引用本文： 李治仝, 孔祥琳, 刘冰熔, 刘丹, 王盟, 李德亮. 胃食管反流致大鼠食管良性狭窄动物模型的初步验证. 中国普外基础与临床杂志, 2024, 31(6): 690-694. doi: 10.7507/1007-9424.202309076 复制
胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）是比较常见的消化道疾病，所引起的食管疾病占所有食管疾病的75%[1-2]。长期的胃食管反流可以导致食管黏膜炎症、糜烂、溃疡和狭窄[3]。下食管括约肌功能缺失或丧失以及食管清除能力下降是导致胃食管反流的根本原因。胃内容物倒流引起食管固有层的炎症，在长期的慢性炎症反应过程中，损伤的程度可能超过固有层的再生能力，细胞凋亡，从而导致瘢痕组织形成，引起食管的狭窄[4]。临床中不管是质子泵抑制剂药物[5]、还是球囊扩张[6]，甚至抗反流手术[7]治疗反流引起的食管狭窄，都有很高的复发倾向。构建合适的疾病动物模型，对研究疾病的发病机制和治疗方法具有重要作用。 已经有各种研究模型包括慢性胃食管反流、食管炎、肠上皮化生、不典型增生和食管腺癌的发病机制已被广泛报道[8-9]。免疫介导的炎性细胞因子在动物实验中也被大量发现。在食管炎症动物模型和GERD患者的食管黏膜及和肌层中发现白细胞介素（interleukin，IL）-1β水平升高[10]。在GERD患者中形成的食管狭窄除了胃内容物的刺激外，免疫介导的炎性细胞因子也可能直接或者间接参与了引起食管黏膜的损伤、细胞凋亡和纤维化的发生[11-12]。所以关于胃酸、胃蛋白酶和炎症细胞因子在食管狭窄形成中各自的作用尚未被广泛接受。为了更科学的明确胃酸、胃蛋白酶和炎症细胞因子在食管良性狭窄形成中的作用机制，有必要建立稳定可靠的、不太复杂的动物模型。本研究旨在建立胃食管反流致食管狭窄的大鼠模型，以进一步探讨食管狭窄形成的机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物、设备及材料
本实验动物为30只远交（ Sprague-Dawley，SD）大鼠，4～6周龄，均为雄性，体质量（300±50）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，合格证书为SCXK（京）2019-0010号。用标准饲料和5%葡萄糖溶液喂养，饲养环境温度为25～27 ℃，湿度为40%～50%。所有动物实验的方案均得到了康泰医学检验服务河北有限公司实验动物伦理委员会的批准（批文编号：MDL20220111-01），并符合国际最高的人文关怀标准。盐酸-胃蛋白酶（货号：ZLI-9064）和磷酸缓冲盐溶液（货号：ZLI-9061）均购于中杉金桥公司；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）检测试剂盒（型号：SEA133Hu）、IL-1β检测试剂盒（型号：SEA124Hu）和IL-18检测试剂盒（型号：SEA073Hu）均购于武汉优尔生公司；正置荧光显微镜（型号：DM3000）购于德国Leica公司。
1.2 实验动物分组
30只SD大鼠采用随机数字表法随机分为3组：① 手术+酸灌注组（n=10），于胃食管连接处向近口侧纵向切开食管下括约肌肌层约1.5 cm长，切开膈肌左侧的食管裂孔，制备食管下括约肌松弛合并食管裂孔疝模型，然后再用1 mg/mL盐酸-胃蛋白酶（hydrochloric acid-pepsin，HCl-P）灌注食管；② 酸灌注组（n=10），直接用1 mg/mL HCl-P灌注食管；③ 对照组（n=10），用等量生理盐水灌注食管。根据文献 ［13］报道 的方法配制HCl-P灌注液，该灌注液是含有1 mg/mL胃蛋白酶的HCl溶液（pH＝1.0），其酸度与人胃液的酸度相近。加入胃蛋白酶是为了模拟消化过程中的胃内容物。
