引用本文： 姚豫桐, 赖春友, 冯天航, 尚进, 杨钦焱, 杨卯竹, 张雯, 黄孝伦. 同种异体胰岛联合自体外周血干细胞移植治疗1型糖尿病：随访3年的临床研究. 中国普外基础与临床杂志, 2022, 29(9): 1189-1194. doi: 10.7507/1007-9424.202207011 复制
1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）是由于胰岛β细胞受损导致胰岛素分泌绝对不足的一种T淋巴细胞引起的自身免疫性疾病。现有的外源性胰岛素替代治疗无法阻断其对全身多器官的微血管损害，而且容易出现酮症酸中毒、低血糖昏迷等严重并发症[1]。胰岛移植是目前最有可能治愈T1DM的有效方法。自2000年Edmonton方案提出以来，全球范围已完成超过1 500例临床胰岛移植，其术后5年胰岛素脱离率已超过50%，但其远期疗效仍不满意[2-3]。近年来研究[4-5]表明，干细胞有为胰岛细胞提供良好的定植及存活环境的优势。基于此，四川省人民医院（以下简称“我院” ）笔者所在研究团队将其二者结合，即实施同种异体胰岛联合自体干细胞移植治疗T1DM，术后已随访3年，现将3年的研究结果进行报道。
1 资料与方法
1.1 受者临床资料
回顾性收集2017年1月至2019年12月期间我院实施的同种异体胰岛细胞联合（或不联合）自体外周血干细胞移植受者的临床病理资料。我院符合胰岛移植条件的标准：① 18～65岁；② T1DM病史 >5年；③ 外源性胰岛素强化治疗仍不能控制血糖，有低血糖或酮症酸中毒症状发作或伴有如视力模糊、肾功能损害、神经性疼痛、心血管病变等糖尿病并发症。排除合并有肿瘤、感染（获得性免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒或细菌性）、门静脉高压症等的T1DM受者。本研究联合干细胞移植患者的选择是在四川省医学科学院·四川省人民医院细胞生物治疗临床研究机构伦理委员会批准且经患者及家属均签署知情同意书同意后，采用简单随机化临床分组法对患者采取联合或不联合干细胞移植治疗。
1.2 自体外周血干细胞制备
每天于受者皮下注射粒细胞集落刺激因子5 μg/kg（共3～5 d），同时监测患者的血常规及肝肾功能。当白细胞计数 >20×109/L后行股静脉插管，同时连接至血细胞分离机（费森尤斯，型号COM.TEC）采集患者干细胞。每次循环血量8 000～12 000 mL，采集外周血单个核细胞100～200 mL，全程采用ACD抗凝剂（A柠檬酸葡萄糖，Sigma公司，C3821）抗凝，全血与抗凝剂的比例为（9～11）∶1。取1 mL分离出来的外周血干细胞悬液，在流式细胞仪中检测CD34+干细胞的数量。干细胞采集质量控制标准：① 采集干细胞数量 ≥1×106个/kg体质量；② 采集干细胞悬液样本经涂片及细菌和真菌培养证实无细菌及真菌生长；③ 采集的干细胞悬液样本破坏的红细胞和血小板数量小于细胞总数的1%。经程序降温冷冻仪于 –80 ℃深低温冻存。
1.3 胰岛细胞获取
1.3.1 供体胰腺的获取
供体为成人心脏死亡器官捐献，采用标准的腹部多器官联合快速切取技术获取保留部分十二指肠及脾脏的胰腺，对供者的腹主动脉和门静脉双重灌注4 ℃的UW液（美国诺华公司）3 L，供体胰腺需在8 h内通过4 ℃转运箱送至GMP级别胰岛实验室。
1.3.2 胰岛的分离与纯化
常规检查胰腺，排除肿瘤。判断胰腺的质地、脂肪含量、血液含量等。初步评估胰腺可用后，在无菌冰水浴方盘中修整胰腺，去除胰腺周围的血管、结缔组织和脂肪组织后称重。在胰头与胰颈交界处横断，分别经主胰管插管固定，在120 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）压力下经主胰管注入Liberase酶液（德国SERVA公司）200 mL，使胰腺组织均匀膨胀，随后置于Ricordi系统中37 ℃进行消化，再使用COBE2991型细胞分离机进行连续密度梯度离心、纯化，收集纯化的胰岛，置于22 ℃含体积分数95%的CO2孵箱中培养并取样标本进行质量和安全评估。
