结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是世界范围内发病率较高的恶性肿瘤，目前仍有增高趋势，可能与饮食结构逐渐西方化有关。虽然近年来诊疗技术不断提高，但仍有许多晚期患者因复发转移而死亡[1]。因此，深入探讨CRC发生发展机制，寻求针对CRC的预防、早期诊断和新的治疗策略，对于降低CRC死亡率以及改善患者预后具有重要意义。碳水化合物作为细胞结构的主要成分参与调节人体多种生理和病理过程[2]。过量摄入碳水化合物与CRC的发生密切相关，调查发现每天饮用超过2份含糖饮料的Ⅲ期CRC患者复发率和病死率显著增高[3]。2018年针对欧洲国家的研究[4]发现，精制糖的摄入量与男性群体的CRC发生存在低度正相关性，与女性群体存在中度正相关性。Science发表的研究[5]表明：敲除肿瘤抑制基因APC的小鼠经喂食高果糖玉米糖浆后，CRC肿瘤体积显著增大、恶性程度更高。
铁自噬是一种细胞调控铁离子代谢的自噬类型，该过程由核受体辅助激活因子4（nuclear receptor coactivator 4，NCOA4）介导，结合铁离子的铁蛋白（ferritin）被NCOA4识别并结合后被转运至溶酶体吞噬泡膜上形成自噬小体，然后被溶酶体降解并释放出游离亚铁离子[6-7]。研究[8]显示，铁自噬释放出的游离亚铁离子是铁死亡发生的重要条件之一。铁自噬在多种人类疾病的发病过程中发挥重要调控作用。近期研究[9]表明，高脂饮食通过抑制铁死亡，诱导小鼠结肠炎以及炎性相关肠癌的发生发展。本研究中，笔者将通过实验验证高糖饮食激活的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，mTOR）/晚期糖基化终末产物受体RAGE（receptor of advanced glycation end products，RAGE）信号通路通过抑制铁自噬，发挥促进CRC侵袭转移的作用。
1 材料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 临床病例
以多阶段整群随机抽取和自愿参与的形式招募2022年10月至2023年10月期间于哈尔滨医科大学附属第二医院接受手术治疗的CRC患者，本研究方案取得哈尔滨医科大学伦理委员会的批准（KY2020-122），研究遵循赫尔辛基宣言所规定的道德标准，所有自愿者都被充分告知程序，所有参与研究的患者均签署了哈尔滨医科大学伦理委员会提供的知情同意书。最终有66例进入研究，网络食物频率问卷和填写方式参见文献[10]。术中收集上述CRC患者的肿瘤组织及其癌旁结直肠组织标本，贮存于–80 °C超低温冰箱中保存备用。记录上述患者的姓名、性别、年龄、就诊时间、联系电话等个人资料，记录病理诊断中描述的肿瘤部位、大小、病理学分型，有无淋巴结转移，TNM分期，并记录癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和CA19-9水平。
1.1.2 CRC细胞
人结肠癌细胞系HT29以及HCT116常规培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，培养基中均加入1%双抗（青霉素、链霉素100 U/mL），置于37 °C、5% CO2培养箱中恒温培养。48～72 h传代。
1.1.3 实验动物
SPF级3周龄雄性SD大鼠共16只，体质量约50 g/只，由哈尔滨兽医研究所动物实验中心提供，饲养于哈尔滨兽医研究所动物实验中心，3只/笼，实验室环境温度为（23±3）°C，相对湿度为（55±15）%，昼夜明暗交替时间为12 h/12 h，每3天更换垫料。本研究方案取得哈尔滨医科大学伦理委员会的批准（KY2020-122）。
1.2 主要试剂和仪器
氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM，
1.3 实验方法
1.3.1 网络食物频率问卷
网络食物频率问卷包括我国南北方常食用的谷类及制品、薯类淀粉及其制品、豆类及其制品、蔬菜类食品、菌藻类、鲜果、坚果及种子类、家畜类及其食品、禽肉类及其食品、乳类及制品、蛋类及其食品、鱼虾蟹贝类、速食食品、糖及蜜饯类、饮料、调味品、其他，共17大类136种食物。调查中用各种标有食物重量的图片和容器进行定量，帮助受调查者判断摄入量。根据《中国食物成分表》计算能量和营养素摄入量；根据每月家庭总用油/盐量÷30÷家中人数计算每天的人均用油/盐量。在认真填写完网络食物频率问卷后，每个被调查者将获得1份详细的膳食评估反馈，根据膳食评估反馈，将反馈结果为“蛋白质供能适宜，脂肪供能适宜，碳水化合物供能偏高”的CRC患者定义为高糖饮食组，将反馈结果为“蛋白质供能适宜，脂肪供能适宜，碳水化合物供能适宜”的CRC患者定义为正常饮食组[10]。
