引用本文： 陈鑫明, 赵平武, 何运胜, 黄坤, 黄朝林, 刘洋, 廖烽丸. 奶酪或茶摄入与胃食管反流病的因果关联：两样本孟德尔随机化研究. 中国普外基础与临床杂志, 2024, 31(9): 1099-1104. doi: 10.7507/1007-9424.202404018 复制
胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）是一种因胃内容物倒流至食道引起症状和（或）并发症的疾病，主要表现为胃灼热、反酸，严重者还包括吞咽困难、消化道出血、慢性咳嗽等[1]。 GERD是一种常见的消化道疾病，成人患病率为13.3% ［95%CI为（12.0%，14.6%）］[2]，且有持续上升趋势，造成了沉重的疾病和经济负担[3]。饮食与生活方式因素被认为可影响GERD的发生[4]。奶酪是一种常见的乳制品，含有大量脂肪[5]，茶则是常见的饮品，二者都是人们日常生活中较常见的两种食品。目前已有大量的研究[6–14]表明奶酪等乳制品或茶摄入对GERD发生风险的影响。上述研究大多为观察性研究及meta分析，由于观察性研究结论易受各种混杂因素的影响[15]，而基于大量观察性研究的meta分析也不能消除混杂偏倚，还可因为方法学上的缺陷而引起研究结论出现更大的偏差[16]。因此，奶酪或茶摄入与GERD发生风险的因果关系仍存在争议，有必要基于可靠的因果推断方法来明确奶酪或茶摄入对GERD发生风险的因果效应。孟德尔随机化研究目前被认为是“天然的随机对照试验”[17]，其主要原理是通过遗传变异在配子形成过程中随机分裂、组合的特点，对目标研究人群实行模拟随机分配[18]，从而更可靠地推断出因果关系[19]。
本研究基于公开的全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）数据，使用双样本孟德尔随机化分析，探索奶酪或茶摄入与GERD发生风险的因果效应，以期为预防GERD的发生提供参考依据。
1 资料与方法
1.1 数据来源
本研究使用的所有数据来自于IEU OpenGWAS数据库。 奶酪（ “ukb-b-
1.2 工具变量的筛选方法
对于奶酪或茶摄入作为暴露因素、GERD作为结局的孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）正向分析，本研究进行了严格的SNPs筛选，工具变量筛选条件如下：① SNPs与奶酪或茶摄入之间应该高度相关（显著性阈值设置为P<5×10−8）；② 去除连锁不平衡导致的偏倚（R2<0.001，kb=10 000）；③ 将暴露因素的SNPs与结局变量的SNPs进行汇总，同时删除不相容等位基因和中等等位基因频率的回文等位基因。经上述筛选步骤后留下的SNPs最终作为奶酪或茶摄入的工具变量用于MR正向分析。同时，本研究计算了奶酪或茶摄入的工具变量的统计量F值以评估工具变量的强弱性，以 F=10为界值，若F>10则为强工具变量，反之即为弱工具变量，将F<10的弱工具变量SNPs从分析中排除。统计量F值为工具变量中单个SNP的F值总和，单个SNP的F值计算公式如下：
 |
N为工具变量的有效样本量，K为工具变量的个数，R2的计算公式如下：
 |
MAF为SNP的次要等位基因频率，β为SNP的等位基因效应值，SE为SNP 的标准误（standard error，SE）。SE×
即为标准差（standard deviation，SD）。
1.3 MR分析与敏感性分析