1.3.3 胰岛的质量和安全评估
对胰岛样本的质量、安全性和细胞活性进行评估，符合程序后进入移植程序。具体方法：① 胰岛计数及纯度鉴定，采用双硫腙染色方法统计不同直径的胰岛数量，计算胰岛当量（islet equivalent quantity，IEQ）及纯度；② 胰岛细胞活性的鉴定，以双醋酸荧光素/碘丙啶荧光染色，计数胰岛活细胞百分比；③ 胰岛功能的鉴定，以葡萄糖刺激试验检测胰岛素刺激指数；④ 病原学检查，取胰岛悬液进行细菌革兰染色、细菌培养、真菌培养、支原体检测等；⑤ 采用动态浊度法检测内毒素水平。通过上述5项检测后等待移植。
1.4 胰岛细胞和（或）外周血干细胞移植
选择与供者ABO血型一致的受者接受胰岛移植。从培养箱取出配制好的胰岛细胞悬液，再次离心、清洗，加入胰岛专用移植液（美国Sigma公司）200 mL并按照受者体质量加入肝素（35 U/kg）。超声引导下经皮穿刺肝门静脉主干置管，胰岛细胞悬液以自然重力输注，移植到受者肝脏内，控制在30～40 min内完成；同时连续监测门静脉压和血糖变化，受者门静脉压均在<15 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa）的正常范围内。联合自体外周血干细胞移植者在移植当天提前进行干细胞复苏，移植前清洗含有二甲基亚砜的冻存液，配制成干细胞悬液。按照同样办法依次输入配置好的干细胞悬液。
1.5 免疫抑制方案
所有受者均采用改良的Edmonton免疫抑制剂方案。① 免疫诱导治疗方案：采用兔抗人T淋巴细胞免疫球蛋白100 mg（日本安斯泰来公司），术前30 min及术后第7 天时各静脉注射1次。术前2 h内皮下注射依那西普（美国辉瑞制药有限公司）50 mg，分别于术后第3、7、10天时每日皮下注射依那西普25 mg。② 免疫抑制方案：联合应用他克莫司（1 mg/d）+吗替麦考酚酯（1 g/d）。术后1个月时根据他克莫司血药浓度调整剂量，将血他克莫司浓度控制在3～5 μg/L。根据血糖水平、血他克莫司浓度等因素综合考虑吗替麦考酚酯的用量。
1.6 移植术后管理及随访
1.6.1 术后管理
移植术后3 d内，予以抗生素、抗真菌、抑酸、降低门静脉压、防止门静脉血栓形成等预防性用药。每2～4 h监测血糖1次，根据监测的血糖变化使用长效胰岛素1个月，严格使用胰岛素将血糖水平控制在7.8 mmol/L以下，每天监测肝肾功能，移植术后第7天时行彩色多普勒超声检查肝脏和门静脉系统，以排除门静脉高压及血栓。
1.6.2 术后随访
① 每周（根据手术日当天算，满7 d时为1周）测空腹和餐后2 h C肽水平、血常规及肝和肾功能；② 每3个月（根据手术日当天算，满90 d时为3个月）监测糖化血红蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）浓度、胰岛素抗体；③ 每周（根据手术日当天算，满7 d时为1周）监测免疫抑制剂血药浓度，当其稳定后每满30 d测定1次，根据其结果调整免疫抑制剂用量；④ 每6个月（根据手术日当天算，每满180 d）行24 h尿蛋白定量及眼底荧光血管造影检查各1次。
2 结果
2.1 纳入受者的基本情况
2017年1月至2019年12月期间我院完成同种异体胰岛细胞移植10例，其中单独同种异体胰岛细胞移植（简称单独组）受者5例，同种异体胰岛细胞联合自体外周血干细胞移植（简称联合组）受者5例。2组受者的年龄、性别、体质量指数见表1。
表1
2组T1MD受者的基本情况
2.2 胰岛的分离与纯化结果
所有10例供胰均成功分离出胰岛细胞（图1），胰岛计数42.5×104～55.0×104 IEQ、平均49.7×104 IEQ；胰岛纯度40.7%～65.0%、平均51.2%；胰岛活性为95.0%～97.2%、平均96.6%；刺激指数为2.7～5.6、平均4.1。所有胰岛细胞经细菌革兰染色、细菌培养、真菌培养及支原体检测均为阴性。
