引用本文： 贵诗雨, 黄丹, 朱佳琳, 周小雨, 郭文恺, 方向. 基于腹膜组织病理探讨腹外疝完全腹膜外腹膜前间隙补片修补术对腹膜的影响. 中国普外基础与临床杂志, 2023, 30(8): 919-925. doi: 10.7507/1007-9424.202304025 复制
腹外疝是腹腔脏器在腹内压的作用下经过腹壁薄弱处突出体表所致，临床表现为牵拉痛、可回纳的腹壁包块[1-2]。腹壁强度减弱如手术切口、外伤、炎症、切断腹壁神经、肌肉退化萎缩以及胶原代谢异常，或者腹内压增加如咳嗽、便秘、晚期妊娠、腹水、排尿困难、婴儿过度嚎哭、呕吐、腹内肿瘤等因素均可导致腹外疝的发生[3]。腹外疝诊断一旦明确，首选手术治疗。作为无张力疝修补术方案之一的完全腹膜外腹膜前间隙无张力补片修补术具有手术时间短、复发率低、术后疼痛轻、愈合快等优点，目前在临床中得到了广泛的应用[4]。但是肠粘连、肠穿孔等是完全腹膜外腹膜前间隙补片修补术的严重并发症，这可能是该手术对腹膜的不同程度损伤所致[5-6]，但目前国内外并无研究明确进行该手术时对腹膜前间隙的广泛游离及补片的植入是否会导致腹膜的缺血坏死以及对腹膜功能有所影响。故本研究拟在切口疝完全腹膜外腹膜前间隙补片修补术动物模型中观察采用该手术修补前后腹膜的病理改变情况，以明确该手术中对腹膜前间隙的广泛游离是否会造成腹膜的缺血坏死并影响腹膜功能，以期加强对腹外疝术后并发症的预防，为临床治疗方案选择提供新思路。
1 材料与方法
1.1 实验对象
本研究选取80只SD大鼠，其中体质量220 g左右的雄性大鼠40只，200 g左右的雌性大鼠40只，均购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。所有大鼠用耳钉予以标记，清洁环境（20～25 ℃），自由饮水，普通饮食。本研究获得四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所福利伦理委员会批准，实验过程中动物的处理遵守伦理要求。
1.2 试剂和仪器
1.2.1 试剂
磷酸二氢钠（批号为20200507，规格为500 g/瓶）和磷酸氢二钠（批号为20210220，规格为500 g/瓶）均购自福晨（天津）化学试剂有限公司。甲醛（批号为2021033101，规格500 mL）购自成都市科隆化学有限公司。无水乙醇（分析纯级，批号为GB678-90，规格为2.5 L/桶）购自成都海兴化工试剂厂。苏木精（hematoxylin，H）染液（批号为CR2102133，规格为500 mL/瓶）和伊红（eosin，E）染液（批号为CR2101094，规格为500 mL/瓶）均购自武汉塞维尔生物科技有限公司。盐酸-乙醇分化液：盐酸（分析纯级，批号为200630，规格为500 mL/瓶）购自成都西陇科学有限公司；中性树胶（批号为70050050，规格为100 g/瓶）购自Biosharp生物公司。
1.2.2 仪器
JT-12S自动组织脱水机购自武汉俊杰电子有限公司；BMJ-A型包埋机购自常州郊区中威电子仪器厂；RS36型全自动染色机购自常州派斯杰医疗设备有限公司；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪购自常州市中威电子仪器有限公司；Pannoramic 250数字切片扫描仪购自匈牙利3D Histech公司。
1.3 实验动物分组及处理
本研究实验动物分为空白对照组、补片植入空白对照组、疝模型对照组及疝模型补片修补组。所有大鼠在实验开始前无干扰适应性饲养1周。
1.3.1 空白对照组
采用简单随机抽样方法（下同）选取8只SD大鼠（雌雄各半），予以舒泰®50（50 mg/kg）肌肉注射麻醉[6]，麻醉完成（大鼠呼吸心跳存在、痛觉刺激消失以及角膜反射消失代表麻醉完成[7]）后，大鼠置于恒温（37 ℃）加热台上，用胶带仰卧位固定四肢于泡沫板上，暴露手术部位，聚维酮碘消毒3次后，从剑突下约4 cm沿腹中线切开皮肤，分离皮下组织，从腹中线左侧约1 cm处开始切开肌肉，取下一块约3 cm×2 cm大小的整块腹壁组织，于组织液中固定，取完组织后予以安乐死。
1.3.2 补片植入空白对照组
随机选取32只SD大鼠（雌雄各半），麻醉、消毒完成后，从剑突下约4 cm处沿腹中线作一约4 cm切口，逐层分离至肌肉层，沿腹中线左侧约0.1 cm处切开腹直肌前鞘，逐层分离腹直肌、腹直肌后鞘，游离腹膜前间隙至周边的肌肉鞘膜，暴露左侧腹膜约3.0 cm×0.6 cm大小，采用同左侧的方法暴露右侧腹膜约3.0 cm×0.6 cm大小，放入合适大小的补片 ［因游离腹膜前间隙时会至两侧肌肉鞘膜，故植入的补片（北京天助畅运医疗技术股份有限公司）会大于游离的腹膜前间隙面积，约3 cm×2 cm大小］，用可吸收线连续缝合肌肉、筋膜、皮下组织，不可吸收线间断缝合皮肤。补片植入手术完成后，予以5万U/只青霉素（连续3 d，肌肉注射）预防感染[8]（中国广州白云天鑫药业有限公司）和酒石酸布托诺啡（0.02 mg/只，肌肉注射）控制术后疼痛（江苏恒瑞医药股份有限公司）。每只大鼠的手术时间控制在10 min内。最后分别于补片植入手术完成后的第1、4、8、12周时取手术切口旁3 cm×2 cm大小的整块腹壁组织，于组织液中固定，每个时间点随机抽取8只大鼠（雌雄各半）。取完组织后所有大鼠于相应时间点予以安乐死。