1.3.2 实验动物分组
将大鼠随机分为对照组和高糖饮食组，每组8只，大鼠经适应性饲养1周后，每周给予浓度为15 mg/kg的AOM腹腔注射，持续7周，每日观察动物一般情况。对照组大鼠给予基础饲料喂养，高糖饮食组给予80%基础饲料+20%葡萄糖饲养。首次注射AOM后3个月，采用脱颈椎法处死大鼠，结直肠组织完整取材并以PBS缓冲液冲洗，所有实验大鼠均可见结直肠肿瘤，AOM建模成功率为100%，记录肉眼可见的结直肠肿瘤数目；将每个结直肠组织等分为2份，1份放于10%中性缓冲甲醛溶液固定并进行组织学检查；另1份标本于–80 °C超低温冰箱中保存用于实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（real-time quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）检测[11]。
1.3.3 细胞的处理与分组
① 取活力良好的对数生长期HT29和HCT116细胞，以5×103个/孔接种于96孔板，待细胞融合至80%时，分别以含35、70、105、140 mmol/L葡萄糖的RPMI1640培养基培养。② 取活力良好的对数生长期HT29和HCT116细胞分为对照组、高糖培养组、靶向RAGE的siRNA转染组（si-RAGE组）、靶向RAGE的siRNA转染同时以高糖培养组（高糖+si-RAGE组）。③ 取活力良好的对数生长期HT29和HCT116细胞分为对照组、高糖培养组、铁自噬激活剂处理组（雷帕霉素组）、铁自噬激活剂处理同时以高糖培养组（高糖+雷帕霉素组）。④ 各组细胞处理：对照组为未经任何处理的HT29和HCT116细胞；高糖组以含105 mmol/L葡萄糖的RPMI1640培养基培养HT29和HCT116细胞48 h。si-RAGE组以RAGE siRNAs转染HT29和HCT116细胞6 h，si-RAGE转染CRC细胞操作按照说明书进行，转染后6 h更换新鲜培养液继续培养。雷帕霉素组为以10 nmol/L雷帕霉素处理HT29和HCT116细胞48 h。高糖+si-RAGE组以含105 mmol/L葡萄糖的RPMI1640培养基培养HT29和HCT116细胞48 h的同时以RAGE siRNAs转染HT29和HCT116细胞6 h。高糖+雷帕霉素组以含105 mmol/L葡萄糖的RPMI1640培养基培养HT29和HCT116细胞48 h的同时以10 nmol/L雷帕霉素处理HT29和HCT116细胞48 h。每组均设6个复孔。
1.3.4 RT-qPCR
按Trizol试剂盒说明书操作提取标本的总RNA，按试剂盒说明书逆转录为cDNA。根据Genebank序列设计、合成目的基因引物，以PCR进行扩增，采用β-actin为内参，具体操作按试剂盒说明书进行。以2–∆∆Ct表示每个目的基因的相对表达量，∆Ct=CtmRNA–Ctβ-actin，实验重复3次。RAGE上游引物为5’-GAATCCTCCCCAATGGTTCA-3’，下游引物为5’-GCCCGACACCGGAAAGT-3’；mTOR上游引物为5’-TCCGAGAGATGAGTCAAGAGG-3’，下游引物为5’-CACCTTCCACTCCTATGAGGC-3’；NCOA4上游引物为5’-TACCCAAAAGCAGACCTTGG-3’，下游引物为5’-CGCCTTCTCCTAGAGTTTTTCC-3’；ferritin上游引物为5’-CCCCCATTTGTGTGACTTCAT-3’，下游引物为5’-GCCCGAGGCTTAGCTTTCATT-3’；β-actin上游引物为5’-ATGTTGAGACCTTCAACACC-3’，下游引物为5’-AGGTAGTCAGTCAGGTCCCGGCC-3’。
1.3.5 蛋白免疫印迹（western blot）实验
提取样本总蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后采用半干法转膜，10%脱脂牛奶封闭2 h，洗涤后加入目的蛋白的一抗（1∶500），4 °C过夜孵育，次日加入Alexa Fluor 680驴抗鼠IgG（H+L）或Alexa Fluor 680驴抗兔IgG（H+L）二抗（1∶5 000），37 °C孵育1 h。洗涤后采用Odyssey™近红外成像系统检测目的蛋白的相对表达水平。
1.3.6 细胞存活率的检测
取对数生长期的HT29、HCT116细胞接种于96孔板中（3×103个/mL），以含10%血清的培养基培养24 h后将培养基更换为实验组培养基继续培养，24 h后每孔加入细胞计数试剂盒CCK-8工作液10 μL，培养2 h后，在570 nm处测定吸光度（A）值。实验重复3次。细胞存活率（%）=实验组A值/对照组A值×100%。
1.3.7 细胞毒性的检测