在双样本单向MR分析中，逆方差加权法（inverse variance weighted，IVW）被用作主要分析方法。 IVW法是使用多个SNP获得MR估计的最简单方法，IVW 法的特点是拟合时使用的权重为结局方差的倒数，回归时不考虑截距项，是两样本MR研究的标准估计方法[20]，IVW法包含随机效应模型和固定效应模型。当结果存在异质性时，以IVW随机效应模型作为金标准、IVW固定效应为补充方法；当结果无异质性时，则以IVW固定效应模型为金标准、IVW随机效应模型为补充方法[21-22]。而 MR Egger和加权中位数法（weighted median，WM）则用于完善IVW结果，以提供更有力且更广泛的评估。采用Cochrane’s Q检验对结果进行异质性检验，P<0.05为存在异质性，P>0.05为不存在异质性。采用MR Egger截距法分析水平多效性。采用“留一法”逐一剔除单个 SNP 进行敏感性分析以评价结果的稳健性。通过观察漏斗图的对称性来检查可能存在的水平多效性，以衡量当前MR分析的可靠性。此外，使用β值和比值比（odds ratio，OR）及其95%可信区间（confidence interval，CI）呈现奶酪或茶摄入与GERD发生风险之间的因果关联。基于R 4.3.1软件，在 R Studio中调用“TwoSampleMR”（版本：0.5.9）包进行统计分析，并对主要分析结果进行可视化。检验水准α=0.05。研究具体流程见图1。
图1
示两样本MR设计思路
2 结果
2.1 奶酪摄入与GERD的因果关联分析结果
奶酪摄入与GERD因果关联分析中共纳入19个有效的SNPs（表1），其 F值范围为29.537 006 05～57.484 581 11，均为强工具变量。除 MR Egger结果无统计学意义以外，在WM、IVW随机效应模型和 IVW固定效应模型中均观察到，奶酪摄入与GERD间存在因果关联（表2和图2a）。因Cochran’s Q 检验提示结果存在异质性（P<0.001），故以 IVW随机效应模型的结果作为主要结论，即奶酪摄入对减少GERD发生风险之间可能存在正向因果关系。
表1
奶酪摄入的工具变量特征
表2
孟德尔随机化分析结果
图2
示奶酪和茶摄入与GERD发生的因果关联分析结果
a～d：奶酪摄入与GERD发生的因果关联分析的森林图（a）、散点图（b）、留一法结果（c）及漏斗图（d）；e～h：茶摄入与GERD发生的因果关联分析的森林图（e）、散点图（f）、留一法结果（g）及漏斗图（h）
MR Egger回归分析结果表明，与奶酪强相关的SNP不存在水平多效性（截距为0.003，P=0.848），见图2b。留一法（图2c）和漏斗图（图2d）的结果表明，纳入的19个SNPs的因果效应估计值分布基本对称，整体不存在异质性。表明分析没有违反与IVW随机效应模型相似的因果估计。
2.2 茶摄入与GERD的因果关联分析分析结果
茶摄入与GERD因果关联分析中共纳入15个有效的SNPs（表3），其 F值范围为30.021 171 24～493.645 564 10，均为强工具变量。除MR Egger结果无统计学意义以外，在WM、IVW随机效应模型和 IVW固定效应模型中均观察到，茶摄入与GERD间存在因果关联（表2和图2e）。因Cochran’s Q检验提示结果存在异质性（P<0.001），故结果以 IVW随机效应模型的结果作为主要结论，即茶摄入对增加GERD发生风险之间可能存在正向因果关系。
表3
茶摄入的工具变量特征
MR Egger回归分析结果表明与茶叶强相关的SNP不存在水平多效性（截距为0.005，P=0.659），见图2f。留一法（图2g）和漏斗图（图2h）的结果表明，纳入的15个SNPs的因果效应估计值分布基本对称，整体不存在异质性。表明分析没有违反与IVW随机效应模型相似的因果估计。
3 讨论
本研究采用两样本MR分析方法，利用GWAS数据，分析了奶酪或茶摄入与GERD之间的因果关联。结果显示，奶酪摄入对减少GERD发生风险之间可能存在正向因果关系；茶摄入对增加GERD发生风险之间可能存在正向因果关系。