1.3.3 疝模型对照组及疝模型补片修补组
剩余40只雌雄各半的SD大鼠用于构建疝模型。所有大鼠麻醉完成后，游离左侧腹膜前间隙方法与补片植入空白对照组相同，暴露左侧腹膜约3.0 cm×0.6 cm大小，切除上方肌肉，充分止血，缝合皮肤。每只大鼠的造模过程控制在10 min内完成。然后无干扰饲养后第2周时40只大鼠切口疝造模均成功。① 随机选取8只作为疝模型对照组，取手术切口左侧约1 cm×3 cm大小的整块腹壁组织，于组织液中固定。② 其余32只大鼠从原切口切开皮肤，分离疝囊与皮肤、周围肌肉，游离腹膜前间隙至周围肌肉鞘膜，腹膜前间隙（包括疝囊）约3.0 cm×1.2 cm大小（宽为腹中线左右各0.6 cm），放入合适大小（约3 cm×2 cm大小）补片后，后续处理过程同补片植入空白对照组。然后分别于疝修补手术完成后的第1、4、8、12周时取手术切口旁约3 cm×2 cm大小的整块腹壁组织后于组织液中固定，每个时间点随机抽取8只大鼠（雌雄各半）。取完组织后所有大鼠予以安乐死。
1.4 观察小鼠腹膜组织病理形态变化及判断标准
所有组织标本按照病理检验标准操作流程进行操作：10%甲醛固定、石蜡包埋、切成5 μm厚切片（腹壁组织纵切：包括腹膜、补片、肌肉），染色、封片等，最后采用匈牙利3D Histech公司的Pannoramic 250数字切片扫描仪对切片进行图像采集，每张切片先于40倍镜下观察全部组织的大体病变，选择要观察的区域采集50倍和200倍图片，采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察小鼠腹膜组织的病理形态，同时比较各组腹膜组织的炎细胞浸润程度和纤维化增生程度。炎细胞浸润程度和纤维化增生程度判断标准参照文献[9-10]：组织没有病变，记为“（–）”；组织的变化几乎未超过正常范围内的变化即最低限度的变化，记为“（+）”；组织病变易于识别，但严重程度有限，组织病变可能不会产生任何功能障碍，病变组织面积的范围占观察区域的11%～20% ，记为“（++）”；组织病变突出，很有可能向严重性发展，可能产生有限度的组织或器官功能障碍，21%～40%的观察区域组织受累，记为“（+++）”；组织病变程度严重且已形成完全性病变，预期会产生明显的组织或器官功能障碍，病变涉及 41%～100%的观察区域组织范围，记为“（++++）”。本研究中将组织病理改变程度（–）定义为“无”，（+）定义为“轻度”，（++）定义为“中度”，（+++）和（++++）定义为“重度”，共4个等级。
1.5 统计学方法
用IBM SPSS 26.0软件对数据进行统计。2组间的等级资料比较采用Wilcoxon Mann-Whitney秩和检验；多组间的等级资料比较使用Kruskal-Wallis秩和检验，检验水准α=0.05。若多组比较有统计学意义，再使用SPSS的Bonferroni法进行事后多重比较（事后多重比较所得的P值为乘以比较次数后的P值）。
2 结果
2.1 各组腹膜组织的病理变化
空白对照组的腹膜间皮细胞呈单层扁平上皮排列，整齐、结构完整、清晰，间皮下结缔组织紧贴肌束膜，未见病理反应（图1a）。
图1
示各组SD大鼠腹膜组织病理变化（HE染色 ×200）
a、b：分别为空白对照组（a）和疝模型对照组（b）的腹膜组织改变（红箭示腹膜间皮细胞，绿箭示受损肌肉细胞）；c、d：分别为术后第1周时补片植入空白对照组（c）和疝模型补片修补组（d）的腹膜组织改变（红箭示腹膜间皮细胞，绿箭示肌肉变性坏死，黑箭示血管，蓝箭示淋巴细胞，橙箭示中性粒细胞）；e、f：分别为术后第4周时补片植入空白对照组（e）和疝模型补片修补组（f）的腹膜组织改变（红箭示腹膜间皮细胞，绿箭示肌肉变性坏死，黑箭示血管，蓝箭示淋巴细胞， 橙箭示中性粒细胞，黄箭示成纤维细胞）；g、h：分别为术后第8周时补片植入空白对照组（g）和疝模型补片修补组（h）的腹膜组织改变（红箭示腹膜间皮细胞，绿箭示纤维组织增生，黑箭示血管，蓝箭示淋巴细胞，橙箭示中性粒细胞，黄箭示成纤维细胞）；i、j：分别为术后第12周时补片植入空白对照组（i）和疝模型补片修补组（j）的腹膜组织改变（红箭示腹膜间皮细胞，绿箭示纤维组织增生，黑箭示血管，蓝箭示淋巴细胞，橙箭示中性粒细胞，黄箭示肥大细胞，紫箭示含铁血黄素沉积）
疝模型对照组的腹膜组织呈单层扁平上皮排列，较为整齐，间皮下结缔组织坏死区域可见大量纤维组织增生伴细胞浸润（图1b）。
