引用本文： 尹艳梅, 李俊峰, 彭磊, 阮万百, 朱克祥. 减毒沙门菌在肿瘤治疗中的研究进展. 中国普外基础与临床杂志, 2023, 30(8): 988-994. doi: 10.7507/1007-9424.202304004 复制
0 引言
肿瘤是一种可在人体各个器官和组织发生的异常的、无法受到正常调控的细胞增生，并且如果不加以控制，肿瘤细胞会不断向周围正常组织蔓延，甚至通过血液或淋巴系统转移至身体其他部位形成新的肿瘤。近年来，由于人口老龄化、环境污染、不健康的生活方式和饮食习惯，全球恶性肿瘤的发病率和死亡率呈现出快速增长的趋势，研究[1]表明，恶性肿瘤已经成为当前全球70岁前死亡的首要原因，所以寻找更好的治疗方案迫在眉睫。越来越多的研究者开始探寻细菌介导的肿瘤治疗能否成为一种新的抗肿瘤治疗方案。
沙门菌（Salmonella typhimurium，ST）是一种兼性胞内细菌，可在无氧条件下生长并能依赖肿瘤坏死区域增殖[2]。减毒ST在野生ST的基础上进行基因修饰—删除或削弱有毒性基因、增强免疫原性和抗肿瘤作用的基因，减弱对正常组织的毒性，并加强原有的抗肿瘤作用。笔者现主要从抑制原发肿瘤生长和减少继发肿瘤发生两方面具体阐述减毒ST发挥抗肿瘤作用的可能机制，并探讨减毒ST临床应用所面临的问题及解决方案。
1 抑制原发肿瘤生长
1.1 靶向和定植作用
当肿瘤内富集的减毒ST量超过109/g时，可使其在肿瘤组织与正常组织的比值位于250∶1和9 000∶1之间，抑制肿瘤生长，延长小鼠生存期[3]。Pawelek等[4]和Rabea等[5]研究发现，减毒ST尾静脉注入携带黑色素瘤的小鼠体内后，可被丝氨酸、天冬氨酸和半乳糖/核糖等肿瘤表面受体吸引到肿瘤组织。同时刺激肿瘤细胞产生肿瘤坏死因子α、γ干扰素、白介素12等增强肿瘤血管通透性的细胞因子，协助其进入肿瘤[3, 6-8]。 Saltzman等[9]和Jawalagatti等[10]的研究结果也证明尾静脉注射减毒ST时，减毒ST能够靶向定植于小鼠乳腺癌组织。Ebelt等[11]和Tan等[12]的研究证明，在静脉注射减毒ST时，减毒ST能够优先定植于小鼠原位人胰腺导管腺癌肿瘤组织。以上研究表明，静脉注射减毒ST后，减毒ST都能够定植于肿瘤组织，能最大限度地减少肿瘤外毒性，实现精准治疗。
1.2 免疫作用
减毒ST进入小鼠体内后通过细胞吞噬、免疫细胞浸润和补体途径激活，发挥免疫攻击和抗肿瘤作用。Liang等[13]通过对多种重组减毒株的抗肿瘤作用进行评估证明了宿主在感染ST后，ST主要分布在肿瘤细胞胞质中，根据Ⅲ型分泌系统调节细胞功能，使其在一定程度上抵抗单核-巨噬系统对外来物质的清除作用，使ST能够在巨噬细胞中存活。并且通过Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）4信号通路向肿瘤组织中招募如中性粒细胞、巨噬细胞等固有免疫细胞吞噬肿瘤细胞[14-15]。Chen等[16]认为，招募到的免疫细胞被减毒ST原位分泌的鞭毛蛋白/TLR5/核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路激活，进而产生活性氧、一氧化氮（nitric oxide，NO）、蛋白酶、膜穿孔剂、细胞因子等细胞毒性介质以杀死肿瘤细胞[17]。Yang等[18]制作的时间蛋白质组图谱进一步提出减毒ST可以激活固有免疫和特异免疫的功能桥梁—补体途径，诱导小鼠发生先天性、适应性免疫综合防御。
