1混合后，将重悬液包裹混合，以每孔10 000～20 000个的细胞数量按需接种到孔板中，与传统的二维细胞培养类似，也可以进行后续的传代、冻存、复苏等操作[12-14]。而动物胆囊癌类器官的报道相对较少，Kasuga等[15]通过取材于6周的雌鼠胆囊，与人类来源的胆囊癌类器官构建类似，经消化、重悬、基质胶聚合等构建正常胆囊类器官，并将基因工程技术获得的携带K-Ras基因的载体加入到正常胆囊类器官培养基中，诱导正常胆囊类器官癌变，从而得到小鼠胆囊癌类器官模型。
2 胆囊癌类器官的应用
2.1 研究疾病的发病机制
因胆囊癌隐匿性强，缺乏特异性诊断方法，早期诊断较为困难，预后不佳。目前对胆囊癌确切的发病机制仍不清楚，已知的胆囊癌致病因素有环境、微生物感染、遗传代谢、基因突变等[16]。基因突变是肿瘤发生及发展的基础，类器官在寻找确切的致病基因方面展示了巨大的潜力，将类器官技术与基因工程技术相结合来寻找可能的基因突变位点，为发现特异性的肿瘤诊断标志物、精准化及个体化治疗方案的制定提供理论依据。通过人类手术标本而构建的类器官模型，为探究疾病致病靶点以及发生及发展过程提供了新思路。Erlangga等[17]利用基因编辑技术和慢病毒转染技术进行研究发现，K-Ras激活、10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源物缺失、p53基因缺失均与胆囊癌发生相关，并通过逆转录病毒转导和基因编辑技术构建了2个具有p53基因缺失的人类表皮生长因子受体-2过表达的突变体，进一步证实了p53基因缺失与胆囊癌的发生密切相关。而在另一项研究[18]中，通过构建小鼠的胆囊类器官模型并感染沙门菌，发现在有沙门菌感染史的类器官模型中，细胞失去内聚力和极性，细胞核逐渐增大且不规则，核仁明显，而未感染沙门菌的模型可分化正常的胆囊上皮组织，证实了沙门菌感染与胆囊癌发生之间有一定的关系。另有研究[12, 14]发现，通过与正常胆囊类器官模型对比，睫状神经营养因子及其受体与胆囊癌相关，睫状神经营养因子受体低表达与肿瘤转移密切相关，并且发现睫状神经营养因子受体通过抑制丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶通路的磷酸化来抑制胆囊癌的侵袭和转移，此为今后胆囊癌的诊治提供了一个方向。充分利用肿瘤类器官能够良好再现体内肿瘤的表型及基因型的优点，利用胆囊癌手术切除的肿瘤组织构建胆囊癌类器官并结合基因工程等技术，能够加快、加深对胆囊癌的认识。
2.2 用于药物筛选与个体化治疗
目前胆囊癌仍然面临着高病死率的困境，预后不佳，严重影响人类健康。针对胆囊癌的非手术治疗主要包括化学药物治疗、放射治疗、免疫治疗、靶向治疗等。目前胆囊癌的一线化学药物治疗方案仍然是吉西他滨加顺铂，但整体预后仍不理想，亟需新的治疗方案以提高胆囊癌患者生存率。肿瘤类器官能在体外还原原始肿瘤的异质性并能模拟体内三维环境，已被广泛用于肿瘤治疗药物的筛选与个体化用药。
García等[19]研究发现，在超过60%的慢性胆囊炎及进展期胆囊癌患者中，存在Yes相关蛋白1（Yes-associated protein 1，YAP1）高表达，且与患者总生存率相关，YAP1抑制剂维替泊芬可以降低胆囊癌的转移和侵犯几率；然后通过在胆囊癌类器官模型中进一步证实了维替泊芬的积极治疗效果，并发现维替泊芬能够抑制吉西他滨耐药的胆囊癌类器官的活性，提示维替泊芬可以增强肿瘤细胞对吉西他滨的敏感性和细胞毒性，因此，维替泊芬加吉西他滨或许是未来胆囊癌治疗的新方案。Yuan等[12]通过培育胆囊癌类器官与正常胆囊类器官，利用大规模药物筛查检测药物对肿瘤的敏感性发现，组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以显著抑制胆囊癌类器官的生长，而对正常胆囊类器官毒性较小，说明组蛋白去乙酰化酶抑制剂是胆囊癌潜在的治疗药物。