补片植入空白对照组及疝模型补片修补组的腹膜组织病理变化：术后第1周时，腹膜的间皮结构结构不清、排列错乱甚至基本不见；腹膜下肌肉组织大面积坏死，补片周围及坏死区域内可见大量纤维组织增生伴炎细胞浸润，部分区域的纤维组织较为致密、红染，可见增生纤维组织大面积取代原有肌肉组织，淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞、成纤维细胞及新生血管聚集（图1c、1d）；术后第4周时，腹膜的间皮细胞结构较为清晰，间皮下、补片周围纤维组织增生较为明显，增生区域不同程度炎细胞浸润，见淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞及成纤维细胞及新生血管聚集，部分巨噬细胞胞质内可见棕黄色含铁血黄素沉积（图1e、1f）；术后第8周时，腹膜的间皮细胞结构较为清晰，间皮下、补片周围纤维组织增生较为明显，增生区域轻微或轻度炎细胞浸润（图1g、1h）；术后第12周时，腹膜的间皮细胞结构较为清晰，间皮下、补片周围纤维组织增生较为明显，增生区域轻微或轻度炎细胞浸润（图1i、1j）。
2.2 各组腹膜组织的炎细胞浸润程度变化
结果见表1。① 空白对照组与补片植入空白对照组各时间点亚组大鼠的腹膜组织的炎细胞浸润程度整体比较差异有统计学意义（H=19.724、P＜0.001），进一步比较发现，补片植入空白对照组术后第1和4周时较空白对照组加重（P＜0.001、P=0.005），而术后第8和12周时与空白对照组比较差异无统计学意义（P=0.117，P=0.052）；补片植入空白对照组术后第4周与术后第1周比较差异无统计学意义（P=0.363），术后第8周时较术后第1周时明显减轻（P=0.021），术后第12周时与术后第1周比较差异无统计学意义（P=0.051）。② 空白对照组、疝模型对照组及疝模型补片修补组各时间点亚组大鼠的腹膜组织的炎细胞浸润程度整体比较差异有统计学意义（H=22.843、P＜0.001）。进一步比较发现，疝模型对照组与空白对照组比较差异无统计学意义（P=0.102）；疝模型补片修补组术后第1周时较疝模型对照组加重明显（P=0.014），术后第4、8、12周时与疝模型对照组比较变化不明显（P值分别为1.000、1.000、1.000）；疝模型补片修补组术后第4周与术后第1周比较差异无统计学意义（P=0.102）；术后第8和12周时较术后第1周减轻（P=0.040、P=0.040）。③ 相同时间点时补片植入空白对照组与疝模型补片修补组间比较差异均无统计学意义（Z值分别为1.000、0.236、1.118、0.522，P值分别为0.317、0.814、0.264、0.602）。
表1
各组腹膜组织的炎细胞浸润程度与纤维化增生程度（只）
2.3 各组腹膜组织的纤维增生程度变化
结果见表1。① 空白对照组与补片植入空白对照组各时间点亚组大鼠腹膜组织的纤维化增生程度变化整体比较差异有统计学意义（H=18.685、P＜0.001）。进一步比较发现，补片植入空白对照组术后第1、4、12周时较空白对照组明显加重（P＜0.001、P=0.003、P=0.043），术后第8周时较空白对照组变化不明显（P=0.204）；补片植入空白对照组术后第4、8及12周时较术后第1周时减轻（P=0.017），尤其是第8周时。② 空白对照组、疝模型对照组及疝模型补片修补组各时间点亚组大鼠腹膜组织的纤维化增生程度变化整体比较差异有统计学意义（H=17.485、P＜0.001）。进一步比较发现，疝模型对照组较空白对照组明显加重（P=0.012）；疝模型补片修补组术后第1、4、8、12周时与疝模型对照组比较差异未见有统计学意义（P值分别为0.524、1.000、1.000、1.000）；疝模型补片修补组术后第4、8、12周时与术后第1周比较比较差异未见有统计学意义（P值分别为1.000、0.055、0.056）。③ 相同时间点补片植入空白对照组与疝模型补片修补组间比较差异均无统计学意义（Z值分别为0.000、0.540、0.185、0.488，P值分别为1.000、0.589、0.854、0.626）。
3 讨论
腹外疝根据其发生机制，除了部分婴儿可自行痊愈外，外科手术是它能被治愈的唯一方式。目前无张力疝修补术是腹外疝治疗的首选手术方式，根据补片放置层次不同，可分为肌鞘前的Onlay修补法、肌肉间的Inlay修补法、肌后和腹膜前的Sublay修补法、腹腔内补片植入修补法[11]。其中因腹膜前间隙是壁层腹膜和腹横筋膜层之间的一层无血管和神经的脂肪结缔组织间隙[12]，将补片植入腹膜前间隙，补片不与腹腔脏器直接接触，同时能达到疝囊“超高位”结扎，是目前常用的手术方式之一。根据手术入路的不同，目前常见的手术方式可分为经腹腹膜前和完全腹膜外[13]，其中后者所有手术操作均在腹膜前间隙中操作，不进入腹腔，不切开腹膜，不与腹腔脏器直接接触，能明显减少腹腔粘连等并发症发生。但大量研究[14-18]证明，完全腹膜外腹膜前间隙补片修补术后可能发生肠粘连、肠穿孔等并发症，可能的原因是，完全腹膜外腹膜前间隙补片修补术中对腹膜的广泛游离及补片的植入导致腹膜的不同程度损伤所致。但目前国内外对完全腹膜外腹膜前间隙补片修补手术中对腹膜前间隙的广泛游离及补片的植入是否会导致腹膜的缺血坏死及对其功能有所影响的相关研究较少。基于此背景，本研究通过建立腹外疝完全腹膜外腹膜前间隙补片修补术动物模型，以观察完全腹膜外腹膜前间隙补片疝修补术前与术后腹膜的病理改变情况，明确完全腹膜外腹膜前间隙补片修补术中对腹膜前间隙的广泛游离是否会造成腹膜的缺血坏死并影响其功能，以期加强对腹外疝术后并发症的预防，为临床探索治疗方案提供新思路。本研究通过动物实验，从完全腹膜外腹膜前间隙补片修补手术后腹膜组织炎细胞浸润和腹膜组织纤维化改变角度分析它是否会导致腹膜的缺血坏死以及对腹膜功能有所影响。