GERD是一种因胃内容物倒流至食道引起症状和（或）并发症的疾病，GERD可引起患者生活质量下降，长期治疗的需要可消耗大量卫生资源，给社会带来高昂的成本。同时老年GERD患者由于目前诊断及治疗方法的限制，具有不易痊愈的特点[23]。因此，预防GERD的发生显得至关重要。目前较多研究[6–14]表明，饮食或生活习惯与GERD发病风险有关系。 关于乳制品，Fernando等[24]的研究表明，乳制品摄入量与GERD发生率无关，但是该研究主要研究人群为代谢综合征患者，具有一定局限性，故并不能代表在正常人群中乳制品摄入量与GERD发生率的关系。更多的研究[6–9]表明，乳制品与GERD发生风险的关系目前还有争议。Ndebia等[6]、Chen等[7]的研究表明，乳制品是反酸的危险因素。另一些研究结果[8-9]却表明，乳制品对GERD发生具有保护作用。奶酪是一种常见的乳制品，本研究结果表明，奶酪摄入对减少GERD发生风险之间可能存在正向因果关系，这可能与肠道菌群失调有关[25-26]。关于茶摄入，一项印度人群的meta分析结果[10]表明，茶摄入量是GERD的危险因素。一项针对大学生的研究[11]表明，与从不喝茶的学生相比，每天喝绿茶学生更容易患GERD。Gu等[12]的研究表明，茶摄入与胃酸暴露时间及反流发作次数有关。本研究结果表明，茶摄入对增加GERD发生风险之间可能存在正向因果关系，这可能跟茶碱引起食管括约肌松弛[27]有关。
本研究也存在一定的局限性。① 所有GWAS数据均来自欧洲人群，因此限制了研究结果在其他人群中的推广性；② MR分析结果不能直接与来自临床研究的OR值进行比较，只能通过OR值判断效应方向；③ 本研究并未对奶酪具体摄入量、茶的种类等做进一步探讨，可能会致使实验结果不准确；④ 研究结论仅基于统计学结果，无法进一步探讨奶酪或茶摄入与GERD之间的生物学机制。
本研究通过两样本MR分析方法，从基因层面表明奶酪或茶摄入与GERD的发生风险存在因果关系，但仍需在更大的 GWAS数据中进行验证。在未来应关注奶酪或茶摄入与GERD发生风险相关作用靶点及机制。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明： 陈鑫明与赵平武共同设计研究、撰写论文初稿及最后全文校正；何运胜负责图表校正及最后全文校正；黄坤完成数据提取、整理及分析，校正图表；黄朝林参与撰写论文初稿；刘洋完成表格和图片制作；廖烽丸完成数据提取、整理。
胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）是一种因胃内容物倒流至食道引起症状和（或）并发症的疾病，主要表现为胃灼热、反酸，严重者还包括吞咽困难、消化道出血、慢性咳嗽等[1]。 GERD是一种常见的消化道疾病，成人患病率为13.3% ［95%CI为（12.0%，14.6%）］[2]，且有持续上升趋势，造成了沉重的疾病和经济负担[3]。饮食与生活方式因素被认为可影响GERD的发生[4]。奶酪是一种常见的乳制品，含有大量脂肪[5]，茶则是常见的饮品，二者都是人们日常生活中较常见的两种食品。目前已有大量的研究[6–14]表明奶酪等乳制品或茶摄入对GERD发生风险的影响。上述研究大多为观察性研究及meta分析，由于观察性研究结论易受各种混杂因素的影响[15]，而基于大量观察性研究的meta分析也不能消除混杂偏倚，还可因为方法学上的缺陷而引起研究结论出现更大的偏差[16]。因此，奶酪或茶摄入与GERD发生风险的因果关系仍存在争议，有必要基于可靠的因果推断方法来明确奶酪或茶摄入对GERD发生风险的因果效应。孟德尔随机化研究目前被认为是“天然的随机对照试验”[17]，其主要原理是通过遗传变异在配子形成过程中随机分裂、组合的特点，对目标研究人群实行模拟随机分配[18]，从而更可靠地推断出因果关系[19]。
本研究基于公开的全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）数据，使用双样本孟德尔随机化分析，探索奶酪或茶摄入与GERD发生风险的因果效应，以期为预防GERD的发生提供参考依据。
1 资料与方法
1.1 数据来源
本研究使用的所有数据来自于IEU OpenGWAS数据库。 奶酪（ “ukb-b-
1.2 工具变量的筛选方法