对胆囊癌类器官模型进行全外显子测序或许能发现新的治疗靶点，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂已被广泛用于肿瘤的非手术治疗，认为它抗肿瘤效应与K-Ras相关，如西妥昔单抗只对野生型结直肠癌有效[20]；而Saito等[21]通过对胆囊癌类器官模型进行全外显子测序发现，无论是野生型还是突变型K-Ras，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂均能表现出抗肿瘤效应，提示它在胆囊癌中抗肿瘤效应与K-Ras基因类型并无关系。
此外，新兴的免疫治疗所取得的成果也引起了研究者们的关注。如Löffler等[22]报道了1例使用多肽疫苗治疗胆管癌伴肺转移的病例，该疫苗通过诱导T细胞应答并使T细胞浸润增加，在接种后44个月时患者仍处于无瘤生存期，提示治疗有效；Neal等[23]的实验证实，取材于患者肿瘤标本而创建的类器官模型可更好地保留原始肿瘤细胞的分子生物学特性，并且还发现程序性死亡受体1及其配体的免疫抑制剂可以通过激活肿瘤抗原特异性淋巴细胞而引起肿瘤细胞的死亡；另有研究[24]报道，程序性死亡受体1抑制剂对胆囊癌患者有一定的治疗效果，但证据效力普遍较低，为获得高级别证据，类器官模型或许能提供帮助。
总之，目前利用胆囊癌类器官来筛选治疗药物已取得一定的成果，胆囊癌类器官具有培养周期短的特点，通过类器官对新兴药物进行药物敏感测试，不仅能节约成本、提高效率，也能加速有效治疗方案进入临床。但是目前胆囊癌治疗前景较大的新兴免疫治疗方案还未应用于胆囊癌类器官中研究，希望通过了解这些研究进展为后续胆囊癌类器官应用于药物筛选和个体化治疗提供参考。
2.3 器官移植
类器官技术与再生医学紧密相连，类器官技术诞生后，其应用于器官移植的实验便不断出现。2021年，Sampaziotis等[25]在Science杂志发表了其团队最新研究成果，将胆囊类器官移植到离体状态下的人肝脏中，观察到胆管的再生和胆汁状态的改变，首次证明了类器官移植在人体器官移植的可行性和巨大前景，为今后的临床应用奠定了基础。
3 胆囊癌类器官的挑战与策略
近年来，类器官研究在肿瘤领域中进展迅速，在研究肿瘤的发病机制、药物筛选、个体化治疗等方面，类器官已显示出了它明显的优势[26-30]。但是胆囊癌类器官研究仍然面临着构建成功率低、构建的模型相对简单、样本来源少等困境，借助于其他类器官研究所取得的经验，或许能加速胆囊癌类器官研究的步伐。
3.1 胆囊癌类器官构建成功的影响因素与策略
虽然目前类器官已成为近些年的研究热点，但是模型构建成功率较低仍然是限制它快速发展的主要原因。胆囊癌类器官的构建成功率约为20%[12-13, 21]，与肝癌[5]、卵巢癌[6]、胰腺癌[31]等相比，仍有较大的提升空间，目前仍需深入研究影响类器官模型构建成功的因素。
首先，通常由于胆囊癌标本体积较小，标本内肿瘤细胞的绝对数量明显少于肝癌、卵巢癌等其他实体肿瘤，提示肿瘤细胞的数量可能是影响类器官模型成败的因素之一，而此前也有关于胃肠道类器官模型的研究提示类器官的成功构建与标本内肿瘤细胞的数量相关[12, 32]。其次，目前胆囊癌类器官的构建绝大多数取材于手术后的肿瘤组织，导致取材内不可避免地含有正常细胞。已有多项研究分别构建了胆管肿瘤类器官与正常胆管类器官，通过对比后发现，虽然正常细胞的增殖周期有限，但是在类器官模型培养的早期，正常细胞的增殖能力明显强于肿瘤细胞，甚至出现了取材于肿瘤组织构建的类器官经过培育后形成的是正常胆管类器官的现象，随后分析发现，原因在于取材的肿瘤组织中正常细胞占比过大，进一步分析后发现，胆囊长期慢性炎症导致的炎-癌转变，使得肿瘤组织内含大量纤维结缔组织，导致在制备胆囊癌类器官的过程中肿瘤组织难以消化，而且消化后获得的少量上皮细胞活力较低，从而影响了模型构建成功率[12, 21]，在结直肠癌类器官模型中也发现了此现象[33]。因此，目前胆囊癌标本内肿瘤细胞的绝对数量难以明显提高，若取材于手术切除后的肿瘤组织时，必须细致分析细胞类型，尽可能完全消化，避免取材标本内正常细胞的占比过大，提高取材后细胞活力，争取标本内的肿瘤细胞相对数量更高。