3.1 腹膜组织炎细胞浸润变化情况
本研究中结果未发现疝模型对照组的腹膜组织炎细胞浸润程度与空白对照组比较有统计学意义上的差异（P＞0.05），此结论提示，创伤所产生的炎细胞浸润在术后2周即可被机体修复至正常状态，并且疝不会刺激腹膜组织发生炎细胞浸润，文君等[19]报道的伤口愈合过程中的炎症期主要发生在术后1周的结论可对此进行佐证。
本研究中结果发现，补片植入空白对照组术后第1和4周时即可发现腹膜组织中炎细胞浸润程度较空白对照组明显加重（P＜0.05），但在术后第8和12周时即与空白对照组比较未见差异有统计学意义（P＞0.05），此结果提示，广泛游离腹膜前间隙以及补片植入可造成腹膜的机械性损伤[20]，其原因是，腹膜损伤可引起巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞和单核细胞的激活，并且激活的炎细胞通过Toll样受体识别细菌病原体或异物，分泌大量炎症细胞因子，促进腹膜组织发生急性炎症反应[21]，此炎症反应可持续4～8周；然而当腹膜受到损伤后，不论腹膜缺损大小，间皮细胞的完整性被破坏后间皮细胞的再生在损伤后24 h内即可发生，通过愈合的双峰机制使腹膜再间皮化[18]。经过机体修复，腹膜的分泌功能在术后第8周时可完全恢复，间皮细胞分泌的透明质酸可抑制血浆酶原激活，从而减少炎细胞浸润[22-23]。此原因分析也可以解释本研究中疝模型补片修补组术后随着时间变化的结果，如疝模型补片修补组术后第 8、12周时腹膜组织中炎细胞浸润程度较术后第 1 周时明显减轻。
此外，本研究未发现补片修补术后各时间点时补片植入空白对照组与疝模型补片修补组间在腹膜组织炎细胞浸润程度上差异有统计学意义（P＞0.05），此结果同样提示，疝本身不会刺激腹膜组织发生炎细胞浸润。
3.2 腹膜组织纤维化变化情况
慢性炎症可导致腹膜组织发生纤维化[24]。将补片植入腹膜前间隙是否会刺激腹膜组织发生纤维化，本研究对此进行了分析。本研究中发现，疝模型对照组腹膜组织纤维化程度较空白对照组明显加重（P＜0.05），此结果提示，疝构建模型过程中的手术创伤可能刺激腹膜组织纤维化增生。
本研究从另外角度观察发现，补片植入空白对照组术后第1、4、12周时腹膜组织纤维增生程度较空白对照组明显加重（P＜0.05），而在术后第8周时未见与空白对照组比较有统计学意义的差异（P>0.05），且还发现补片植入空白对照组术后第4、8及12周时较术后第1周时减轻（尤其是第8周时），此结果提示，广泛腹膜前间隙游离以及补片的植入可造成腹膜的机械性损伤[20]，而腹膜损伤引起的巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞和单核细胞的激活是响应外部信号纤维化介质的主要来源[25]，一旦这些免疫细胞被激活，可进一步激活固有成纤维细胞（称为“肌成纤维细胞”），这些肌成纤维细胞可分泌大量的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原，从而参与局部组织的重建和改建[26]。在广泛游离腹膜前间隙以及植入补片时造成的腹膜损伤可刺激机体腹膜组织在术后第1、4、12周时产生大量的纤维组织，而在术后第8周时出现一过性降低，分析其原因，前期（术后第1、4周）腹膜组织纤维增生程度高可能是因为腹膜损伤后，成纤维细胞大量增殖、迁移至受损组织并分化为肌成纤维细胞，合成并分泌细胞外基质来促进伤口组织的修复[27]；而在后期（术后第12周）腹膜组织纤维增生程度再度升高可能是因为局部补片的异物刺激局部腹膜组织发生慢性炎症反应并纤维化，从而形成瘢痕组织包裹补片；在术后第8周时出现一过性降低，其原因可能是，腹膜损伤后，经过机体的自身修复，腹膜功能完全恢复正常，然后它分泌的透明质酸可抑制血浆酶原激活，从而减少纤维素渗出[22-23]。
此外，在本研究中未发现补片修补术后各时间点时补片植入空白对照组与疝模型补片修补组间在腹膜组织纤维增生程度上差异有统计学意义（P＞0.05），此结果提示，疝病本身的存在不会刺激腹膜组织纤维化增生，而手术过程中的创伤会刺激腹膜组织纤维化增生。
总之，从本研究的大鼠实验结果看，疝本身不会刺激腹膜组织发生炎细胞浸润和纤维化增生，然而在行完全腹膜外腹膜前间隙补片修补过程中，广泛的腹膜前间隙游离以及补片的植入操作会造成腹膜的损伤并影响其功能，但通过机体自身的修复，对腹膜损伤的功能影响在术后第8周时基本可完全恢复至正常。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：贵诗雨和黄丹负责酝酿和设计实验、实施研究、采集数据、统计学分析以及撰写文章；方向负责酝酿和设计实验、获取研究经费、技术和材料支持，对文章的知识性内容作批评性审阅；朱佳琳、周小雨和郭文恺负责酝酿和设计实验、实施研究及采集数据。