1.3 实验方法
手术+酸灌注组手术程序遵循适用于动物研究的技术标准和国际权利。SD大鼠术前禁食8 h，但可以随意进水。用10%盐酸氯胺酮（40 mg/kg，北京中山生物）和5%甲苯噻嗪（5 mg/kg，北京中山生物）通过腹部注射麻醉后，将动物仰卧至30° 抬头角的加热手术台以减少灌注液的回流，并固定。取腹正中5 cm长切口，进腹显露胃食管壁，于胃食管交界处向近口侧纵向切开食管下括约肌肌层约1.5 cm长的条状切口；随后向左侧切开食管裂孔处的膈肌扩大食管裂孔，长约1.5 cm，制备下食管括约肌松弛及食管裂孔疝模型。用0号尼龙缝线常规关闭腹部切口。大鼠麻醉清醒后先给予流质饮食喂食，术后第2天正常饮食，密切观察大鼠反应。出现食管和（或）胃穿孔和（或）出血的动物被排除在外。
待大鼠可以正常饮食后，再次用10%盐酸氯胺酮（40 mg/kg）和5%甲苯噻嗪（5 mg/kg）行腹部注射麻醉，麻醉以大鼠无明显抵抗即可，将麻醉后的大鼠平卧固定在动物板上，然后将头抬高成微角度（20°～30°），经口将5-F导管插入食管中下段，使用蠕动泵以0.3 mL/min的流速将配制好的HCL-P混合液经导管灌注，60 min/d；酸灌注组用同样方法直接等量灌注配制好的HCL-P混合液，对照组则用等量生理盐水灌注。灌注完毕后及时拔出灌注导管，让大鼠正常饮食。3组大鼠均连续灌注4周实验结束。
1.4 检测指标及方法
实验结束后处死大鼠，切除胃食管连接处以上（近口侧）1 cm长食管，或切除距食管狭窄上下0.5 cm范围的食管。观察食管直径并与正常食管直径进行比较；然后取0.5 cm长病变食管石蜡包埋组织，行全层8 μm切片经苏木精和伊红染色（MDL公司）后在正置荧光显微镜下观察食管黏膜损伤情况。剩余的食管组织标本使用磷酸缓冲盐溶液进行均质化，将匀浆在4 ℃下以 3 000 r/min 离心15 min（离心半径13.5 cm）。采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法检测上清液中TNF-α、IL-1β和IL-18的浓度。
对每只大鼠食管组织的2张切片进行编码，随后由不知情的观察者根据文献 ［14］ 报道的标准化损伤评分方法对食管黏膜损伤情况进行评分，该评分分别对上皮损伤、黏膜下水肿和炎症浸润的程度进行了分级（表1）。
表1
用于评估大鼠食管炎症变化的组织病理学评分标准[14]
1.5 统计学方法
使用SPSS 17.0和GraphPad Prism 5统计软件分析。用正态曲线直方图检验计量数据符合正态分布，用均数±标准差（
±s）表示，采用方差分析（ANOVA），两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 食管灌注后大鼠一般情况
手术+酸灌注组术后第1天死亡2只大鼠，酸灌注组和对照组大鼠均生存良好。灌注期间手术+酸灌注组和酸灌注组各有1只大鼠死亡。灌注4周后，手术+酸灌注组与酸灌注组大鼠进食量较灌注前明显减少，在手术+酸灌注组中3只大鼠出现呕吐、反食症状。与对照组大鼠的体质量 ［（371.10±18.98）g］ 比较，手术+酸灌注组 ［（343.00±16.68）g］ 和酸灌注组 ［（351.00±17.32）g］ 大鼠的体质量均下降，其差异有统计学意义（P=0.007，P=0.028），手术+酸灌注组大鼠的体质量低于酸灌注组大鼠，但差异无统计学意义（P=0.368）。手术+酸灌注组存活的7只大鼠中有2只形成食管良性狭窄，酸灌注组和对照组大鼠没有发生食管狭窄（图1）。
图1
示灌注4周后获取的食管组织，对照组大鼠食管未见狭窄（a），手术+酸灌注组大鼠食管直径变小（b）
2.2 食管灌注后食管组织中TNF-α、IL-1β和IL-18浓度检测结果