除传统的免疫作用外，减毒ST还可以引发肿瘤细胞发生焦亡、自噬作用，抑制肿瘤进展。既往研究[8]证实减毒ST进入肿瘤细胞后，被吞噬小体中的核苷酸结合寡聚化结构域（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）样受体（NOD-like receptor，NLR）识别后触发形成炎性小体。大量富集在一起的炎性小体激活细胞焦亡的主要效应蛋白酶—含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（caspase-1），进而诱导肿瘤细胞焦亡；除此之外，活化的caspase-1可以将巨噬细胞产生的前体IL-1β水解为IL-1β，进一步促进细胞免疫应答。与细胞焦亡作用类似，减毒ST进入宿主体内后，可通过Toll样受体信号促进自噬小体的标记分子LC3募集到自噬小体，通过TLR/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶点（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路诱导肿瘤细胞自噬，抑制结直肠癌小鼠肿瘤进展。
1.3 营养竞争作用
Miyake等[19]的研究结果表明，减毒ST首先可以诱导内皮细胞凋亡和坏死，降低肿瘤中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）水平和CD31阳性细胞百分比，从而抑制肿瘤内新血管生成，减少肿瘤营养供给通道；其次，刺激产生的固有免疫相关细胞可以和血小板协同诱导，激活凝血途径，在肿瘤组织内部新生血管内形成血栓，阻断肿瘤营养供给通道；最后，能在肿瘤厌氧区增殖旺盛，与肿瘤细胞竞争营养，抑制肿瘤生长[20]。除此之外，另外两项与减毒ST抗血管生成相关的研究[21-22]中提出，减毒ST抑制肿瘤内新生血管形成还可以导致肿瘤微环境更加缺氧，进而形成低氧肿瘤微环境和减毒ST定植之间的正反馈循环，增强减毒ST的抗肿瘤效果。
1.4 质粒携带作用
因为减毒ST既能靶向实体肿瘤的缺氧坏死区，又易于重组操作[23]，所以它可以携带和共表达一些外源性免疫佐剂和抗原、治疗基因和溶瘤病毒，如肿瘤相关抗原、细胞毒性分子、免疫调节分子、促凋亡蛋白、核酸、纳米颗粒等进入肿瘤微环境[24-25]，可有效地诱导免疫细胞活化、细胞因子分泌、细胞毒性淋巴细胞产生和特异性抗体形成，激发有效的免疫反应[26-30]，抑制肿瘤生长。近几年间与质粒携带作用相关的减毒ST抗肿瘤作用的研究见表1。
表1
减毒ST质粒携带作用相关研究
1.5 联合传统疗法
1.5.1 改善化疗药物耐药问题
肿瘤耐药的发生主要有以下3点原因：① 肿瘤细胞的细胞周期易于停滞在耐药的G0/G1期[42]；② 肿瘤细胞周围过度生产的胶原、透明质酸等细胞外基质成分在肿瘤细胞周围形成致密的基质屏障限制药物进入[43]；③ 肿瘤细胞的细胞膜上的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）会将化疗药物泵出细胞[44]。减毒ST可以针对以上3点改善肿瘤耐药。首先，减毒ST与重组甲硫氨酸酶联合应用时，减毒ST可以诱导肿瘤细胞从耐药的G0/G1期进入药物敏感的S/G2/M期[19, 45-46]，随后重组甲硫氨酸酶特异地将肿瘤细胞捕获在S/G2期，使肿瘤细胞对药物保持敏感性[47-48]。而且，甲硫氨酸是肿瘤细胞的“营养剂”，肿瘤细胞具有甲硫氨酸依赖性，肿瘤甲硫氨酸水平与肿瘤大小密切相关，甲硫氨酸酶可降解甲硫氨酸，进而影响肿瘤的营养供应。其次，减毒ST可以清除胰腺癌小鼠肿瘤细胞周围的细胞外基质屏障，增加化疗药物的渗透浓度，改善耐药[11]。最后，减毒ST可以通过转录后调节或者抑制Akt/mTOR途径降低P-gp的表达，进而减少化疗药物的外排，改善耐药[44]。
1.5.2 增强传统疗法的疗效