图1
示修剪后的供体胰腺（a）及消化过程中显微镜下所见的胰岛（b， ×400）
2.3 移植胰岛和 （或） 干细胞数量及胰岛素使用情况
2.3.1 移植胰岛和 （或） 干细胞数量
10例受者的移植胰岛数量见表2。移植胰岛数量在单独组为47.0×104～53.0×104 IEQ、（50.60±2.51）×104 IEQ，在联合组为42.5×104～55.0×104 IEQ、（48.70±4.76）×104 IEQ。联合组5例受者的自体干细胞移植数量见表2，干细胞移植数量5.6×107～12.8×107个、（9.2±2.6）×107 个。
表2
10例受者移植胰岛和（或）干细胞数量及胰岛素使用情况
2.3.2 胰岛素使用情况
10例受者术后在正常饮食下严格控制血糖在7.8 mmol/L以下，其术前（图表中以“0”表示）及术后36个月内不同时间点所需胰岛素用量见表2和图2a。从表2可见，单独组和联合组受者术后第12个月时分别均有3例撤除胰岛素，至术后第36个月时单独组和联合组受者分别有2例和3例撤除胰岛素。从图2a可见，术后不同时间点的胰岛素用量均较术前下降，2组的变化趋势基本一致，在术后12个月内，联合组胰岛素用量呈现出低于单独组的趋势。
图2
示单独组和联合组受者移植前后胰岛素用量（a）、空腹及餐后2 h C肽水平（b）及HbA1c（c）变化情况
2.4 术后糖代谢情况
2.4.1 术后C肽水平的变化
术后36个月内10例患者的空腹和餐后2 h的C肽水平见表3及图2b。术后36个月内，10例患者的C肽水平均为阳性（空腹或餐后2 h＞0.6 μg/L）。空腹及餐后2 h的C肽水平在术后不同时间点均较术前升高。① 空腹C肽水平，单独组在术后第24个月时达最高、联合组于术后第12个月时达最高，然后开始下降，且单独组下降趋势更明显而联合组下降趋势更平稳且逐步上升。② 餐后2 h的C肽水平，2组均于术后第12个月时达最高，然后开始下降，单独组下降趋势更明显而联合组下降趋势更平稳且逐步上升。
表3
10例受者手术前后不同时间点C肽水平及HbA1c结果
2.4.2 术后HbA1c的变化
术后36个月内10例受者的HbA1c见表3及图2c。术后不同时间点均较术前下降，至术后第6个月后基本维持正常平稳水平，2组的变化趋势基本一致。
2.5 糖尿病相关并发症及手术相关并发症情况
2.5.1 24 h尿蛋白
单独组的病例2和4的24 h尿蛋白阳性，其定量结果分别为2.36 g和1.2 g，术后第36个月时分别下降至1.06 g和0.6 g。联合组的病例8、9和10的24 h尿蛋白阳性，其定量结果分别为1.88 g、1.0 g及1.46 g，至术后第36个月时分别下降至0.5 g、<0.15 g及0.82 g。
2.5.2 眼底病变
单独组的病例1、2和5术前存在眼底病变，其中病例1和病例5由术前的Ⅱ级在术后第36个月时好转为Ⅰ级，病例2术前为Ⅳ级而在术后第36个月时无明显变化。联合组的病例8、9和10术前存在眼底病变，其中病例9由术前的Ⅰ级在术后第36个月时恢复正常，病例8由术前的Ⅳ级在术后第36个月时好转为Ⅲ级，病例10由术前的Ⅱ级在术后第36个月时好转为Ⅰ级。
2.5.3 手术相关并发症
2组受者住院及随访期间通过彩色多普勒超声检查均未发现肝脏及门静脉系统异常，肝和肾功能正常，未发生酮症酸中毒、严重低血糖等症状，术后均未出现急性排斥反应、感染等移植相关并发症。
3 讨论
胰岛移植是目前T1MD最理想的治疗方法，但也面临着供体器官严重短缺和远期疗效不满意的挑战[6]。最初的胰岛移植受到自身皮质激素等原因的排斥反应，影响了其移植后胰岛的存活及功能的稳定性。2000年Edmonton免疫抑制方案的提出使胰岛移植短期疗效显著提高，其疗效与安全性在多项临床研究[3, 7]中得到了证实。随后有临床研究[8]发现，尽管Edmonton免疫抑制方案的安全性良好，但由于患者术后免疫功能的逐渐重建，其T细胞抑制效应受到影响，移植胰岛的长期疗效仍不满意。因此，目前免疫抑制剂方案的应用仍面临长期副作用及耐药性的客观屏障，为进一步提高移植胰岛的长期有效性，需要探究更佳有效的治疗方式[9]。