大鼠食管组织中TNF-α、IL-1β和IL-18的浓度手术+酸灌注组和酸灌注组均高于对照组（P＜0.001），手术+酸灌注组又高于酸灌注组（P＜0.001）。具体见图2。
图2
示食管灌注后食管组织中TNF-α（a）、IL-1β（b）和IL-18（c）检测结果
与对照组比较，*
2.3 食管灌注后食管黏膜损伤评分结果
在灌注4周后，对照组大鼠的食管黏膜未见明显的病理变化（图3a）；酸灌注组大鼠食管黏膜出现明显的炎症反应，见大量坏死组织，炎性细胞增多，基底细胞稍增生（图3b）；手术+酸灌注组除了食管黏膜出现明显的炎症反应外，同时观察到其基底细胞过度增殖、乳头肥大、上皮过度角化以及鳞状细胞扩张（图3c）。食管黏膜组织损伤评分对照组为（0.60±0.52）分，酸灌注组为（1.67±0.71）分，手术+酸灌注组为（2.57±0.53）分，酸灌注组和手术+酸灌注组均高于对照组（P<0.001），手术+酸灌注组又高于酸灌注组（P=0.014）。具体见图3d。
图3
示3组大鼠食管灌注后食管黏膜组织的病理改变（HE ×200）及食管黏膜损伤评分结果
a：为对照组的正常食管黏膜组织；b：为酸灌注组的食管黏膜组织病理改变，见大量坏死组织，炎性细胞增多，基底细胞稍增生； c：为手术+酸灌注组的食管黏膜组织病理改变，见明显的基底细胞增生、乳头肥大和上皮过度角化；d：为3组大鼠的食管黏膜损伤评分结果，与对照组比较，*
3 讨论
GERD是当今临床实践中最常见的问题之一，可导致食管黏膜溃疡、狭窄、柱状化生（巴雷特食管）和癌变[3, 15]。GERD的病理生理学复杂，涉及多种因素，如抗反流屏障功能障碍、胃排空障碍和食管防御机制异常。大多GERD动物模型是通过手术建立的，如食管下括约肌纵向切开或合并食管裂孔疝形成、幽门结扎、食管胃吻合术、食管空肠吻合术等[9, 16]。还有研究[17-18]通过导管或预埋微型泵在动物体内不断将外源性酸、胃蛋白酶或胆汁灌入食管，直接通过化学刺激损伤食管黏膜，短时间即可诱导食管黏膜溃疡和严重的食管炎。此类方法受灌注持续时间、灌注物及复杂的体内反流物的影响，单纯通过化学刺激损伤食管黏膜可引起食管炎的产生，但无法模拟人的胃食管反流性食管良性狭窄模型，且人反流性食管良性狭窄的产生是一涉及多方面因素的慢性过程，因为它需要相似的发病机制和充足的反流刺激时间。为研究胃食管反流性食管良性狭窄的发生机制，本研究以SD大鼠为研究对象分为3组构建食管狭窄模型：手术+酸灌注组，先行食管下括约肌离断和食管裂孔横切后形成下食管括约肌松弛合并食管裂孔疝的模型，再用HCl-P灌注；酸灌注组直接用HCl-P灌注；对照组则用生理盐水灌注。本研究结果显示：手术+酸灌注组与其他2组比较不但可引起更严重的食管炎性反应，还能造成部分大鼠食管狭窄。有研究[17-19]报道，在大鼠模型中连续往食管灌注胃肠反流物质可成功诱导出食管溃疡和严重食管炎，但在7 d和4周的实验过程中未诱导出食管狭窄。本研究结果提示：手术造成抗反流屏障减弱后再酸灌注比单纯的外源性灌酸或胆汁可引起更严重的食管损伤。 既往有食管裂孔疝、消化性溃疡疾病及大量饮酒可显著增加溃疡性食管狭窄风险的报道[20]。因此，食管下括约肌离断合并食管裂孔疝模型可加重HCl-P灌注诱导的食管病变，引起食管狭窄的形成。
体质量下降是胃食管反流动物模型常见的并发症。在Gaia Filho等[21]的研究中观察到接受食管下括约肌全肌切除术的大鼠体质量明显减轻，但与部分切除和对照组相比差异无统计学意义。在本研究中，观察到手术+酸灌注组与酸灌注组大鼠的体质量显著减轻，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05），以手术+酸灌注组体质量下降明显。这可能与反流和食管狭窄有关，食管狭窄的形成造成大鼠进食困难，体质量下降。本研究结果提示，该实验中使用的技术干扰了大鼠的营养状况，与另外两项研究[22-23]中观察到分布在不同组中的所有大鼠体质量均不同程度减轻结果相似。