3.2 肿瘤微环境与新技术
血管、肿瘤相关纤维原细胞、免疫细胞（T淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞）等与疾病的致病及进展相关。肿瘤细胞为了生存和生长，采用诸多策略躲避机体的免疫监控，使得机体无法有效识别和杀伤肿瘤细胞，从而产生免疫耐受，通过控制免疫细胞形成免疫抑制的肿瘤微环境，以逃避宿主免疫监控，甚至促进肿瘤的发生及发展[34]。而类器官模型可以模拟肿瘤细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的相互作用关系，但如何做到复原体内真实肿瘤微环境也是面临的挑战之一。
目前，共培养、气液界面、微流体、类器官芯片等新兴技术[23, 35]已被应用于类器官的研究中，以期更好地研究肿瘤的真实情况。Gonzalez-Exposito团队[36]通过构建耐多药并转移的结直肠癌类器官并成功与异基因CD8+ T淋巴细胞共同培养，发现西比沙他单抗能有效抑制该模型中肿瘤细胞的生长速度，并且还发现其敏感性与癌胚抗原的表达相关，阻断Wnt/β连环蛋白通路可增强癌胚抗原的表达，通过此结直肠癌类器官中的研究结果提示了西比沙他单抗在结直肠癌中具备治疗潜力；而在另一项结直肠类器官研究[37]中，当把脂肪细胞与肿瘤细胞共培养时，发现脂肪细胞可为肿瘤细胞的生长提供能量，并可调控肿瘤细胞的新陈代谢，促进肿瘤细胞的生长和生存，由此也解释了肥胖是包括胆囊癌在内的一些肿瘤的高危因素。气液界面技术是通过将实验模型的底面植入培养基中，而顶面直接与空气接触。Usui等[38]应用气液界面技术成功构建了结直肠癌类器官，正常结直肠类器官具有囊性结构包括上皮细胞、杯状细胞以及成纤维细胞，而结直肠癌类器官包括上皮细胞、肌成纤维细胞和肿瘤干细胞。微流体技术及由微流体技术发展而来的类器官芯片，通过集成多种类器官来实现对肿瘤发展的宏观研究，为肿瘤研究提供操作性更强的平台[39]，但暂没有相关技术应用于胆囊癌的研究中。因此，在未来的胆囊癌类器官研究中，通过加入脂肪细胞、免疫细胞等以及共培养等新兴技术为研究胆囊癌更加真实的肿瘤微环境提供了新的思路。
4 总结与展望
虽然胆囊癌目前仍然面临着高病死率、低生存率、治疗方式单一等问题，但随着对胆囊癌发病机制、临床诊断方法、治疗策略等更加深入的研究，这些问题会逐步得到解决。因胆囊癌类器官的构建主要取材于患者手术切除标本，加之新兴技术如共培养和气液界面技术的出现，在体外精确再现肿瘤的特性与微环境已成为可能。随着单细胞测序技术的出现，通过比较不同细胞之间的异质性来发现胆囊癌的发病机制也成为当前的研究热点，目前取得的成果也预示了诊断和治疗的前景喜人。由于一些治疗方式尚未批准用于临床试验，因此获得治疗后的标本比较困难。然而类器官的出现，将一些尚未批准用于临床试验的治疗方案应用于类器官模型中，通过类器官模型对治疗前、治疗后的疗效进行比较，可获得更高级别的证据，加速新兴治疗方案进入临床。现在，胆囊癌类器官的研究仍处于萌芽阶段，其他肿瘤类器官模型所取得的经验可以借鉴；同时人体是作为一个复杂的有机结合体，现有的类器官模型相对简单，因此，如何构建结构更为复杂包含血管、神经、免疫等相互联系的类器官模型，如何更加宏观地研究肿瘤发展，是未来关注的新方向。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：叶宝龙负责文献查阅、论文撰写；丁凯负责修改论文；嵇武负责写作思路、修改论文及定稿。