由于干细胞能分泌保护性因子，对机体免疫反应起调节作用，还有组织修复功能，能改善局部微环境、胰岛再血管化、缓解移植胰岛免疫反应等特点，有研究[10-11]结果显示了其在糖尿病领域的临床应用前景。有研究[12]证实了应用胰岛与骨髓间充质干细胞联合移植治疗大鼠T1MD的远期疗效；此外，研究[13-15]还证实了胰岛移植手术简捷、创伤性小、安全且近期疗效良好；改良Edmonton免疫抑制剂方案使得胰岛移植后能更好地在体内定植，从而持续发挥胰岛分泌功能，改善T1MD的血糖调节能力及远期预后；并且由于自体外周血干细胞无免疫原性，安全性高，成本低，分化潜能高，可分泌促进细胞存活的生长因子，为胰岛细胞移植提供良好的存活环境。因此，在本研究中采用同种异体胰岛联合自体外周血干细胞移植治疗T1MD，术后采用改良Edmonton免疫抑制剂方案，胰岛移植采用的心脏死亡器官捐献供者胰腺，优化了胰岛分离与纯化及临床精准移植方案，结果发现，与单独组相比，联合组的C肽水平在术后第12个月时即达到峰值，而单独组患者于术后第24个月时才达到峰值，且术后第36个月时联合组的C肽水平下降不明显，而单独组术后第36个月时仍呈逐渐下降趋势，提示联合组治疗的患者胰岛移植存活率和稳定性更佳；此外，联合组和单独组患者术后第12个月时均有3例患者胰岛素撤除，而术后第36个月时联合组胰岛素撤除病例多于单独组（分别为3例和2例），并且联合干细胞移植并未增加明显的免疫排斥反应及不良反应。
分析联合干细胞移植体现出良好效果趋势的原因，干细胞可能通过以下途径协作改善移植胰岛功能：① 干细胞能增强胰岛β细胞的胰岛素分泌功能。通过干细胞向胰岛转移线粒体，保证其能量代谢并加强其功能，同时干细胞分泌的细胞外基质成分同样对胰岛的生存和功能起到一定的影响[16]。② 干细胞可以促进胰岛移植物再血管化。由于纯化胰岛时，破坏了胰岛本身周围的血管，影响了胰岛在受体中的存活，而干细胞分泌的多种细胞因子能帮助胰岛在10～14 d内在受体中重建血运，其通过Wnt信号通路调节血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、血管生成素等加快胰岛移植物的血运重建工作[17]。③ 干细胞具有较强的免疫调节作用，主要组织相容性复合体Ⅱ型分子不表达，而其Ⅰ型分子不表达或低表达，表明其免疫原性低，干细胞通过自分泌或旁分泌的方式，调节免疫细胞亚群，对固有免疫细胞群如使巨噬细胞和树突状细胞表型发生转化，同时对调节性T细胞和辅助性T细胞在数量跟比例上进行影响，从而调节免疫应答水平[18]。④ 干细胞调控内质网应激。当氧化应激、高糖毒性和脂毒性对胰岛移植物进行影响后，内质网功能会受到一定影响，从而导致移植物大量的死亡。目前干细胞减轻内质网应激机制尚不明确，但有研究[19-20]认为，干细胞主要通过两方面降低内质网应激，一方面干细胞分泌基质细胞衍生因子调控内质网应激关键蛋白表达，另一方面是干细胞分泌微小RNA-21减轻胰岛移植物的内质网应激。
总之，胰岛移植及干细胞移植是近年来糖尿病领域较有研究前景的治疗方式。目前有少量基础研究及少量小样本临床研究证实了联合干细胞移植可改善单独胰岛移植的远期疗效。本研究初步证实了此二者联合治疗T1MD的长期有效性及安全性，为未来糖尿病细胞治疗方案的制定提供了新的临床证据和理论基础。但其具体机制、更远期效果以及哪种情况下选择均不明确，需要更多中心、大样本及更长时间的临床试验研究来验证。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者间没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：黄孝伦、姚豫桐和赖春友负责供体胰腺摘除及细胞移植；杨钦焱、尚进和杨卯竹负责干细胞及胰岛细胞分离采集；姚豫桐、尚进、赖春友和张雯负责数据收集；冯天航负责数据分析；姚豫桐和黄孝伦负责研究指导、论文撰写及修改。