伦理声明：本研究通过四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所福利伦理委员会审批通过（批文编号：伦审2022第006号），并且获得动物许可证 ［动物许可证号：SYXK（川）2018-058］。
腹外疝是腹腔脏器在腹内压的作用下经过腹壁薄弱处突出体表所致，临床表现为牵拉痛、可回纳的腹壁包块[1-2]。腹壁强度减弱如手术切口、外伤、炎症、切断腹壁神经、肌肉退化萎缩以及胶原代谢异常，或者腹内压增加如咳嗽、便秘、晚期妊娠、腹水、排尿困难、婴儿过度嚎哭、呕吐、腹内肿瘤等因素均可导致腹外疝的发生[3]。腹外疝诊断一旦明确，首选手术治疗。作为无张力疝修补术方案之一的完全腹膜外腹膜前间隙无张力补片修补术具有手术时间短、复发率低、术后疼痛轻、愈合快等优点，目前在临床中得到了广泛的应用[4]。但是肠粘连、肠穿孔等是完全腹膜外腹膜前间隙补片修补术的严重并发症，这可能是该手术对腹膜的不同程度损伤所致[5-6]，但目前国内外并无研究明确进行该手术时对腹膜前间隙的广泛游离及补片的植入是否会导致腹膜的缺血坏死以及对腹膜功能有所影响。故本研究拟在切口疝完全腹膜外腹膜前间隙补片修补术动物模型中观察采用该手术修补前后腹膜的病理改变情况，以明确该手术中对腹膜前间隙的广泛游离是否会造成腹膜的缺血坏死并影响腹膜功能，以期加强对腹外疝术后并发症的预防，为临床治疗方案选择提供新思路。
1 材料与方法
1.1 实验对象
本研究选取80只SD大鼠，其中体质量220 g左右的雄性大鼠40只，200 g左右的雌性大鼠40只，均购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。所有大鼠用耳钉予以标记，清洁环境（20～25 ℃），自由饮水，普通饮食。本研究获得四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所福利伦理委员会批准，实验过程中动物的处理遵守伦理要求。
1.2 试剂和仪器
1.2.1 试剂
磷酸二氢钠（批号为20200507，规格为500 g/瓶）和磷酸氢二钠（批号为20210220，规格为500 g/瓶）均购自福晨（天津）化学试剂有限公司。甲醛（批号为2021033101，规格500 mL）购自成都市科隆化学有限公司。无水乙醇（分析纯级，批号为GB678-90，规格为2.5 L/桶）购自成都海兴化工试剂厂。苏木精（hematoxylin，H）染液（批号为CR2102133，规格为500 mL/瓶）和伊红（eosin，E）染液（批号为CR2101094，规格为500 mL/瓶）均购自武汉塞维尔生物科技有限公司。盐酸-乙醇分化液：盐酸（分析纯级，批号为200630，规格为500 mL/瓶）购自成都西陇科学有限公司；中性树胶（批号为70050050，规格为100 g/瓶）购自Biosharp生物公司。
1.2.2 仪器
JT-12S自动组织脱水机购自武汉俊杰电子有限公司；BMJ-A型包埋机购自常州郊区中威电子仪器厂；RS36型全自动染色机购自常州派斯杰医疗设备有限公司；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪购自常州市中威电子仪器有限公司；Pannoramic 250数字切片扫描仪购自匈牙利3D Histech公司。
1.3 实验动物分组及处理
本研究实验动物分为空白对照组、补片植入空白对照组、疝模型对照组及疝模型补片修补组。所有大鼠在实验开始前无干扰适应性饲养1周。
1.3.1 空白对照组
采用简单随机抽样方法（下同）选取8只SD大鼠（雌雄各半），予以舒泰®50（50 mg/kg）肌肉注射麻醉[6]，麻醉完成（大鼠呼吸心跳存在、痛觉刺激消失以及角膜反射消失代表麻醉完成[7]）后，大鼠置于恒温（37 ℃）加热台上，用胶带仰卧位固定四肢于泡沫板上，暴露手术部位，聚维酮碘消毒3次后，从剑突下约4 cm沿腹中线切开皮肤，分离皮下组织，从腹中线左侧约1 cm处开始切开肌肉，取下一块约3 cm×2 cm大小的整块腹壁组织，于组织液中固定，取完组织后予以安乐死。
1.3.2 补片植入空白对照组
随机选取32只SD大鼠（雌雄各半），麻醉、消毒完成后，从剑突下约4 cm处沿腹中线作一约4 cm切口，逐层分离至肌肉层，沿腹中线左侧约0.1 cm处切开腹直肌前鞘，逐层分离腹直肌、腹直肌后鞘，游离腹膜前间隙至周边的肌肉鞘膜，暴露左侧腹膜约3.0 cm×0.6 cm大小，采用同左侧的方法暴露右侧腹膜约3.0 cm×0.6 cm大小，放入合适大小的补片 ［因游离腹膜前间隙时会至两侧肌肉鞘膜，故植入的补片（北京天助畅运医疗技术股份有限公司）会大于游离的腹膜前间隙面积，约3 cm×2 cm大小］，用可吸收线连续缝合肌肉、筋膜、皮下组织，不可吸收线间断缝合皮肤。补片植入手术完成后，予以5万U/只青霉素（连续3 d，肌肉注射）预防感染[8]（中国广州白云天鑫药业有限公司）和酒石酸布托诺啡（0.02 mg/只，肌肉注射）控制术后疼痛（江苏恒瑞医药股份有限公司）。每只大鼠的手术时间控制在10 min内。最后分别于补片植入手术完成后的第1、4、8、12周时取手术切口旁3 cm×2 cm大小的整块腹壁组织，于组织液中固定，每个时间点随机抽取8只大鼠（雌雄各半）。取完组织后所有大鼠于相应时间点予以安乐死。