减毒ST可以与传统疗法发生互补、协同、增效作用，增强传统疗法的疗效。① 互补作用：实体瘤的肿瘤组织处于乏氧状态（正常组织中氧含量为 3%～15%，肿瘤组织氧含量为1%） [49]。Zhao等[50]的研究表明，缺血缺氧可促使晚期肝癌发生三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）的抵抗，此时，减毒ST能靶向定植于缺血缺氧区并大量增殖，发挥抗肿瘤作用，弥补ATO在缺血缺氧区抗肿瘤效力的不足。两者作用互补，共同抑制晚期肝癌大鼠的肿瘤生长，减少肺转移，延长总生存期。② 协同作用：Gao等[51]的研究表明，辐射能够协助减少减毒ST对正常细胞的毒性，增强其在肿瘤细胞内的有效积聚，且两者都可以刺激细胞因子的分泌，招募肿瘤组织中的免疫细胞，继而协同抑制肿瘤生长，延长结肠癌小鼠生存期。Ahmed等[26]研究结果表明，鞘内注射减毒ST和抗PD-1抗体均可导致肿瘤细胞凋亡，减少肿瘤血管生成，共同抑制小鼠神经鞘瘤生长。Kung等[52]研究证实减毒ST和白蛋白-IL-2协同驱动特异性细胞免疫，延长特异性细胞免疫作用时间，增强特异性细胞免疫反应效果，抑制小鼠结直肠癌的生长。③ 增效作用：化疗增强细菌靶向和细菌靶向增强化疗是癌症治疗中非常强大的相互增效作用。减毒ST免疫疗法在CHOP方案治疗的动物中增强了NK细胞的细胞毒活性，并诱导了系统性淋巴瘤特异性的体液和细胞反应，从而显著降低肿瘤活性[53]。
1.6 联合新兴技术
纳米革兰阴性菌外膜囊泡结构特殊，可通过刺激宿主免疫系统和逆转抑制的肿瘤微环境抑制肿瘤生长。Aly等[54]通过减毒ST ATCC14028的外膜囊泡对人结直肠癌（HTC116）、乳腺癌（MCF-7）和肝细胞癌（HepG2）细胞株抗肿瘤活性影响的相关研究表明，纳米减毒ST外膜囊泡易于通过毛细血管，能在肿瘤血管中快速分布；纳米减毒ST外膜囊泡可引起VEGF基因表达下降，发挥抗血管生成作用；纳米减毒ST外膜囊泡可上调肿瘤组织中Bax基因的表达，进而刺激细胞凋亡的内在途径，诱导肿瘤细胞凋亡；纳米减毒ST外膜囊泡体内的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）含量相对较高，PAMPs与模式识别受体相互作用，激活肿瘤细胞自噬，发挥抗肿瘤作用。
2 抑制继发肿瘤转移
减毒ST可通过Akt相关通路，抑制肿瘤转移相关蛋白的产生进而抑制肿瘤转移。基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）参与了细胞外基质的降解、血管生成，在肿瘤的转移中发挥重要作用，ST通过Akt/mTOR途径降低MMP-9的表达，继而抑制原发肿瘤中MMP-9的分泌和功能，减少了体外肿瘤的迁移和体内肿瘤结节的形成[55]。Chiu等[56]研究表明，减毒ST可以通过Akt/细胞外调节蛋白（extracellular regulated protein kinases，ERK）信号通路降低黑色素瘤小鼠和乳腺癌小鼠肿瘤细胞中参与肿瘤转移的乙酰肝素酶的功能和表达，使小鼠肺内转移结节数量减少。Lee等[57]的研究表明，减毒ST可以通过Akt/mTOR/P70S6K信号途径抑制C-X-C趋化因子受体4（C-X-C chemokine receptor 4，CXCR4）蛋白的表达，进而通过抑制配体受体反应，抑制黑色素瘤小鼠和肺癌小鼠体内肿瘤细胞从原发位点转移到C-X-C家族趋化因子配体12（C-X-C family chemokine ligand 12，CXCL12）高表达位点的继发定植，阻止肿瘤转移。Pangilinan等[58]研究阐明减毒ST可以通过Akt/mTOR信号通路抑制对细胞迁移至关重要的上皮-间充质转变诱导剂—SNAIL家族转录抑制因子1（snail family transcriptional repressor 1，SNAI1）的表达，继而抑制黑色素瘤在小鼠体外和体内的转移。