炎症触发的食管狭窄不仅取决于损伤后的纤维增生，可能还取决于免疫介质如炎性细胞因子和趋化因子的作用[24]。在GERD患者的食管黏膜活检标本中检测到大量细胞因子和趋化因子增加，包括IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α和单核细胞趋化蛋-1[25-26]。本研究检测了3组大鼠食管组织中TNF-α、IL-1β和IL-18的浓度，结果显示手术+酸灌注组的TNF-α、IL-1β和IL-18的浓度高于其他2组（P＜0.001）。既往研究[27]表明，手术+酸灌注组食管组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度明显高于假手术+盐水灌注组。炎性细胞的浸润和活化可产生一系列细胞因子及炎性介质，从而激发组织内成纤维细胞的增殖、活化，分泌大量细胞外基质，最终导致纤维化及狭窄形成[28]。本研究中食管下括约肌离断和食管裂孔横切后再用HCl-P灌注食管更能体现胃食管反流的发病机制，进而诱导出食管狭窄。
本研究结果验证了抗反流屏障的缺失、HCl-P灌注和炎性细胞因子活化三者共同参与诱导食管病变，甚至造成食管狭窄。但仍存在以下局限性：一是诱导食管狭窄的成功率较低，缺乏大样本实验的随机对照；二是食管狭窄形成原因可能是多种因素相互作用的结果，本研究只验证了抗反流屏障缺失加HCl-P灌注诱导的食管狭窄，可能还有食管内定植细菌参与了食管狭窄的形成。另外，食管狭窄形成的分子机制不明确，需要我们进一步深入地研究。
重要声明
利益冲突声明： 所有作者声明不存在利益冲突。
作者贡献声明：所有作者都已阅读并批准了这篇文章的版本。这篇文章的任何部分都没有在其他地方发表。
伦理声明：本研究通过了康泰医学检验服务河北有限公司实验动物伦理委员会的审批，批文编号：MDL20220111-01。
胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）是比较常见的消化道疾病，所引起的食管疾病占所有食管疾病的75%[1-2]。长期的胃食管反流可以导致食管黏膜炎症、糜烂、溃疡和狭窄[3]。下食管括约肌功能缺失或丧失以及食管清除能力下降是导致胃食管反流的根本原因。胃内容物倒流引起食管固有层的炎症，在长期的慢性炎症反应过程中，损伤的程度可能超过固有层的再生能力，细胞凋亡，从而导致瘢痕组织形成，引起食管的狭窄[4]。临床中不管是质子泵抑制剂药物[5]、还是球囊扩张[6]，甚至抗反流手术[7]治疗反流引起的食管狭窄，都有很高的复发倾向。构建合适的疾病动物模型，对研究疾病的发病机制和治疗方法具有重要作用。 已经有各种研究模型包括慢性胃食管反流、食管炎、肠上皮化生、不典型增生和食管腺癌的发病机制已被广泛报道[8-9]。免疫介导的炎性细胞因子在动物实验中也被大量发现。在食管炎症动物模型和GERD患者的食管黏膜及和肌层中发现白细胞介素（interleukin，IL）-1β水平升高[10]。在GERD患者中形成的食管狭窄除了胃内容物的刺激外，免疫介导的炎性细胞因子也可能直接或者间接参与了引起食管黏膜的损伤、细胞凋亡和纤维化的发生[11-12]。所以关于胃酸、胃蛋白酶和炎症细胞因子在食管狭窄形成中各自的作用尚未被广泛接受。为了更科学的明确胃酸、胃蛋白酶和炎症细胞因子在食管良性狭窄形成中的作用机制，有必要建立稳定可靠的、不太复杂的动物模型。本研究旨在建立胃食管反流致食管狭窄的大鼠模型，以进一步探讨食管狭窄形成的机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物、设备及材料