1.3.3 疝模型对照组及疝模型补片修补组
剩余40只雌雄各半的SD大鼠用于构建疝模型。所有大鼠麻醉完成后，游离左侧腹膜前间隙方法与补片植入空白对照组相同，暴露左侧腹膜约3.0 cm×0.6 cm大小，切除上方肌肉，充分止血，缝合皮肤。每只大鼠的造模过程控制在10 min内完成。然后无干扰饲养后第2周时40只大鼠切口疝造模均成功。① 随机选取8只作为疝模型对照组，取手术切口左侧约1 cm×3 cm大小的整块腹壁组织，于组织液中固定。② 其余32只大鼠从原切口切开皮肤，分离疝囊与皮肤、周围肌肉，游离腹膜前间隙至周围肌肉鞘膜，腹膜前间隙（包括疝囊）约3.0 cm×1.2 cm大小（宽为腹中线左右各0.6 cm），放入合适大小（约3 cm×2 cm大小）补片后，后续处理过程同补片植入空白对照组。然后分别于疝修补手术完成后的第1、4、8、12周时取手术切口旁约3 cm×2 cm大小的整块腹壁组织后于组织液中固定，每个时间点随机抽取8只大鼠（雌雄各半）。取完组织后所有大鼠予以安乐死。
1.4 观察小鼠腹膜组织病理形态变化及判断标准
所有组织标本按照病理检验标准操作流程进行操作：10%甲醛固定、石蜡包埋、切成5 μm厚切片（腹壁组织纵切：包括腹膜、补片、肌肉），染色、封片等，最后采用匈牙利3D Histech公司的Pannoramic 250数字切片扫描仪对切片进行图像采集，每张切片先于40倍镜下观察全部组织的大体病变，选择要观察的区域采集50倍和200倍图片，采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察小鼠腹膜组织的病理形态，同时比较各组腹膜组织的炎细胞浸润程度和纤维化增生程度。炎细胞浸润程度和纤维化增生程度判断标准参照文献[9-10]：组织没有病变，记为“（–）”；组织的变化几乎未超过正常范围内的变化即最低限度的变化，记为“（+）”；组织病变易于识别，但严重程度有限，组织病变可能不会产生任何功能障碍，病变组织面积的范围占观察区域的11%～20% ，记为“（++）”；组织病变突出，很有可能向严重性发展，可能产生有限度的组织或器官功能障碍，21%～40%的观察区域组织受累，记为“（+++）”；组织病变程度严重且已形成完全性病变，预期会产生明显的组织或器官功能障碍，病变涉及 41%～100%的观察区域组织范围，记为“（++++）”。本研究中将组织病理改变程度（–）定义为“无”，（+）定义为“轻度”，（++）定义为“中度”，（+++）和（++++）定义为“重度”，共4个等级。
1.5 统计学方法
用IBM SPSS 26.0软件对数据进行统计。2组间的等级资料比较采用Wilcoxon Mann-Whitney秩和检验；多组间的等级资料比较使用Kruskal-Wallis秩和检验，检验水准α=0.05。若多组比较有统计学意义，再使用SPSS的Bonferroni法进行事后多重比较（事后多重比较所得的P值为乘以比较次数后的P值）。
2 结果
2.1 各组腹膜组织的病理变化
空白对照组的腹膜间皮细胞呈单层扁平上皮排列，整齐、结构完整、清晰，间皮下结缔组织紧贴肌束膜，未见病理反应（图1a）。
图1
示各组SD大鼠腹膜组织病理变化（HE染色 ×200）
a、b：分别为空白对照组（a）和疝模型对照组（b）的腹膜组织改变（红箭示腹膜间皮细胞，绿箭示受损肌肉细胞）；c、d：分别为术后第1周时补片植入空白对照组（c）和疝模型补片修补组（d）的腹膜组织改变（红箭示腹膜间皮细胞，绿箭示肌肉变性坏死，黑箭示血管，蓝箭示淋巴细胞，橙箭示中性粒细胞）；e、f：分别为术后第4周时补片植入空白对照组（e）和疝模型补片修补组（f）的腹膜组织改变（红箭示腹膜间皮细胞，绿箭示肌肉变性坏死，黑箭示血管，蓝箭示淋巴细胞， 橙箭示中性粒细胞，黄箭示成纤维细胞）；g、h：分别为术后第8周时补片植入空白对照组（g）和疝模型补片修补组（h）的腹膜组织改变（红箭示腹膜间皮细胞，绿箭示纤维组织增生，黑箭示血管，蓝箭示淋巴细胞，橙箭示中性粒细胞，黄箭示成纤维细胞）；i、j：分别为术后第12周时补片植入空白对照组（i）和疝模型补片修补组（j）的腹膜组织改变（红箭示腹膜间皮细胞，绿箭示纤维组织增生，黑箭示血管，蓝箭示淋巴细胞，橙箭示中性粒细胞，黄箭示肥大细胞，紫箭示含铁血黄素沉积）
疝模型对照组的腹膜组织呈单层扁平上皮排列，较为整齐，间皮下结缔组织坏死区域可见大量纤维组织增生伴细胞浸润（图1b）。
补片植入空白对照组及疝模型补片修补组的腹膜组织病理变化：术后第1周时，腹膜的间皮结构结构不清、排列错乱甚至基本不见；腹膜下肌肉组织大面积坏死，补片周围及坏死区域内可见大量纤维组织增生伴炎细胞浸润，部分区域的纤维组织较为致密、红染，可见增生纤维组织大面积取代原有肌肉组织，淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞、成纤维细胞及新生血管聚集（图1c、1d）；术后第4周时，腹膜的间皮细胞结构较为清晰，间皮下、补片周围纤维组织增生较为明显，增生区域不同程度炎细胞浸润，见淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞及成纤维细胞及新生血管聚集，部分巨噬细胞胞质内可见棕黄色含铁血黄素沉积（图1e、1f）；术后第8周时，腹膜的间皮细胞结构较为清晰，间皮下、补片周围纤维组织增生较为明显，增生区域轻微或轻度炎细胞浸润（图1g、1h）；术后第12周时，腹膜的间皮细胞结构较为清晰，间皮下、补片周围纤维组织增生较为明显，增生区域轻微或轻度炎细胞浸润（图1i、1j）。