3 临床试验失败的可能原因与改进方案
虽然减毒ST的细胞和动物实验的抗肿瘤效果均十分明确，但是临床试验表明其未能完全在人肿瘤组织中建群，这两者结果相矛盾，也大大影响了减毒ST在临床细菌治疗上的推广[59]。这可能与人免疫系统的高度复杂性和ST的过度减毒有关，现有研究基于这两方面提出了一些改进方案。
3.1 ST的过度减毒
减毒ST在降低对正常细胞的毒性作用的同时，也影响了它的抗肿瘤效用。为避免这一现象，可以通过以下几种方法增强减毒ST的肿瘤靶向作用，继而降低对ST的减毒需要。其一，创建一种营养缺陷型突变体，该突变体所需的特定营养物仅存在于肿瘤组织中，受营养物质趋化靶向肿瘤组织[60]。其二，将减毒ST必需基因置于缺氧条件启动子下，使减毒ST只在乏氧的肿瘤组织中表达，同时迅速从正常组织中消除，以实现从正常组织中快速清除细菌，不会像减毒方法那样损害细菌的其他功能或肿瘤适应性，减少正常组织中的细菌负荷并增加肿瘤靶向特异性[31]。其三，通过肿瘤内感染途径，使大剂量ST绕过全身感染遇到的先天免疫杀伤，直接靶向肿瘤细胞[61]。其四，利用纳米银颗粒（silver nanoparticles，AgNPs）提高ST的有效性和生物安全性，靶向肿瘤的AgNPs可以在完全根除肿瘤后清除残留减毒ST以减少副作用[62]。
3.2 中性粒细胞和细胞自噬的肃清作用
中性粒细胞的免疫作用和细胞自噬不仅能针对肿瘤细胞发挥抗肿瘤作用，还能肃清进入肿瘤组织的减毒ST。Tian等[63]认为减毒菌进入人体后，肿瘤细胞和固有免疫产生的巨噬细胞可通过TLR信号传导产生趋化因子，促进中性粒细胞向肿瘤募集，中性粒细胞发挥的免疫作用虽然能在一定程度上杀死肿瘤细胞，但是肿瘤浸润性中性粒细胞也会抑制坏死区的细菌，并抑制细菌迁移到存活的癌细胞区，减弱细菌的抗癌活性[64]，所以，减毒ST的ΔppGpp菌株介导的基因治疗具有稳健的短期抗癌效果，但不能预防后续肿瘤复发和转移，在最初细菌诱导的肿瘤缩小后开始重新生长[65]。中性粒细胞的募集降低了减毒ST的疗效和寿命，特异性削弱细菌介导的免疫治疗诱导的局部肿瘤浸润中性粒细胞募集的替代策略可能是一种更可行的治疗方法。减毒ST在临床前模型中抑制肿瘤生长，但其在人体中的作用有限，可能是因为细胞产生了自噬反应，从而破坏了治疗细菌。为了中和机体的这种保护性反应，可以将减毒ST与含有自噬抑制剂羟氯喹的长循环脂质体结合，以阻止减毒ST被细胞自噬作用破坏。碱化溶酶体等酸性囊泡，从而阻止被困在其中的减毒ST降解[66]。
3.3 蛋白酶灭活功能蛋白
蛋白酶可以干扰蛋白质加工、降解由减毒ST作为载体携带进入肿瘤组织的效应蛋白和分泌蛋白。解决该问题的最常用方法是使用一种或多种蛋白酶缺陷的细胞，但是在这一过程中，减毒ST在靶向肿瘤组织中定居的能力可能受到蛋白酶突变缺失影响而降低。其次是改造蛋白质以消除特异性蛋白酶切割位点，但是由于蛋白质结构-功能关系的限制，在其应用中可能具有局限性。最后，减毒ST可以作为细菌载体，通过携带蛋白酶抑制剂来有效克服蛋白酶，而且部分减毒ST菌株在将某些蛋白酶抑制剂递送到肿瘤组织过程中可能会产生诱导肿瘤细胞凋亡的附加作用[66]。
4 总结与展望
综上所述，减毒ST可在抑制原发肿瘤生长和继发肿瘤转移中发挥重要作用。然而，要想应用于临床，如何在保证减毒ST安全性的同时保障其抗肿瘤活性，是亟需解决的一大难题，除增强减毒ST的靶向性以降低菌株的减毒必要性、逃避中性粒细胞和细胞自噬对ST的肃清作用和避免蛋白酶对起抗肿瘤作用的功能蛋白的降解外，尚需大量的临床试验和临床前试验去探索。这一问题的解决将为肿瘤患者精准治疗提供一个新的治疗选择。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：尹艳梅负责查阅文献、起草和撰写文章；李俊峰和阮万百负责修订文章结构及文章重要论点；彭磊负责修订论文格式；朱克祥给予指导性意见并对最终文稿的内容进行审阅。