对于奶酪或茶摄入作为暴露因素、GERD作为结局的孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）正向分析，本研究进行了严格的SNPs筛选，工具变量筛选条件如下：① SNPs与奶酪或茶摄入之间应该高度相关（显著性阈值设置为P<5×10−8）；② 去除连锁不平衡导致的偏倚（R2<0.001，kb=10 000）；③ 将暴露因素的SNPs与结局变量的SNPs进行汇总，同时删除不相容等位基因和中等等位基因频率的回文等位基因。经上述筛选步骤后留下的SNPs最终作为奶酪或茶摄入的工具变量用于MR正向分析。同时，本研究计算了奶酪或茶摄入的工具变量的统计量F值以评估工具变量的强弱性，以 F=10为界值，若F>10则为强工具变量，反之即为弱工具变量，将F<10的弱工具变量SNPs从分析中排除。统计量F值为工具变量中单个SNP的F值总和，单个SNP的F值计算公式如下：
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N为工具变量的有效样本量，K为工具变量的个数，R2的计算公式如下：
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MAF为SNP的次要等位基因频率，β为SNP的等位基因效应值，SE为SNP 的标准误（standard error，SE）。SE×即为标准差（standard deviation，SD）。
1.3 MR分析与敏感性分析
在双样本单向MR分析中，逆方差加权法（inverse variance weighted，IVW）被用作主要分析方法。 IVW法是使用多个SNP获得MR估计的最简单方法，IVW 法的特点是拟合时使用的权重为结局方差的倒数，回归时不考虑截距项，是两样本MR研究的标准估计方法[20]，IVW法包含随机效应模型和固定效应模型。当结果存在异质性时，以IVW随机效应模型作为金标准、IVW固定效应为补充方法；当结果无异质性时，则以IVW固定效应模型为金标准、IVW随机效应模型为补充方法[21-22]。而 MR Egger和加权中位数法（weighted median，WM）则用于完善IVW结果，以提供更有力且更广泛的评估。采用Cochrane’s Q检验对结果进行异质性检验，P<0.05为存在异质性，P>0.05为不存在异质性。采用MR Egger截距法分析水平多效性。采用“留一法”逐一剔除单个 SNP 进行敏感性分析以评价结果的稳健性。通过观察漏斗图的对称性来检查可能存在的水平多效性，以衡量当前MR分析的可靠性。此外，使用β值和比值比（odds ratio，OR）及其95%可信区间（confidence interval，CI）呈现奶酪或茶摄入与GERD发生风险之间的因果关联。基于R 4.3.1软件，在 R Studio中调用“TwoSampleMR”（版本：0.5.9）包进行统计分析，并对主要分析结果进行可视化。检验水准α=0.05。研究具体流程见图1。
图1
示两样本MR设计思路
2 结果
2.1 奶酪摄入与GERD的因果关联分析结果
奶酪摄入与GERD因果关联分析中共纳入19个有效的SNPs（表1），其 F值范围为29.537 006 05～57.484 581 11，均为强工具变量。除 MR Egger结果无统计学意义以外，在WM、IVW随机效应模型和 IVW固定效应模型中均观察到，奶酪摄入与GERD间存在因果关联（表2和图2a）。因Cochran’s Q 检验提示结果存在异质性（P<0.001），故以 IVW随机效应模型的结果作为主要结论，即奶酪摄入对减少GERD发生风险之间可能存在正向因果关系。
表1
奶酪摄入的工具变量特征
表2
孟德尔随机化分析结果
图2
示奶酪和茶摄入与GERD发生的因果关联分析结果
a～d：奶酪摄入与GERD发生的因果关联分析的森林图（a）、散点图（b）、留一法结果（c）及漏斗图（d）；e～h：茶摄入与GERD发生的因果关联分析的森林图（e）、散点图（f）、留一法结果（g）及漏斗图（h）