伦理声明：本研究通过了四川省医学科学院·四川省人民医院细胞生物治疗临床研究机构伦理委员会审批 ［批文编号：（干细胞）伦审2018001］。
1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）是由于胰岛β细胞受损导致胰岛素分泌绝对不足的一种T淋巴细胞引起的自身免疫性疾病。现有的外源性胰岛素替代治疗无法阻断其对全身多器官的微血管损害，而且容易出现酮症酸中毒、低血糖昏迷等严重并发症[1]。胰岛移植是目前最有可能治愈T1DM的有效方法。自2000年Edmonton方案提出以来，全球范围已完成超过1 500例临床胰岛移植，其术后5年胰岛素脱离率已超过50%，但其远期疗效仍不满意[2-3]。近年来研究[4-5]表明，干细胞有为胰岛细胞提供良好的定植及存活环境的优势。基于此，四川省人民医院（以下简称“我院” ）笔者所在研究团队将其二者结合，即实施同种异体胰岛联合自体干细胞移植治疗T1DM，术后已随访3年，现将3年的研究结果进行报道。
1 资料与方法
1.1 受者临床资料
回顾性收集2017年1月至2019年12月期间我院实施的同种异体胰岛细胞联合（或不联合）自体外周血干细胞移植受者的临床病理资料。我院符合胰岛移植条件的标准：① 18～65岁；② T1DM病史 >5年；③ 外源性胰岛素强化治疗仍不能控制血糖，有低血糖或酮症酸中毒症状发作或伴有如视力模糊、肾功能损害、神经性疼痛、心血管病变等糖尿病并发症。排除合并有肿瘤、感染（获得性免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒或细菌性）、门静脉高压症等的T1DM受者。本研究联合干细胞移植患者的选择是在四川省医学科学院·四川省人民医院细胞生物治疗临床研究机构伦理委员会批准且经患者及家属均签署知情同意书同意后，采用简单随机化临床分组法对患者采取联合或不联合干细胞移植治疗。
1.2 自体外周血干细胞制备
每天于受者皮下注射粒细胞集落刺激因子5 μg/kg（共3～5 d），同时监测患者的血常规及肝肾功能。当白细胞计数 >20×109/L后行股静脉插管，同时连接至血细胞分离机（费森尤斯，型号COM.TEC）采集患者干细胞。每次循环血量8 000～12 000 mL，采集外周血单个核细胞100～200 mL，全程采用ACD抗凝剂（A柠檬酸葡萄糖，Sigma公司，C3821）抗凝，全血与抗凝剂的比例为（9～11）∶1。取1 mL分离出来的外周血干细胞悬液，在流式细胞仪中检测CD34+干细胞的数量。干细胞采集质量控制标准：① 采集干细胞数量 ≥1×106个/kg体质量；② 采集干细胞悬液样本经涂片及细菌和真菌培养证实无细菌及真菌生长；③ 采集的干细胞悬液样本破坏的红细胞和血小板数量小于细胞总数的1%。经程序降温冷冻仪于 –80 ℃深低温冻存。
1.3 胰岛细胞获取
1.3.1 供体胰腺的获取
供体为成人心脏死亡器官捐献，采用标准的腹部多器官联合快速切取技术获取保留部分十二指肠及脾脏的胰腺，对供者的腹主动脉和门静脉双重灌注4 ℃的UW液（美国诺华公司）3 L，供体胰腺需在8 h内通过4 ℃转运箱送至GMP级别胰岛实验室。
1.3.2 胰岛的分离与纯化
常规检查胰腺，排除肿瘤。判断胰腺的质地、脂肪含量、血液含量等。初步评估胰腺可用后，在无菌冰水浴方盘中修整胰腺，去除胰腺周围的血管、结缔组织和脂肪组织后称重。在胰头与胰颈交界处横断，分别经主胰管插管固定，在120 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）压力下经主胰管注入Liberase酶液（德国SERVA公司）200 mL，使胰腺组织均匀膨胀，随后置于Ricordi系统中37 ℃进行消化，再使用COBE2991型细胞分离机进行连续密度梯度离心、纯化，收集纯化的胰岛，置于22 ℃含体积分数95%的CO2孵箱中培养并取样标本进行质量和安全评估。
1.3.3 胰岛的质量和安全评估