传统的肿瘤研究模型有肿瘤细胞系模型、多细胞肿瘤球模型及动物模型。肿瘤细胞系模型作为传统的二维细胞培养模型，具有易培养、繁殖周期短等优势，主要用于药物筛选、功能分析等方面的研究，但是不能模拟肿瘤细胞与微环境的内在联系，在培养过程中存在突变累积效应，也使它无法完全保持原始肿瘤细胞的特性[1]。多细胞肿瘤球模型开创了三维细胞培养模型的先河，可用于研究肿瘤代谢、转移等机制及相关信号通路，其缺陷在于它无法反映肿瘤的组织形态特征以及无法模拟肿瘤微环境[2]。动物模型被认为是系统研究肿瘤的发生及发展过程较为合适的模型，但建立时间长、费用高，并且有限的可用性及物种特异性差异，也使它无法完全模拟人体肿瘤的特征[3]。因此，亟需一种既能再现原始肿瘤的特征，又能规避传统研究模型缺陷的研究模型。类器官的出现给研究者们提供了新的方向。
“类器官”概念于2014年提出[4]，自此类器官的研究便逐渐成为热点并取得了一定的成果。2017年Nature杂志评选类器官技术为年度最佳生物技术，2019年The New England Journal of Medicine杂志确定类器官可作为最佳的临床前模型，确立了类器官研究在生物医学中的地位。肿瘤类器官是由肿瘤组织或正常组织经基因编辑等快速培育而来，与原始肿瘤的分子及细胞的组成高度相似，不仅具有传统肿瘤研究模型的优点，还可再现原始肿瘤的相关特性以及基因特征，能更好地符合体内生理条件。目前，类器官已被应用于如胃肠道疾病、肝脏疾病、卵巢疾病等[5-6]多种疾病的研究。近年来，笔者所在医院对肠道类器官的研究取得了一定的成果[7-11]，认为类器官的研究在探索肿瘤的发生及发展过程、个体化治疗方案的制定、药物筛选、发现诊断标志物等方面可能具有巨大潜力。受限于胆囊癌患者数量相对较少等因素，目前关于胆囊癌的发病机制、疾病进展、治疗等方面的研究进展缓慢，而类器官的出现，或许能加快对胆囊癌的认识。但胆囊癌类器官的研究处于起步阶段，故笔者将近年来胆囊癌类器官相关的研究进展及面临的挑战做一综述，并探讨可能的应对策略。
1 胆囊癌类器官的构建
1.1 不同取材的培养基成分
由人来源和动物来源组织构建的胆囊癌类器官，完全培养基所添加的成分不尽相同，其相同点在于，都是以Dulbecco改良eagle培养基（Dulbecco modified eagle medium，DMEM）/F12为基础培养基，添加R-Sponding 1、B27、N2、烟酰胺、A-8301、青-链霉素双抗、Y-27632、表皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子等；不同点在于，人类来源的胆囊癌类器官完全培养基还需加入胰岛素样生长因子-2、Wnt/β连环蛋白抑制剂IWP-2、Wnt/β连环蛋白信号通路中重要配体Wnt3a等因子，而动物胆囊癌类器官通常是先构建正常胆囊类器官，再通过基因工程技术诱导胆囊类器官癌变，因此无需加入这些因子[12-15]。
1.2 不同取材的构建方式
目前胆囊癌类器官的构建大多数是取材于人类胆囊癌手术切除后的肿瘤组织，构建的基本步骤是：先将肿瘤组织用无菌生理盐水冲洗2～3次后切碎成小块；随后用Ⅳ型胶原蛋白消化30～60 min，消化成单个肿瘤细胞或少许聚集细胞，DMEM（含10%磷酸盐缓冲溶液）中止消化；消化后的悬液经100 μm的细胞筛过滤，并将过滤液体以1 000 r/min离心5 min；离心后的细胞用DMEM/F12重悬，Matrigel基质胶与完全培养基比例为1∶1混合后，将重悬液包裹混合，以每孔10 000～20 000个的细胞数量按需接种到孔板中，与传统的二维细胞培养类似，也可以进行后续的传代、冻存、复苏等操作[12-14]。而动物胆囊癌类器官的报道相对较少，Kasuga等[15]通过取材于6周的雌鼠胆囊，与人类来源的胆囊癌类器官构建类似，经消化、重悬、基质胶聚合等构建正常胆囊类器官，并将基因工程技术获得的携带K-Ras基因的载体加入到正常胆囊类器官培养基中，诱导正常胆囊类器官癌变，从而得到小鼠胆囊癌类器官模型。