本实验动物为30只远交（ Sprague-Dawley，SD）大鼠，4～6周龄，均为雄性，体质量（300±50）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，合格证书为SCXK（京）2019-0010号。用标准饲料和5%葡萄糖溶液喂养，饲养环境温度为25～27 ℃，湿度为40%～50%。所有动物实验的方案均得到了康泰医学检验服务河北有限公司实验动物伦理委员会的批准（批文编号：MDL20220111-01），并符合国际最高的人文关怀标准。盐酸-胃蛋白酶（货号：ZLI-9064）和磷酸缓冲盐溶液（货号：ZLI-9061）均购于中杉金桥公司；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）检测试剂盒（型号：SEA133Hu）、IL-1β检测试剂盒（型号：SEA124Hu）和IL-18检测试剂盒（型号：SEA073Hu）均购于武汉优尔生公司；正置荧光显微镜（型号：DM3000）购于德国Leica公司。
1.2 实验动物分组
30只SD大鼠采用随机数字表法随机分为3组：① 手术+酸灌注组（n=10），于胃食管连接处向近口侧纵向切开食管下括约肌肌层约1.5 cm长，切开膈肌左侧的食管裂孔，制备食管下括约肌松弛合并食管裂孔疝模型，然后再用1 mg/mL盐酸-胃蛋白酶（hydrochloric acid-pepsin，HCl-P）灌注食管；② 酸灌注组（n=10），直接用1 mg/mL HCl-P灌注食管；③ 对照组（n=10），用等量生理盐水灌注食管。根据文献 ［13］报道 的方法配制HCl-P灌注液，该灌注液是含有1 mg/mL胃蛋白酶的HCl溶液（pH＝1.0），其酸度与人胃液的酸度相近。加入胃蛋白酶是为了模拟消化过程中的胃内容物。
1.3 实验方法
手术+酸灌注组手术程序遵循适用于动物研究的技术标准和国际权利。SD大鼠术前禁食8 h，但可以随意进水。用10%盐酸氯胺酮（40 mg/kg，北京中山生物）和5%甲苯噻嗪（5 mg/kg，北京中山生物）通过腹部注射麻醉后，将动物仰卧至30° 抬头角的加热手术台以减少灌注液的回流，并固定。取腹正中5 cm长切口，进腹显露胃食管壁，于胃食管交界处向近口侧纵向切开食管下括约肌肌层约1.5 cm长的条状切口；随后向左侧切开食管裂孔处的膈肌扩大食管裂孔，长约1.5 cm，制备下食管括约肌松弛及食管裂孔疝模型。用0号尼龙缝线常规关闭腹部切口。大鼠麻醉清醒后先给予流质饮食喂食，术后第2天正常饮食，密切观察大鼠反应。出现食管和（或）胃穿孔和（或）出血的动物被排除在外。
待大鼠可以正常饮食后，再次用10%盐酸氯胺酮（40 mg/kg）和5%甲苯噻嗪（5 mg/kg）行腹部注射麻醉，麻醉以大鼠无明显抵抗即可，将麻醉后的大鼠平卧固定在动物板上，然后将头抬高成微角度（20°～30°），经口将5-F导管插入食管中下段，使用蠕动泵以0.3 mL/min的流速将配制好的HCL-P混合液经导管灌注，60 min/d；酸灌注组用同样方法直接等量灌注配制好的HCL-P混合液，对照组则用等量生理盐水灌注。灌注完毕后及时拔出灌注导管，让大鼠正常饮食。3组大鼠均连续灌注4周实验结束。
1.4 检测指标及方法
实验结束后处死大鼠，切除胃食管连接处以上（近口侧）1 cm长食管，或切除距食管狭窄上下0.5 cm范围的食管。观察食管直径并与正常食管直径进行比较；然后取0.5 cm长病变食管石蜡包埋组织，行全层8 μm切片经苏木精和伊红染色（MDL公司）后在正置荧光显微镜下观察食管黏膜损伤情况。剩余的食管组织标本使用磷酸缓冲盐溶液进行均质化，将匀浆在4 ℃下以 3 000 r/min 离心15 min（离心半径13.5 cm）。采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法检测上清液中TNF-α、IL-1β和IL-18的浓度。