对胰岛样本的质量、安全性和细胞活性进行评估，符合程序后进入移植程序。具体方法：① 胰岛计数及纯度鉴定，采用双硫腙染色方法统计不同直径的胰岛数量，计算胰岛当量（islet equivalent quantity，IEQ）及纯度；② 胰岛细胞活性的鉴定，以双醋酸荧光素/碘丙啶荧光染色，计数胰岛活细胞百分比；③ 胰岛功能的鉴定，以葡萄糖刺激试验检测胰岛素刺激指数；④ 病原学检查，取胰岛悬液进行细菌革兰染色、细菌培养、真菌培养、支原体检测等；⑤ 采用动态浊度法检测内毒素水平。通过上述5项检测后等待移植。
1.4 胰岛细胞和（或）外周血干细胞移植
选择与供者ABO血型一致的受者接受胰岛移植。从培养箱取出配制好的胰岛细胞悬液，再次离心、清洗，加入胰岛专用移植液（美国Sigma公司）200 mL并按照受者体质量加入肝素（35 U/kg）。超声引导下经皮穿刺肝门静脉主干置管，胰岛细胞悬液以自然重力输注，移植到受者肝脏内，控制在30～40 min内完成；同时连续监测门静脉压和血糖变化，受者门静脉压均在<15 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa）的正常范围内。联合自体外周血干细胞移植者在移植当天提前进行干细胞复苏，移植前清洗含有二甲基亚砜的冻存液，配制成干细胞悬液。按照同样办法依次输入配置好的干细胞悬液。
1.5 免疫抑制方案
所有受者均采用改良的Edmonton免疫抑制剂方案。① 免疫诱导治疗方案：采用兔抗人T淋巴细胞免疫球蛋白100 mg（日本安斯泰来公司），术前30 min及术后第7 天时各静脉注射1次。术前2 h内皮下注射依那西普（美国辉瑞制药有限公司）50 mg，分别于术后第3、7、10天时每日皮下注射依那西普25 mg。② 免疫抑制方案：联合应用他克莫司（1 mg/d）+吗替麦考酚酯（1 g/d）。术后1个月时根据他克莫司血药浓度调整剂量，将血他克莫司浓度控制在3～5 μg/L。根据血糖水平、血他克莫司浓度等因素综合考虑吗替麦考酚酯的用量。
1.6 移植术后管理及随访
1.6.1 术后管理
移植术后3 d内，予以抗生素、抗真菌、抑酸、降低门静脉压、防止门静脉血栓形成等预防性用药。每2～4 h监测血糖1次，根据监测的血糖变化使用长效胰岛素1个月，严格使用胰岛素将血糖水平控制在7.8 mmol/L以下，每天监测肝肾功能，移植术后第7天时行彩色多普勒超声检查肝脏和门静脉系统，以排除门静脉高压及血栓。
1.6.2 术后随访
① 每周（根据手术日当天算，满7 d时为1周）测空腹和餐后2 h C肽水平、血常规及肝和肾功能；② 每3个月（根据手术日当天算，满90 d时为3个月）监测糖化血红蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）浓度、胰岛素抗体；③ 每周（根据手术日当天算，满7 d时为1周）监测免疫抑制剂血药浓度，当其稳定后每满30 d测定1次，根据其结果调整免疫抑制剂用量；④ 每6个月（根据手术日当天算，每满180 d）行24 h尿蛋白定量及眼底荧光血管造影检查各1次。
2 结果
2.1 纳入受者的基本情况
2017年1月至2019年12月期间我院完成同种异体胰岛细胞移植10例，其中单独同种异体胰岛细胞移植（简称单独组）受者5例，同种异体胰岛细胞联合自体外周血干细胞移植（简称联合组）受者5例。2组受者的年龄、性别、体质量指数见表1。
表1
2组T1MD受者的基本情况
2.2 胰岛的分离与纯化结果
所有10例供胰均成功分离出胰岛细胞（图1），胰岛计数42.5×104～55.0×104 IEQ、平均49.7×104 IEQ；胰岛纯度40.7%～65.0%、平均51.2%；胰岛活性为95.0%～97.2%、平均96.6%；刺激指数为2.7～5.6、平均4.1。所有胰岛细胞经细菌革兰染色、细菌培养、真菌培养及支原体检测均为阴性。
图1
示修剪后的供体胰腺（a）及消化过程中显微镜下所见的胰岛（b， ×400）
2.3 移植胰岛和 （或） 干细胞数量及胰岛素使用情况