0 引言
肿瘤是一种可在人体各个器官和组织发生的异常的、无法受到正常调控的细胞增生，并且如果不加以控制，肿瘤细胞会不断向周围正常组织蔓延，甚至通过血液或淋巴系统转移至身体其他部位形成新的肿瘤。近年来，由于人口老龄化、环境污染、不健康的生活方式和饮食习惯，全球恶性肿瘤的发病率和死亡率呈现出快速增长的趋势，研究[1]表明，恶性肿瘤已经成为当前全球70岁前死亡的首要原因，所以寻找更好的治疗方案迫在眉睫。越来越多的研究者开始探寻细菌介导的肿瘤治疗能否成为一种新的抗肿瘤治疗方案。
沙门菌（Salmonella typhimurium，ST）是一种兼性胞内细菌，可在无氧条件下生长并能依赖肿瘤坏死区域增殖[2]。减毒ST在野生ST的基础上进行基因修饰—删除或削弱有毒性基因、增强免疫原性和抗肿瘤作用的基因，减弱对正常组织的毒性，并加强原有的抗肿瘤作用。笔者现主要从抑制原发肿瘤生长和减少继发肿瘤发生两方面具体阐述减毒ST发挥抗肿瘤作用的可能机制，并探讨减毒ST临床应用所面临的问题及解决方案。
1 抑制原发肿瘤生长
1.1 靶向和定植作用
当肿瘤内富集的减毒ST量超过109/g时，可使其在肿瘤组织与正常组织的比值位于250∶1和9 000∶1之间，抑制肿瘤生长，延长小鼠生存期[3]。Pawelek等[4]和Rabea等[5]研究发现，减毒ST尾静脉注入携带黑色素瘤的小鼠体内后，可被丝氨酸、天冬氨酸和半乳糖/核糖等肿瘤表面受体吸引到肿瘤组织。同时刺激肿瘤细胞产生肿瘤坏死因子α、γ干扰素、白介素12等增强肿瘤血管通透性的细胞因子，协助其进入肿瘤[3, 6-8]。 Saltzman等[9]和Jawalagatti等[10]的研究结果也证明尾静脉注射减毒ST时，减毒ST能够靶向定植于小鼠乳腺癌组织。Ebelt等[11]和Tan等[12]的研究证明，在静脉注射减毒ST时，减毒ST能够优先定植于小鼠原位人胰腺导管腺癌肿瘤组织。以上研究表明，静脉注射减毒ST后，减毒ST都能够定植于肿瘤组织，能最大限度地减少肿瘤外毒性，实现精准治疗。
1.2 免疫作用
减毒ST进入小鼠体内后通过细胞吞噬、免疫细胞浸润和补体途径激活，发挥免疫攻击和抗肿瘤作用。Liang等[13]通过对多种重组减毒株的抗肿瘤作用进行评估证明了宿主在感染ST后，ST主要分布在肿瘤细胞胞质中，根据Ⅲ型分泌系统调节细胞功能，使其在一定程度上抵抗单核-巨噬系统对外来物质的清除作用，使ST能够在巨噬细胞中存活。并且通过Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）4信号通路向肿瘤组织中招募如中性粒细胞、巨噬细胞等固有免疫细胞吞噬肿瘤细胞[14-15]。Chen等[16]认为，招募到的免疫细胞被减毒ST原位分泌的鞭毛蛋白/TLR5/核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路激活，进而产生活性氧、一氧化氮（nitric oxide，NO）、蛋白酶、膜穿孔剂、细胞因子等细胞毒性介质以杀死肿瘤细胞[17]。Yang等[18]制作的时间蛋白质组图谱进一步提出减毒ST可以激活固有免疫和特异免疫的功能桥梁—补体途径，诱导小鼠发生先天性、适应性免疫综合防御。