2 胆囊癌类器官的应用
2.1 研究疾病的发病机制
因胆囊癌隐匿性强，缺乏特异性诊断方法，早期诊断较为困难，预后不佳。目前对胆囊癌确切的发病机制仍不清楚，已知的胆囊癌致病因素有环境、微生物感染、遗传代谢、基因突变等[16]。基因突变是肿瘤发生及发展的基础，类器官在寻找确切的致病基因方面展示了巨大的潜力，将类器官技术与基因工程技术相结合来寻找可能的基因突变位点，为发现特异性的肿瘤诊断标志物、精准化及个体化治疗方案的制定提供理论依据。通过人类手术标本而构建的类器官模型，为探究疾病致病靶点以及发生及发展过程提供了新思路。Erlangga等[17]利用基因编辑技术和慢病毒转染技术进行研究发现，K-Ras激活、10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源物缺失、p53基因缺失均与胆囊癌发生相关，并通过逆转录病毒转导和基因编辑技术构建了2个具有p53基因缺失的人类表皮生长因子受体-2过表达的突变体，进一步证实了p53基因缺失与胆囊癌的发生密切相关。而在另一项研究[18]中，通过构建小鼠的胆囊类器官模型并感染沙门菌，发现在有沙门菌感染史的类器官模型中，细胞失去内聚力和极性，细胞核逐渐增大且不规则，核仁明显，而未感染沙门菌的模型可分化正常的胆囊上皮组织，证实了沙门菌感染与胆囊癌发生之间有一定的关系。另有研究[12, 14]发现，通过与正常胆囊类器官模型对比，睫状神经营养因子及其受体与胆囊癌相关，睫状神经营养因子受体低表达与肿瘤转移密切相关，并且发现睫状神经营养因子受体通过抑制丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶通路的磷酸化来抑制胆囊癌的侵袭和转移，此为今后胆囊癌的诊治提供了一个方向。充分利用肿瘤类器官能够良好再现体内肿瘤的表型及基因型的优点，利用胆囊癌手术切除的肿瘤组织构建胆囊癌类器官并结合基因工程等技术，能够加快、加深对胆囊癌的认识。
2.2 用于药物筛选与个体化治疗
目前胆囊癌仍然面临着高病死率的困境，预后不佳，严重影响人类健康。针对胆囊癌的非手术治疗主要包括化学药物治疗、放射治疗、免疫治疗、靶向治疗等。目前胆囊癌的一线化学药物治疗方案仍然是吉西他滨加顺铂，但整体预后仍不理想，亟需新的治疗方案以提高胆囊癌患者生存率。肿瘤类器官能在体外还原原始肿瘤的异质性并能模拟体内三维环境，已被广泛用于肿瘤治疗药物的筛选与个体化用药。
García等[19]研究发现，在超过60%的慢性胆囊炎及进展期胆囊癌患者中，存在Yes相关蛋白1（Yes-associated protein 1，YAP1）高表达，且与患者总生存率相关，YAP1抑制剂维替泊芬可以降低胆囊癌的转移和侵犯几率；然后通过在胆囊癌类器官模型中进一步证实了维替泊芬的积极治疗效果，并发现维替泊芬能够抑制吉西他滨耐药的胆囊癌类器官的活性，提示维替泊芬可以增强肿瘤细胞对吉西他滨的敏感性和细胞毒性，因此，维替泊芬加吉西他滨或许是未来胆囊癌治疗的新方案。Yuan等[12]通过培育胆囊癌类器官与正常胆囊类器官，利用大规模药物筛查检测药物对肿瘤的敏感性发现，组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以显著抑制胆囊癌类器官的生长，而对正常胆囊类器官毒性较小，说明组蛋白去乙酰化酶抑制剂是胆囊癌潜在的治疗药物。