2.2 各组腹膜组织的炎细胞浸润程度变化
结果见表1。① 空白对照组与补片植入空白对照组各时间点亚组大鼠的腹膜组织的炎细胞浸润程度整体比较差异有统计学意义（H=19.724、P＜0.001），进一步比较发现，补片植入空白对照组术后第1和4周时较空白对照组加重（P＜0.001、P=0.005），而术后第8和12周时与空白对照组比较差异无统计学意义（P=0.117，P=0.052）；补片植入空白对照组术后第4周与术后第1周比较差异无统计学意义（P=0.363），术后第8周时较术后第1周时明显减轻（P=0.021），术后第12周时与术后第1周比较差异无统计学意义（P=0.051）。② 空白对照组、疝模型对照组及疝模型补片修补组各时间点亚组大鼠的腹膜组织的炎细胞浸润程度整体比较差异有统计学意义（H=22.843、P＜0.001）。进一步比较发现，疝模型对照组与空白对照组比较差异无统计学意义（P=0.102）；疝模型补片修补组术后第1周时较疝模型对照组加重明显（P=0.014），术后第4、8、12周时与疝模型对照组比较变化不明显（P值分别为1.000、1.000、1.000）；疝模型补片修补组术后第4周与术后第1周比较差异无统计学意义（P=0.102）；术后第8和12周时较术后第1周减轻（P=0.040、P=0.040）。③ 相同时间点时补片植入空白对照组与疝模型补片修补组间比较差异均无统计学意义（Z值分别为1.000、0.236、1.118、0.522，P值分别为0.317、0.814、0.264、0.602）。
表1
各组腹膜组织的炎细胞浸润程度与纤维化增生程度（只）
2.3 各组腹膜组织的纤维增生程度变化
结果见表1。① 空白对照组与补片植入空白对照组各时间点亚组大鼠腹膜组织的纤维化增生程度变化整体比较差异有统计学意义（H=18.685、P＜0.001）。进一步比较发现，补片植入空白对照组术后第1、4、12周时较空白对照组明显加重（P＜0.001、P=0.003、P=0.043），术后第8周时较空白对照组变化不明显（P=0.204）；补片植入空白对照组术后第4、8及12周时较术后第1周时减轻（P=0.017），尤其是第8周时。② 空白对照组、疝模型对照组及疝模型补片修补组各时间点亚组大鼠腹膜组织的纤维化增生程度变化整体比较差异有统计学意义（H=17.485、P＜0.001）。进一步比较发现，疝模型对照组较空白对照组明显加重（P=0.012）；疝模型补片修补组术后第1、4、8、12周时与疝模型对照组比较差异未见有统计学意义（P值分别为0.524、1.000、1.000、1.000）；疝模型补片修补组术后第4、8、12周时与术后第1周比较比较差异未见有统计学意义（P值分别为1.000、0.055、0.056）。③ 相同时间点补片植入空白对照组与疝模型补片修补组间比较差异均无统计学意义（Z值分别为0.000、0.540、0.185、0.488，P值分别为1.000、0.589、0.854、0.626）。
3 讨论
腹外疝根据其发生机制，除了部分婴儿可自行痊愈外，外科手术是它能被治愈的唯一方式。目前无张力疝修补术是腹外疝治疗的首选手术方式，根据补片放置层次不同，可分为肌鞘前的Onlay修补法、肌肉间的Inlay修补法、肌后和腹膜前的Sublay修补法、腹腔内补片植入修补法[11]。其中因腹膜前间隙是壁层腹膜和腹横筋膜层之间的一层无血管和神经的脂肪结缔组织间隙[12]，将补片植入腹膜前间隙，补片不与腹腔脏器直接接触，同时能达到疝囊“超高位”结扎，是目前常用的手术方式之一。根据手术入路的不同，目前常见的手术方式可分为经腹腹膜前和完全腹膜外[13]，其中后者所有手术操作均在腹膜前间隙中操作，不进入腹腔，不切开腹膜，不与腹腔脏器直接接触，能明显减少腹腔粘连等并发症发生。但大量研究[14-18]证明，完全腹膜外腹膜前间隙补片修补术后可能发生肠粘连、肠穿孔等并发症，可能的原因是，完全腹膜外腹膜前间隙补片修补术中对腹膜的广泛游离及补片的植入导致腹膜的不同程度损伤所致。但目前国内外对完全腹膜外腹膜前间隙补片修补手术中对腹膜前间隙的广泛游离及补片的植入是否会导致腹膜的缺血坏死及对其功能有所影响的相关研究较少。基于此背景，本研究通过建立腹外疝完全腹膜外腹膜前间隙补片修补术动物模型，以观察完全腹膜外腹膜前间隙补片疝修补术前与术后腹膜的病理改变情况，明确完全腹膜外腹膜前间隙补片修补术中对腹膜前间隙的广泛游离是否会造成腹膜的缺血坏死并影响其功能，以期加强对腹外疝术后并发症的预防，为临床探索治疗方案提供新思路。本研究通过动物实验，从完全腹膜外腹膜前间隙补片修补手术后腹膜组织炎细胞浸润和腹膜组织纤维化改变角度分析它是否会导致腹膜的缺血坏死以及对腹膜功能有所影响。