对每只大鼠食管组织的2张切片进行编码，随后由不知情的观察者根据文献 ［14］ 报道的标准化损伤评分方法对食管黏膜损伤情况进行评分，该评分分别对上皮损伤、黏膜下水肿和炎症浸润的程度进行了分级（表1）。
表1
用于评估大鼠食管炎症变化的组织病理学评分标准[14]
1.5 统计学方法
使用SPSS 17.0和GraphPad Prism 5统计软件分析。用正态曲线直方图检验计量数据符合正态分布，用均数±标准差（±s）表示，采用方差分析（ANOVA），两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 食管灌注后大鼠一般情况
手术+酸灌注组术后第1天死亡2只大鼠，酸灌注组和对照组大鼠均生存良好。灌注期间手术+酸灌注组和酸灌注组各有1只大鼠死亡。灌注4周后，手术+酸灌注组与酸灌注组大鼠进食量较灌注前明显减少，在手术+酸灌注组中3只大鼠出现呕吐、反食症状。与对照组大鼠的体质量 ［（371.10±18.98）g］ 比较，手术+酸灌注组 ［（343.00±16.68）g］ 和酸灌注组 ［（351.00±17.32）g］ 大鼠的体质量均下降，其差异有统计学意义（P=0.007，P=0.028），手术+酸灌注组大鼠的体质量低于酸灌注组大鼠，但差异无统计学意义（P=0.368）。手术+酸灌注组存活的7只大鼠中有2只形成食管良性狭窄，酸灌注组和对照组大鼠没有发生食管狭窄（图1）。
图1
示灌注4周后获取的食管组织，对照组大鼠食管未见狭窄（a），手术+酸灌注组大鼠食管直径变小（b）
2.2 食管灌注后食管组织中TNF-α、IL-1β和IL-18浓度检测结果
大鼠食管组织中TNF-α、IL-1β和IL-18的浓度手术+酸灌注组和酸灌注组均高于对照组（P＜0.001），手术+酸灌注组又高于酸灌注组（P＜0.001）。具体见图2。
图2
示食管灌注后食管组织中TNF-α（a）、IL-1β（b）和IL-18（c）检测结果
与对照组比较，*
2.3 食管灌注后食管黏膜损伤评分结果
在灌注4周后，对照组大鼠的食管黏膜未见明显的病理变化（图3a）；酸灌注组大鼠食管黏膜出现明显的炎症反应，见大量坏死组织，炎性细胞增多，基底细胞稍增生（图3b）；手术+酸灌注组除了食管黏膜出现明显的炎症反应外，同时观察到其基底细胞过度增殖、乳头肥大、上皮过度角化以及鳞状细胞扩张（图3c）。食管黏膜组织损伤评分对照组为（0.60±0.52）分，酸灌注组为（1.67±0.71）分，手术+酸灌注组为（2.57±0.53）分，酸灌注组和手术+酸灌注组均高于对照组（P<0.001），手术+酸灌注组又高于酸灌注组（P=0.014）。具体见图3d。
图3
示3组大鼠食管灌注后食管黏膜组织的病理改变（HE ×200）及食管黏膜损伤评分结果
a：为对照组的正常食管黏膜组织；b：为酸灌注组的食管黏膜组织病理改变，见大量坏死组织，炎性细胞增多，基底细胞稍增生； c：为手术+酸灌注组的食管黏膜组织病理改变，见明显的基底细胞增生、乳头肥大和上皮过度角化；d：为3组大鼠的食管黏膜损伤评分结果，与对照组比较，*
3 讨论
GERD是当今临床实践中最常见的问题之一，可导致食管黏膜溃疡、狭窄、柱状化生（巴雷特食管）和癌变[3, 15]。GERD的病理生理学复杂，涉及多种因素，如抗反流屏障功能障碍、胃排空障碍和食管防御机制异常。大多GERD动物模型是通过手术建立的，如食管下括约肌纵向切开或合并食管裂孔疝形成、幽门结扎、食管胃吻合术、食管空肠吻合术等[9, 16]。还有研究[17-18]通过导管或预埋微型泵在动物体内不断将外源性酸、胃蛋白酶或胆汁灌入食管，直接通过化学刺激损伤食管黏膜，短时间即可诱导食管黏膜溃疡和严重的食管炎。