MR Egger回归分析结果表明，与奶酪强相关的SNP不存在水平多效性（截距为0.003，P=0.848），见图2b。留一法（图2c）和漏斗图（图2d）的结果表明，纳入的19个SNPs的因果效应估计值分布基本对称，整体不存在异质性。表明分析没有违反与IVW随机效应模型相似的因果估计。
2.2 茶摄入与GERD的因果关联分析分析结果
茶摄入与GERD因果关联分析中共纳入15个有效的SNPs（表3），其 F值范围为30.021 171 24～493.645 564 10，均为强工具变量。除MR Egger结果无统计学意义以外，在WM、IVW随机效应模型和 IVW固定效应模型中均观察到，茶摄入与GERD间存在因果关联（表2和图2e）。因Cochran’s Q检验提示结果存在异质性（P<0.001），故结果以 IVW随机效应模型的结果作为主要结论，即茶摄入对增加GERD发生风险之间可能存在正向因果关系。
表3
茶摄入的工具变量特征
MR Egger回归分析结果表明与茶叶强相关的SNP不存在水平多效性（截距为0.005，P=0.659），见图2f。留一法（图2g）和漏斗图（图2h）的结果表明，纳入的15个SNPs的因果效应估计值分布基本对称，整体不存在异质性。表明分析没有违反与IVW随机效应模型相似的因果估计。
3 讨论
本研究采用两样本MR分析方法，利用GWAS数据，分析了奶酪或茶摄入与GERD之间的因果关联。结果显示，奶酪摄入对减少GERD发生风险之间可能存在正向因果关系；茶摄入对增加GERD发生风险之间可能存在正向因果关系。
GERD是一种因胃内容物倒流至食道引起症状和（或）并发症的疾病，GERD可引起患者生活质量下降，长期治疗的需要可消耗大量卫生资源，给社会带来高昂的成本。同时老年GERD患者由于目前诊断及治疗方法的限制，具有不易痊愈的特点[23]。因此，预防GERD的发生显得至关重要。目前较多研究[6–14]表明，饮食或生活习惯与GERD发病风险有关系。 关于乳制品，Fernando等[24]的研究表明，乳制品摄入量与GERD发生率无关，但是该研究主要研究人群为代谢综合征患者，具有一定局限性，故并不能代表在正常人群中乳制品摄入量与GERD发生率的关系。更多的研究[6–9]表明，乳制品与GERD发生风险的关系目前还有争议。Ndebia等[6]、Chen等[7]的研究表明，乳制品是反酸的危险因素。另一些研究结果[8-9]却表明，乳制品对GERD发生具有保护作用。奶酪是一种常见的乳制品，本研究结果表明，奶酪摄入对减少GERD发生风险之间可能存在正向因果关系，这可能与肠道菌群失调有关[25-26]。关于茶摄入，一项印度人群的meta分析结果[10]表明，茶摄入量是GERD的危险因素。一项针对大学生的研究[11]表明，与从不喝茶的学生相比，每天喝绿茶学生更容易患GERD。Gu等[12]的研究表明，茶摄入与胃酸暴露时间及反流发作次数有关。本研究结果表明，茶摄入对增加GERD发生风险之间可能存在正向因果关系，这可能跟茶碱引起食管括约肌松弛[27]有关。
本研究也存在一定的局限性。① 所有GWAS数据均来自欧洲人群，因此限制了研究结果在其他人群中的推广性；② MR分析结果不能直接与来自临床研究的OR值进行比较，只能通过OR值判断效应方向；③ 本研究并未对奶酪具体摄入量、茶的种类等做进一步探讨，可能会致使实验结果不准确；④ 研究结论仅基于统计学结果，无法进一步探讨奶酪或茶摄入与GERD之间的生物学机制。
本研究通过两样本MR分析方法，从基因层面表明奶酪或茶摄入与GERD的发生风险存在因果关系，但仍需在更大的 GWAS数据中进行验证。在未来应关注奶酪或茶摄入与GERD发生风险相关作用靶点及机制。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明： 陈鑫明与赵平武共同设计研究、撰写论文初稿及最后全文校正；何运胜负责图表校正及最后全文校正；黄坤完成数据提取、整理及分析，校正图表；黄朝林参与撰写论文初稿；刘洋完成表格和图片制作；廖烽丸完成数据提取、整理。