对胆囊癌类器官模型进行全外显子测序或许能发现新的治疗靶点，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂已被广泛用于肿瘤的非手术治疗，认为它抗肿瘤效应与K-Ras相关，如西妥昔单抗只对野生型结直肠癌有效[20]；而Saito等[21]通过对胆囊癌类器官模型进行全外显子测序发现，无论是野生型还是突变型K-Ras，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂均能表现出抗肿瘤效应，提示它在胆囊癌中抗肿瘤效应与K-Ras基因类型并无关系。
此外，新兴的免疫治疗所取得的成果也引起了研究者们的关注。如Löffler等[22]报道了1例使用多肽疫苗治疗胆管癌伴肺转移的病例，该疫苗通过诱导T细胞应答并使T细胞浸润增加，在接种后44个月时患者仍处于无瘤生存期，提示治疗有效；Neal等[23]的实验证实，取材于患者肿瘤标本而创建的类器官模型可更好地保留原始肿瘤细胞的分子生物学特性，并且还发现程序性死亡受体1及其配体的免疫抑制剂可以通过激活肿瘤抗原特异性淋巴细胞而引起肿瘤细胞的死亡；另有研究[24]报道，程序性死亡受体1抑制剂对胆囊癌患者有一定的治疗效果，但证据效力普遍较低，为获得高级别证据，类器官模型或许能提供帮助。
总之，目前利用胆囊癌类器官来筛选治疗药物已取得一定的成果，胆囊癌类器官具有培养周期短的特点，通过类器官对新兴药物进行药物敏感测试，不仅能节约成本、提高效率，也能加速有效治疗方案进入临床。但是目前胆囊癌治疗前景较大的新兴免疫治疗方案还未应用于胆囊癌类器官中研究，希望通过了解这些研究进展为后续胆囊癌类器官应用于药物筛选和个体化治疗提供参考。
2.3 器官移植
类器官技术与再生医学紧密相连，类器官技术诞生后，其应用于器官移植的实验便不断出现。2021年，Sampaziotis等[25]在Science杂志发表了其团队最新研究成果，将胆囊类器官移植到离体状态下的人肝脏中，观察到胆管的再生和胆汁状态的改变，首次证明了类器官移植在人体器官移植的可行性和巨大前景，为今后的临床应用奠定了基础。
3 胆囊癌类器官的挑战与策略
近年来，类器官研究在肿瘤领域中进展迅速，在研究肿瘤的发病机制、药物筛选、个体化治疗等方面，类器官已显示出了它明显的优势[26-30]。但是胆囊癌类器官研究仍然面临着构建成功率低、构建的模型相对简单、样本来源少等困境，借助于其他类器官研究所取得的经验，或许能加速胆囊癌类器官研究的步伐。
3.1 胆囊癌类器官构建成功的影响因素与策略
虽然目前类器官已成为近些年的研究热点，但是模型构建成功率较低仍然是限制它快速发展的主要原因。胆囊癌类器官的构建成功率约为20%[12-13, 21]，与肝癌[5]、卵巢癌[6]、胰腺癌[31]等相比，仍有较大的提升空间，目前仍需深入研究影响类器官模型构建成功的因素。
首先，通常由于胆囊癌标本体积较小，标本内肿瘤细胞的绝对数量明显少于肝癌、卵巢癌等其他实体肿瘤，提示肿瘤细胞的数量可能是影响类器官模型成败的因素之一，而此前也有关于胃肠道类器官模型的研究提示类器官的成功构建与标本内肿瘤细胞的数量相关[12, 32]。其次，目前胆囊癌类器官的构建绝大多数取材于手术后的肿瘤组织，导致取材内不可避免地含有正常细胞。已有多项研究分别构建了胆管肿瘤类器官与正常胆管类器官，通过对比后发现，虽然正常细胞的增殖周期有限，但是在类器官模型培养的早期，正常细胞的增殖能力明显强于肿瘤细胞，甚至出现了取材于肿瘤组织构建的类器官经过培育后形成的是正常胆管类器官的现象，随后分析发现，原因在于取材的肿瘤组织中正常细胞占比过大，进一步分析后发现，胆囊长期慢性炎症导致的炎-癌转变，使得肿瘤组织内含大量纤维结缔组织，导致在制备胆囊癌类器官的过程中肿瘤组织难以消化，而且消化后获得的少量上皮细胞活力较低，从而影响了模型构建成功率[12, 21]，在结直肠癌类器官模型中也发现了此现象[33]。因此，目前胆囊癌标本内肿瘤细胞的绝对数量难以明显提高，若取材于手术切除后的肿瘤组织时，必须细致分析细胞类型，尽可能完全消化，避免取材标本内正常细胞的占比过大，提高取材后细胞活力，争取标本内的肿瘤细胞相对数量更高。