2.3.1 移植胰岛和 （或） 干细胞数量
10例受者的移植胰岛数量见表2。移植胰岛数量在单独组为47.0×104～53.0×104 IEQ、（50.60±2.51）×104 IEQ，在联合组为42.5×104～55.0×104 IEQ、（48.70±4.76）×104 IEQ。联合组5例受者的自体干细胞移植数量见表2，干细胞移植数量5.6×107～12.8×107个、（9.2±2.6）×107 个。
表2
10例受者移植胰岛和（或）干细胞数量及胰岛素使用情况
2.3.2 胰岛素使用情况
10例受者术后在正常饮食下严格控制血糖在7.8 mmol/L以下，其术前（图表中以“0”表示）及术后36个月内不同时间点所需胰岛素用量见表2和图2a。从表2可见，单独组和联合组受者术后第12个月时分别均有3例撤除胰岛素，至术后第36个月时单独组和联合组受者分别有2例和3例撤除胰岛素。从图2a可见，术后不同时间点的胰岛素用量均较术前下降，2组的变化趋势基本一致，在术后12个月内，联合组胰岛素用量呈现出低于单独组的趋势。
图2
示单独组和联合组受者移植前后胰岛素用量（a）、空腹及餐后2 h C肽水平（b）及HbA1c（c）变化情况
2.4 术后糖代谢情况
2.4.1 术后C肽水平的变化
术后36个月内10例患者的空腹和餐后2 h的C肽水平见表3及图2b。术后36个月内，10例患者的C肽水平均为阳性（空腹或餐后2 h＞0.6 μg/L）。空腹及餐后2 h的C肽水平在术后不同时间点均较术前升高。① 空腹C肽水平，单独组在术后第24个月时达最高、联合组于术后第12个月时达最高，然后开始下降，且单独组下降趋势更明显而联合组下降趋势更平稳且逐步上升。② 餐后2 h的C肽水平，2组均于术后第12个月时达最高，然后开始下降，单独组下降趋势更明显而联合组下降趋势更平稳且逐步上升。
表3
10例受者手术前后不同时间点C肽水平及HbA1c结果
2.4.2 术后HbA1c的变化
术后36个月内10例受者的HbA1c见表3及图2c。术后不同时间点均较术前下降，至术后第6个月后基本维持正常平稳水平，2组的变化趋势基本一致。
2.5 糖尿病相关并发症及手术相关并发症情况
2.5.1 24 h尿蛋白
单独组的病例2和4的24 h尿蛋白阳性，其定量结果分别为2.36 g和1.2 g，术后第36个月时分别下降至1.06 g和0.6 g。联合组的病例8、9和10的24 h尿蛋白阳性，其定量结果分别为1.88 g、1.0 g及1.46 g，至术后第36个月时分别下降至0.5 g、<0.15 g及0.82 g。
2.5.2 眼底病变
单独组的病例1、2和5术前存在眼底病变，其中病例1和病例5由术前的Ⅱ级在术后第36个月时好转为Ⅰ级，病例2术前为Ⅳ级而在术后第36个月时无明显变化。联合组的病例8、9和10术前存在眼底病变，其中病例9由术前的Ⅰ级在术后第36个月时恢复正常，病例8由术前的Ⅳ级在术后第36个月时好转为Ⅲ级，病例10由术前的Ⅱ级在术后第36个月时好转为Ⅰ级。
2.5.3 手术相关并发症
2组受者住院及随访期间通过彩色多普勒超声检查均未发现肝脏及门静脉系统异常，肝和肾功能正常，未发生酮症酸中毒、严重低血糖等症状，术后均未出现急性排斥反应、感染等移植相关并发症。
3 讨论
胰岛移植是目前T1MD最理想的治疗方法，但也面临着供体器官严重短缺和远期疗效不满意的挑战[6]。最初的胰岛移植受到自身皮质激素等原因的排斥反应，影响了其移植后胰岛的存活及功能的稳定性。2000年Edmonton免疫抑制方案的提出使胰岛移植短期疗效显著提高，其疗效与安全性在多项临床研究[3, 7]中得到了证实。随后有临床研究[8]发现，尽管Edmonton免疫抑制方案的安全性良好，但由于患者术后免疫功能的逐渐重建，其T细胞抑制效应受到影响，移植胰岛的长期疗效仍不满意。因此，目前免疫抑制剂方案的应用仍面临长期副作用及耐药性的客观屏障，为进一步提高移植胰岛的长期有效性，需要探究更佳有效的治疗方式[9]。