除传统的免疫作用外，减毒ST还可以引发肿瘤细胞发生焦亡、自噬作用，抑制肿瘤进展。既往研究[8]证实减毒ST进入肿瘤细胞后，被吞噬小体中的核苷酸结合寡聚化结构域（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）样受体（NOD-like receptor，NLR）识别后触发形成炎性小体。大量富集在一起的炎性小体激活细胞焦亡的主要效应蛋白酶—含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（caspase-1），进而诱导肿瘤细胞焦亡；除此之外，活化的caspase-1可以将巨噬细胞产生的前体IL-1β水解为IL-1β，进一步促进细胞免疫应答。与细胞焦亡作用类似，减毒ST进入宿主体内后，可通过Toll样受体信号促进自噬小体的标记分子LC3募集到自噬小体，通过TLR/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶点（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路诱导肿瘤细胞自噬，抑制结直肠癌小鼠肿瘤进展。
1.3 营养竞争作用
Miyake等[19]的研究结果表明，减毒ST首先可以诱导内皮细胞凋亡和坏死，降低肿瘤中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）水平和CD31阳性细胞百分比，从而抑制肿瘤内新血管生成，减少肿瘤营养供给通道；其次，刺激产生的固有免疫相关细胞可以和血小板协同诱导，激活凝血途径，在肿瘤组织内部新生血管内形成血栓，阻断肿瘤营养供给通道；最后，能在肿瘤厌氧区增殖旺盛，与肿瘤细胞竞争营养，抑制肿瘤生长[20]。除此之外，另外两项与减毒ST抗血管生成相关的研究[21-22]中提出，减毒ST抑制肿瘤内新生血管形成还可以导致肿瘤微环境更加缺氧，进而形成低氧肿瘤微环境和减毒ST定植之间的正反馈循环，增强减毒ST的抗肿瘤效果。
1.4 质粒携带作用
因为减毒ST既能靶向实体肿瘤的缺氧坏死区，又易于重组操作[23]，所以它可以携带和共表达一些外源性免疫佐剂和抗原、治疗基因和溶瘤病毒，如肿瘤相关抗原、细胞毒性分子、免疫调节分子、促凋亡蛋白、核酸、纳米颗粒等进入肿瘤微环境[24-25]，可有效地诱导免疫细胞活化、细胞因子分泌、细胞毒性淋巴细胞产生和特异性抗体形成，激发有效的免疫反应[26-30]，抑制肿瘤生长。近几年间与质粒携带作用相关的减毒ST抗肿瘤作用的研究见表1。
表1
减毒ST质粒携带作用相关研究
1.5 联合传统疗法
1.5.1 改善化疗药物耐药问题
肿瘤耐药的发生主要有以下3点原因：① 肿瘤细胞的细胞周期易于停滞在耐药的G0/G1期[42]；② 肿瘤细胞周围过度生产的胶原、透明质酸等细胞外基质成分在肿瘤细胞周围形成致密的基质屏障限制药物进入[43]；③ 肿瘤细胞的细胞膜上的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）会将化疗药物泵出细胞[44]。减毒ST可以针对以上3点改善肿瘤耐药。首先，减毒ST与重组甲硫氨酸酶联合应用时，减毒ST可以诱导肿瘤细胞从耐药的G0/G1期进入药物敏感的S/G2/M期[19, 45-46]，随后重组甲硫氨酸酶特异地将肿瘤细胞捕获在S/G2期，使肿瘤细胞对药物保持敏感性[47-48]。而且，甲硫氨酸是肿瘤细胞的“营养剂”，肿瘤细胞具有甲硫氨酸依赖性，肿瘤甲硫氨酸水平与肿瘤大小密切相关，甲硫氨酸酶可降解甲硫氨酸，进而影响肿瘤的营养供应。其次，减毒ST可以清除胰腺癌小鼠肿瘤细胞周围的细胞外基质屏障，增加化疗药物的渗透浓度，改善耐药[11]。最后，减毒ST可以通过转录后调节或者抑制Akt/mTOR途径降低P-gp的表达，进而减少化疗药物的外排，改善耐药[44]。
1.5.2 增强传统疗法的疗效