3.1 腹膜组织炎细胞浸润变化情况
本研究中结果未发现疝模型对照组的腹膜组织炎细胞浸润程度与空白对照组比较有统计学意义上的差异（P＞0.05），此结论提示，创伤所产生的炎细胞浸润在术后2周即可被机体修复至正常状态，并且疝不会刺激腹膜组织发生炎细胞浸润，文君等[19]报道的伤口愈合过程中的炎症期主要发生在术后1周的结论可对此进行佐证。
本研究中结果发现，补片植入空白对照组术后第1和4周时即可发现腹膜组织中炎细胞浸润程度较空白对照组明显加重（P＜0.05），但在术后第8和12周时即与空白对照组比较未见差异有统计学意义（P＞0.05），此结果提示，广泛游离腹膜前间隙以及补片植入可造成腹膜的机械性损伤[20]，其原因是，腹膜损伤可引起巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞和单核细胞的激活，并且激活的炎细胞通过Toll样受体识别细菌病原体或异物，分泌大量炎症细胞因子，促进腹膜组织发生急性炎症反应[21]，此炎症反应可持续4～8周；然而当腹膜受到损伤后，不论腹膜缺损大小，间皮细胞的完整性被破坏后间皮细胞的再生在损伤后24 h内即可发生，通过愈合的双峰机制使腹膜再间皮化[18]。经过机体修复，腹膜的分泌功能在术后第8周时可完全恢复，间皮细胞分泌的透明质酸可抑制血浆酶原激活，从而减少炎细胞浸润[22-23]。此原因分析也可以解释本研究中疝模型补片修补组术后随着时间变化的结果，如疝模型补片修补组术后第 8、12周时腹膜组织中炎细胞浸润程度较术后第 1 周时明显减轻。
此外，本研究未发现补片修补术后各时间点时补片植入空白对照组与疝模型补片修补组间在腹膜组织炎细胞浸润程度上差异有统计学意义（P＞0.05），此结果同样提示，疝本身不会刺激腹膜组织发生炎细胞浸润。
3.2 腹膜组织纤维化变化情况
慢性炎症可导致腹膜组织发生纤维化[24]。将补片植入腹膜前间隙是否会刺激腹膜组织发生纤维化，本研究对此进行了分析。本研究中发现，疝模型对照组腹膜组织纤维化程度较空白对照组明显加重（P＜0.05），此结果提示，疝构建模型过程中的手术创伤可能刺激腹膜组织纤维化增生。
本研究从另外角度观察发现，补片植入空白对照组术后第1、4、12周时腹膜组织纤维增生程度较空白对照组明显加重（P＜0.05），而在术后第8周时未见与空白对照组比较有统计学意义的差异（P>0.05），且还发现补片植入空白对照组术后第4、8及12周时较术后第1周时减轻（尤其是第8周时），此结果提示，广泛腹膜前间隙游离以及补片的植入可造成腹膜的机械性损伤[20]，而腹膜损伤引起的巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞和单核细胞的激活是响应外部信号纤维化介质的主要来源[25]，一旦这些免疫细胞被激活，可进一步激活固有成纤维细胞（称为“肌成纤维细胞”），这些肌成纤维细胞可分泌大量的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原，从而参与局部组织的重建和改建[26]。在广泛游离腹膜前间隙以及植入补片时造成的腹膜损伤可刺激机体腹膜组织在术后第1、4、12周时产生大量的纤维组织，而在术后第8周时出现一过性降低，分析其原因，前期（术后第1、4周）腹膜组织纤维增生程度高可能是因为腹膜损伤后，成纤维细胞大量增殖、迁移至受损组织并分化为肌成纤维细胞，合成并分泌细胞外基质来促进伤口组织的修复[27]；而在后期（术后第12周）腹膜组织纤维增生程度再度升高可能是因为局部补片的异物刺激局部腹膜组织发生慢性炎症反应并纤维化，从而形成瘢痕组织包裹补片；在术后第8周时出现一过性降低，其原因可能是，腹膜损伤后，经过机体的自身修复，腹膜功能完全恢复正常，然后它分泌的透明质酸可抑制血浆酶原激活，从而减少纤维素渗出[22-23]。
此外，在本研究中未发现补片修补术后各时间点时补片植入空白对照组与疝模型补片修补组间在腹膜组织纤维增生程度上差异有统计学意义（P＞0.05），此结果提示，疝病本身的存在不会刺激腹膜组织纤维化增生，而手术过程中的创伤会刺激腹膜组织纤维化增生。
总之，从本研究的大鼠实验结果看，疝本身不会刺激腹膜组织发生炎细胞浸润和纤维化增生，然而在行完全腹膜外腹膜前间隙补片修补过程中，广泛的腹膜前间隙游离以及补片的植入操作会造成腹膜的损伤并影响其功能，但通过机体自身的修复，对腹膜损伤的功能影响在术后第8周时基本可完全恢复至正常。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：贵诗雨和黄丹负责酝酿和设计实验、实施研究、采集数据、统计学分析以及撰写文章；方向负责酝酿和设计实验、获取研究经费、技术和材料支持，对文章的知识性内容作批评性审阅；朱佳琳、周小雨和郭文恺负责酝酿和设计实验、实施研究及采集数据。
伦理声明：本研究通过四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所福利伦理委员会审批通过（批文编号：伦审2022第006号），并且获得动物许可证 ［动物许可证号：SYXK（川）2018-058］。