由于干细胞能分泌保护性因子，对机体免疫反应起调节作用，还有组织修复功能，能改善局部微环境、胰岛再血管化、缓解移植胰岛免疫反应等特点，有研究[10-11]结果显示了其在糖尿病领域的临床应用前景。有研究[12]证实了应用胰岛与骨髓间充质干细胞联合移植治疗大鼠T1MD的远期疗效；此外，研究[13-15]还证实了胰岛移植手术简捷、创伤性小、安全且近期疗效良好；改良Edmonton免疫抑制剂方案使得胰岛移植后能更好地在体内定植，从而持续发挥胰岛分泌功能，改善T1MD的血糖调节能力及远期预后；并且由于自体外周血干细胞无免疫原性，安全性高，成本低，分化潜能高，可分泌促进细胞存活的生长因子，为胰岛细胞移植提供良好的存活环境。因此，在本研究中采用同种异体胰岛联合自体外周血干细胞移植治疗T1MD，术后采用改良Edmonton免疫抑制剂方案，胰岛移植采用的心脏死亡器官捐献供者胰腺，优化了胰岛分离与纯化及临床精准移植方案，结果发现，与单独组相比，联合组的C肽水平在术后第12个月时即达到峰值，而单独组患者于术后第24个月时才达到峰值，且术后第36个月时联合组的C肽水平下降不明显，而单独组术后第36个月时仍呈逐渐下降趋势，提示联合组治疗的患者胰岛移植存活率和稳定性更佳；此外，联合组和单独组患者术后第12个月时均有3例患者胰岛素撤除，而术后第36个月时联合组胰岛素撤除病例多于单独组（分别为3例和2例），并且联合干细胞移植并未增加明显的免疫排斥反应及不良反应。
分析联合干细胞移植体现出良好效果趋势的原因，干细胞可能通过以下途径协作改善移植胰岛功能：① 干细胞能增强胰岛β细胞的胰岛素分泌功能。通过干细胞向胰岛转移线粒体，保证其能量代谢并加强其功能，同时干细胞分泌的细胞外基质成分同样对胰岛的生存和功能起到一定的影响[16]。② 干细胞可以促进胰岛移植物再血管化。由于纯化胰岛时，破坏了胰岛本身周围的血管，影响了胰岛在受体中的存活，而干细胞分泌的多种细胞因子能帮助胰岛在10～14 d内在受体中重建血运，其通过Wnt信号通路调节血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、血管生成素等加快胰岛移植物的血运重建工作[17]。③ 干细胞具有较强的免疫调节作用，主要组织相容性复合体Ⅱ型分子不表达，而其Ⅰ型分子不表达或低表达，表明其免疫原性低，干细胞通过自分泌或旁分泌的方式，调节免疫细胞亚群，对固有免疫细胞群如使巨噬细胞和树突状细胞表型发生转化，同时对调节性T细胞和辅助性T细胞在数量跟比例上进行影响，从而调节免疫应答水平[18]。④ 干细胞调控内质网应激。当氧化应激、高糖毒性和脂毒性对胰岛移植物进行影响后，内质网功能会受到一定影响，从而导致移植物大量的死亡。目前干细胞减轻内质网应激机制尚不明确，但有研究[19-20]认为，干细胞主要通过两方面降低内质网应激，一方面干细胞分泌基质细胞衍生因子调控内质网应激关键蛋白表达，另一方面是干细胞分泌微小RNA-21减轻胰岛移植物的内质网应激。
总之，胰岛移植及干细胞移植是近年来糖尿病领域较有研究前景的治疗方式。目前有少量基础研究及少量小样本临床研究证实了联合干细胞移植可改善单独胰岛移植的远期疗效。本研究初步证实了此二者联合治疗T1MD的长期有效性及安全性，为未来糖尿病细胞治疗方案的制定提供了新的临床证据和理论基础。但其具体机制、更远期效果以及哪种情况下选择均不明确，需要更多中心、大样本及更长时间的临床试验研究来验证。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者间没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：黄孝伦、姚豫桐和赖春友负责供体胰腺摘除及细胞移植；杨钦焱、尚进和杨卯竹负责干细胞及胰岛细胞分离采集；姚豫桐、尚进、赖春友和张雯负责数据收集；冯天航负责数据分析；姚豫桐和黄孝伦负责研究指导、论文撰写及修改。
伦理声明：本研究通过了四川省医学科学院·四川省人民医院细胞生物治疗临床研究机构伦理委员会审批 ［批文编号：（干细胞）伦审2018001］。