减毒ST可以与传统疗法发生互补、协同、增效作用，增强传统疗法的疗效。① 互补作用：实体瘤的肿瘤组织处于乏氧状态（正常组织中氧含量为 3%～15%，肿瘤组织氧含量为1%） [49]。Zhao等[50]的研究表明，缺血缺氧可促使晚期肝癌发生三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）的抵抗，此时，减毒ST能靶向定植于缺血缺氧区并大量增殖，发挥抗肿瘤作用，弥补ATO在缺血缺氧区抗肿瘤效力的不足。两者作用互补，共同抑制晚期肝癌大鼠的肿瘤生长，减少肺转移，延长总生存期。② 协同作用：Gao等[51]的研究表明，辐射能够协助减少减毒ST对正常细胞的毒性，增强其在肿瘤细胞内的有效积聚，且两者都可以刺激细胞因子的分泌，招募肿瘤组织中的免疫细胞，继而协同抑制肿瘤生长，延长结肠癌小鼠生存期。Ahmed等[26]研究结果表明，鞘内注射减毒ST和抗PD-1抗体均可导致肿瘤细胞凋亡，减少肿瘤血管生成，共同抑制小鼠神经鞘瘤生长。Kung等[52]研究证实减毒ST和白蛋白-IL-2协同驱动特异性细胞免疫，延长特异性细胞免疫作用时间，增强特异性细胞免疫反应效果，抑制小鼠结直肠癌的生长。③ 增效作用：化疗增强细菌靶向和细菌靶向增强化疗是癌症治疗中非常强大的相互增效作用。减毒ST免疫疗法在CHOP方案治疗的动物中增强了NK细胞的细胞毒活性，并诱导了系统性淋巴瘤特异性的体液和细胞反应，从而显著降低肿瘤活性[53]。
1.6 联合新兴技术
纳米革兰阴性菌外膜囊泡结构特殊，可通过刺激宿主免疫系统和逆转抑制的肿瘤微环境抑制肿瘤生长。Aly等[54]通过减毒ST ATCC14028的外膜囊泡对人结直肠癌（HTC116）、乳腺癌（MCF-7）和肝细胞癌（HepG2）细胞株抗肿瘤活性影响的相关研究表明，纳米减毒ST外膜囊泡易于通过毛细血管，能在肿瘤血管中快速分布；纳米减毒ST外膜囊泡可引起VEGF基因表达下降，发挥抗血管生成作用；纳米减毒ST外膜囊泡可上调肿瘤组织中Bax基因的表达，进而刺激细胞凋亡的内在途径，诱导肿瘤细胞凋亡；纳米减毒ST外膜囊泡体内的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）含量相对较高，PAMPs与模式识别受体相互作用，激活肿瘤细胞自噬，发挥抗肿瘤作用。
2 抑制继发肿瘤转移
减毒ST可通过Akt相关通路，抑制肿瘤转移相关蛋白的产生进而抑制肿瘤转移。基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）参与了细胞外基质的降解、血管生成，在肿瘤的转移中发挥重要作用，ST通过Akt/mTOR途径降低MMP-9的表达，继而抑制原发肿瘤中MMP-9的分泌和功能，减少了体外肿瘤的迁移和体内肿瘤结节的形成[55]。Chiu等[56]研究表明，减毒ST可以通过Akt/细胞外调节蛋白（extracellular regulated protein kinases，ERK）信号通路降低黑色素瘤小鼠和乳腺癌小鼠肿瘤细胞中参与肿瘤转移的乙酰肝素酶的功能和表达，使小鼠肺内转移结节数量减少。Lee等[57]的研究表明，减毒ST可以通过Akt/mTOR/P70S6K信号途径抑制C-X-C趋化因子受体4（C-X-C chemokine receptor 4，CXCR4）蛋白的表达，进而通过抑制配体受体反应，抑制黑色素瘤小鼠和肺癌小鼠体内肿瘤细胞从原发位点转移到C-X-C家族趋化因子配体12（C-X-C family chemokine ligand 12，CXCL12）高表达位点的继发定植，阻止肿瘤转移。Pangilinan等[58]研究阐明减毒ST可以通过Akt/mTOR信号通路抑制对细胞迁移至关重要的上皮-间充质转变诱导剂—SNAIL家族转录抑制因子1（snail family transcriptional repressor 1，SNAI1）的表达，继而抑制黑色素瘤在小鼠体外和体内的转移。