3.2 肿瘤微环境与新技术
血管、肿瘤相关纤维原细胞、免疫细胞（T淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞）等与疾病的致病及进展相关。肿瘤细胞为了生存和生长，采用诸多策略躲避机体的免疫监控，使得机体无法有效识别和杀伤肿瘤细胞，从而产生免疫耐受，通过控制免疫细胞形成免疫抑制的肿瘤微环境，以逃避宿主免疫监控，甚至促进肿瘤的发生及发展[34]。而类器官模型可以模拟肿瘤细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的相互作用关系，但如何做到复原体内真实肿瘤微环境也是面临的挑战之一。
目前，共培养、气液界面、微流体、类器官芯片等新兴技术[23, 35]已被应用于类器官的研究中，以期更好地研究肿瘤的真实情况。Gonzalez-Exposito团队[36]通过构建耐多药并转移的结直肠癌类器官并成功与异基因CD8+ T淋巴细胞共同培养，发现西比沙他单抗能有效抑制该模型中肿瘤细胞的生长速度，并且还发现其敏感性与癌胚抗原的表达相关，阻断Wnt/β连环蛋白通路可增强癌胚抗原的表达，通过此结直肠癌类器官中的研究结果提示了西比沙他单抗在结直肠癌中具备治疗潜力；而在另一项结直肠类器官研究[37]中，当把脂肪细胞与肿瘤细胞共培养时，发现脂肪细胞可为肿瘤细胞的生长提供能量，并可调控肿瘤细胞的新陈代谢，促进肿瘤细胞的生长和生存，由此也解释了肥胖是包括胆囊癌在内的一些肿瘤的高危因素。气液界面技术是通过将实验模型的底面植入培养基中，而顶面直接与空气接触。Usui等[38]应用气液界面技术成功构建了结直肠癌类器官，正常结直肠类器官具有囊性结构包括上皮细胞、杯状细胞以及成纤维细胞，而结直肠癌类器官包括上皮细胞、肌成纤维细胞和肿瘤干细胞。微流体技术及由微流体技术发展而来的类器官芯片，通过集成多种类器官来实现对肿瘤发展的宏观研究，为肿瘤研究提供操作性更强的平台[39]，但暂没有相关技术应用于胆囊癌的研究中。因此，在未来的胆囊癌类器官研究中，通过加入脂肪细胞、免疫细胞等以及共培养等新兴技术为研究胆囊癌更加真实的肿瘤微环境提供了新的思路。
4 总结与展望
虽然胆囊癌目前仍然面临着高病死率、低生存率、治疗方式单一等问题，但随着对胆囊癌发病机制、临床诊断方法、治疗策略等更加深入的研究，这些问题会逐步得到解决。因胆囊癌类器官的构建主要取材于患者手术切除标本，加之新兴技术如共培养和气液界面技术的出现，在体外精确再现肿瘤的特性与微环境已成为可能。随着单细胞测序技术的出现，通过比较不同细胞之间的异质性来发现胆囊癌的发病机制也成为当前的研究热点，目前取得的成果也预示了诊断和治疗的前景喜人。由于一些治疗方式尚未批准用于临床试验，因此获得治疗后的标本比较困难。然而类器官的出现，将一些尚未批准用于临床试验的治疗方案应用于类器官模型中，通过类器官模型对治疗前、治疗后的疗效进行比较，可获得更高级别的证据，加速新兴治疗方案进入临床。现在，胆囊癌类器官的研究仍处于萌芽阶段，其他肿瘤类器官模型所取得的经验可以借鉴；同时人体是作为一个复杂的有机结合体，现有的类器官模型相对简单，因此，如何构建结构更为复杂包含血管、神经、免疫等相互联系的类器官模型，如何更加宏观地研究肿瘤发展，是未来关注的新方向。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：叶宝龙负责文献查阅、论文撰写；丁凯负责修改论文；嵇武负责写作思路、修改论文及定稿。