此类方法受灌注持续时间、灌注物及复杂的体内反流物的影响，单纯通过化学刺激损伤食管黏膜可引起食管炎的产生，但无法模拟人的胃食管反流性食管良性狭窄模型，且人反流性食管良性狭窄的产生是一涉及多方面因素的慢性过程，因为它需要相似的发病机制和充足的反流刺激时间。为研究胃食管反流性食管良性狭窄的发生机制，本研究以SD大鼠为研究对象分为3组构建食管狭窄模型：手术+酸灌注组，先行食管下括约肌离断和食管裂孔横切后形成下食管括约肌松弛合并食管裂孔疝的模型，再用HCl-P灌注；酸灌注组直接用HCl-P灌注；对照组则用生理盐水灌注。本研究结果显示：手术+酸灌注组与其他2组比较不但可引起更严重的食管炎性反应，还能造成部分大鼠食管狭窄。有研究[17-19]报道，在大鼠模型中连续往食管灌注胃肠反流物质可成功诱导出食管溃疡和严重食管炎，但在7 d和4周的实验过程中未诱导出食管狭窄。本研究结果提示：手术造成抗反流屏障减弱后再酸灌注比单纯的外源性灌酸或胆汁可引起更严重的食管损伤。 既往有食管裂孔疝、消化性溃疡疾病及大量饮酒可显著增加溃疡性食管狭窄风险的报道[20]。因此，食管下括约肌离断合并食管裂孔疝模型可加重HCl-P灌注诱导的食管病变，引起食管狭窄的形成。
体质量下降是胃食管反流动物模型常见的并发症。在Gaia Filho等[21]的研究中观察到接受食管下括约肌全肌切除术的大鼠体质量明显减轻，但与部分切除和对照组相比差异无统计学意义。在本研究中，观察到手术+酸灌注组与酸灌注组大鼠的体质量显著减轻，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05），以手术+酸灌注组体质量下降明显。这可能与反流和食管狭窄有关，食管狭窄的形成造成大鼠进食困难，体质量下降。本研究结果提示，该实验中使用的技术干扰了大鼠的营养状况，与另外两项研究[22-23]中观察到分布在不同组中的所有大鼠体质量均不同程度减轻结果相似。
炎症触发的食管狭窄不仅取决于损伤后的纤维增生，可能还取决于免疫介质如炎性细胞因子和趋化因子的作用[24]。在GERD患者的食管黏膜活检标本中检测到大量细胞因子和趋化因子增加，包括IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α和单核细胞趋化蛋-1[25-26]。本研究检测了3组大鼠食管组织中TNF-α、IL-1β和IL-18的浓度，结果显示手术+酸灌注组的TNF-α、IL-1β和IL-18的浓度高于其他2组（P＜0.001）。既往研究[27]表明，手术+酸灌注组食管组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度明显高于假手术+盐水灌注组。炎性细胞的浸润和活化可产生一系列细胞因子及炎性介质，从而激发组织内成纤维细胞的增殖、活化，分泌大量细胞外基质，最终导致纤维化及狭窄形成[28]。本研究中食管下括约肌离断和食管裂孔横切后再用HCl-P灌注食管更能体现胃食管反流的发病机制，进而诱导出食管狭窄。
本研究结果验证了抗反流屏障的缺失、HCl-P灌注和炎性细胞因子活化三者共同参与诱导食管病变，甚至造成食管狭窄。但仍存在以下局限性：一是诱导食管狭窄的成功率较低，缺乏大样本实验的随机对照；二是食管狭窄形成原因可能是多种因素相互作用的结果，本研究只验证了抗反流屏障缺失加HCl-P灌注诱导的食管狭窄，可能还有食管内定植细菌参与了食管狭窄的形成。另外，食管狭窄形成的分子机制不明确，需要我们进一步深入地研究。
重要声明
利益冲突声明： 所有作者声明不存在利益冲突。
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伦理声明：本研究通过了康泰医学检验服务河北有限公司实验动物伦理委员会的审批，批文编号：MDL20220111-01。