3 临床试验失败的可能原因与改进方案
虽然减毒ST的细胞和动物实验的抗肿瘤效果均十分明确，但是临床试验表明其未能完全在人肿瘤组织中建群，这两者结果相矛盾，也大大影响了减毒ST在临床细菌治疗上的推广[59]。这可能与人免疫系统的高度复杂性和ST的过度减毒有关，现有研究基于这两方面提出了一些改进方案。
3.1 ST的过度减毒
减毒ST在降低对正常细胞的毒性作用的同时，也影响了它的抗肿瘤效用。为避免这一现象，可以通过以下几种方法增强减毒ST的肿瘤靶向作用，继而降低对ST的减毒需要。其一，创建一种营养缺陷型突变体，该突变体所需的特定营养物仅存在于肿瘤组织中，受营养物质趋化靶向肿瘤组织[60]。其二，将减毒ST必需基因置于缺氧条件启动子下，使减毒ST只在乏氧的肿瘤组织中表达，同时迅速从正常组织中消除，以实现从正常组织中快速清除细菌，不会像减毒方法那样损害细菌的其他功能或肿瘤适应性，减少正常组织中的细菌负荷并增加肿瘤靶向特异性[31]。其三，通过肿瘤内感染途径，使大剂量ST绕过全身感染遇到的先天免疫杀伤，直接靶向肿瘤细胞[61]。其四，利用纳米银颗粒（silver nanoparticles，AgNPs）提高ST的有效性和生物安全性，靶向肿瘤的AgNPs可以在完全根除肿瘤后清除残留减毒ST以减少副作用[62]。
3.2 中性粒细胞和细胞自噬的肃清作用
中性粒细胞的免疫作用和细胞自噬不仅能针对肿瘤细胞发挥抗肿瘤作用，还能肃清进入肿瘤组织的减毒ST。Tian等[63]认为减毒菌进入人体后，肿瘤细胞和固有免疫产生的巨噬细胞可通过TLR信号传导产生趋化因子，促进中性粒细胞向肿瘤募集，中性粒细胞发挥的免疫作用虽然能在一定程度上杀死肿瘤细胞，但是肿瘤浸润性中性粒细胞也会抑制坏死区的细菌，并抑制细菌迁移到存活的癌细胞区，减弱细菌的抗癌活性[64]，所以，减毒ST的ΔppGpp菌株介导的基因治疗具有稳健的短期抗癌效果，但不能预防后续肿瘤复发和转移，在最初细菌诱导的肿瘤缩小后开始重新生长[65]。中性粒细胞的募集降低了减毒ST的疗效和寿命，特异性削弱细菌介导的免疫治疗诱导的局部肿瘤浸润中性粒细胞募集的替代策略可能是一种更可行的治疗方法。减毒ST在临床前模型中抑制肿瘤生长，但其在人体中的作用有限，可能是因为细胞产生了自噬反应，从而破坏了治疗细菌。为了中和机体的这种保护性反应，可以将减毒ST与含有自噬抑制剂羟氯喹的长循环脂质体结合，以阻止减毒ST被细胞自噬作用破坏。碱化溶酶体等酸性囊泡，从而阻止被困在其中的减毒ST降解[66]。
3.3 蛋白酶灭活功能蛋白
蛋白酶可以干扰蛋白质加工、降解由减毒ST作为载体携带进入肿瘤组织的效应蛋白和分泌蛋白。解决该问题的最常用方法是使用一种或多种蛋白酶缺陷的细胞，但是在这一过程中，减毒ST在靶向肿瘤组织中定居的能力可能受到蛋白酶突变缺失影响而降低。其次是改造蛋白质以消除特异性蛋白酶切割位点，但是由于蛋白质结构-功能关系的限制，在其应用中可能具有局限性。最后，减毒ST可以作为细菌载体，通过携带蛋白酶抑制剂来有效克服蛋白酶，而且部分减毒ST菌株在将某些蛋白酶抑制剂递送到肿瘤组织过程中可能会产生诱导肿瘤细胞凋亡的附加作用[66]。
4 总结与展望
综上所述，减毒ST可在抑制原发肿瘤生长和继发肿瘤转移中发挥重要作用。然而，要想应用于临床，如何在保证减毒ST安全性的同时保障其抗肿瘤活性，是亟需解决的一大难题，除增强减毒ST的靶向性以降低菌株的减毒必要性、逃避中性粒细胞和细胞自噬对ST的肃清作用和避免蛋白酶对起抗肿瘤作用的功能蛋白的降解外，尚需大量的临床试验和临床前试验去探索。这一问题的解决将为肿瘤患者精准治疗提供一个新的治疗选择。
重要声明
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