取对数生长期的HT29、HCT116细胞以5×103个/孔均匀接种于96孔板，每组设6个复孔。每孔加入LDH释放液10 μL，孵育1 h后以400 g离心5 min，取上清液，使用LDH检测试剂盒按说明书加入LDH检测液后，于450 nm波长处测定A值。LDH活性（%）=（样本A值–无细胞的空白孔A值）–溶剂对照组平均A值/（阳性对照组平均A值–溶剂对照组平均A值）×100%。
1.3.8 透射电镜观察铁自噬体的形成
收集HT29、HCT116细胞，加入预冷的戊二醛1 mL固定，洗涤后以1%四氧化锇置于4 °C条件下固定2 h，依次置入30%、50%、70%、80%、90%和100%乙醇中脱水，吸净脱水剂，以体积比1∶1加入3 mL纯丙酮-EPON 812，室温静置30 min后，加入纯包埋剂1 mL，固化。显微镜下修正包块，制备超薄切片，使用醋酸双氧铀染色，冲洗晾干后于电镜（Jeol，日本）下观察记录并拍照。
1.3.9 划痕实验
将生长状态良好的HT29、HCT116细胞铺入6孔板中，每组设6个复孔，待细胞融合度达80%后给予实验处理，暴露24 h后垂直板底划直线，PBS溶液清洗漂浮的细胞后立即拍照记录；随后将6孔板置于37 °C、5% CO2培养箱中恒温培养，48 h后弃去培养上清，以PBS溶液清洗后拍照记录。采用Image J软件计算空白划痕的面积，按照公式：（0 h的划痕面积–48 h后的划痕面积）/0 h的划痕面积，计算HT29、HCT116细胞的划痕与合度。
1.3.10 细胞迁移与侵袭实验
取对数生长期的HT29、HCT116细胞以PBS溶液洗涤3次后，计数1×105个细胞重悬于100 μL无血清培养基，接种于上室，在下室加入600 μL含有10%胎牛血清的完全培养基。孵育24 h后取出小室，以95%的乙醇棉签擦去上室的细胞，加入预冷的4%多聚甲醛固定。静置15 min后，使用PBS溶液洗涤3次，每次5 min。烘干后，加入1%结晶紫染色10 min，PBS溶液洗涤3次。置于100倍显微镜下每张膜取5个随机视野进行拍照，计数视野内穿过8 μm微孔的细胞数，取其均值制作统计图，评估结肠癌细胞的迁移能力。
取4 °C预冷的不含血清的空培养基按1∶8比例稀释Matrigel，每个小室铺Matrigel 80 μL，取对数生长期的结肠癌细胞以PBS溶液洗涤3次后，计数1×105个细胞重悬于100 μL无血清培养基接种于上室，下室加入完全培养基，孵育24 h后用95%的乙醇棉签擦去细胞，加入预冷的4%多聚甲醛置于摇床上缓慢摇匀15 min固定。将固定好的细胞烘干，使用1%结晶紫染色10 min，PBS溶液洗涤3次，置于100倍显微镜下取5个随机视野进行拍照计数视野内穿过8 μm微孔的细胞数，取其均值制作统计图，评估结肠癌细胞的侵袭能力。
1.3.11 苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察组织形态学变化
收集组织标本以预冷的4%多聚甲醛在4 °C下固定2 h后进行低温保护处理，置于30%蔗糖溶液中4 °C过夜。将固定好的组织进行液体石蜡包埋：依次置于50%、60%、70%、80%、90%浓度梯度乙醇中分别浸泡1.5 h，再于95%乙醇中浸泡1 h，然后置于100%乙醇Ⅰ及Ⅱ中分别浸泡10 min使组织脱水。置于二甲苯Ⅰ及Ⅱ中各浸泡10 min后，将组织浸于65 °C石蜡中1 h包埋成组织块。包埋好后对蜡块组织连续切片，切片厚度为6.0 μm，用涂有多聚赖氨酸的切片铺片，防止标本脱落。预冷的丙酮浸泡10 min后70 °C烘干，行HE染色后，分别置于95%乙醇Ⅰ和Ⅱ中各2 min，无水乙醇Ⅰ和Ⅱ中各2 min，苯酚二甲苯溶液处理5 min后置于二甲苯溶液透明处理10 min；最后用中性树胶封片，切片做好标记后置于光学显微镜下观察组织形态学改变。
1.4 统计学方法
采用SPSS 22.0（IBM，美国）或GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software，美国）统计软件进行统计学分析。计量资料比较采用单因素方差分析，率的比较采用成组χ2检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 高糖饮食与CRC侵袭转移及铁自噬的相关性
本研究共纳入2022年10月至2023年10月期间于哈尔滨医科大学附属第二医院普外科接受手术治疗的66例CRC患者，根据调查问卷结果将其分为高糖饮食组和正常饮食组，2组患者的年龄、性别、肿瘤直径、分化程度、CEA水平和CA19-9水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。然而，高糖饮食组伴有淋巴结转移和Ⅲ/Ⅳ期患者的比例均高于正常饮食组（P=0.004、P=0.004），见表1。然后，本研究通过RT-qPCR方法检测了铁自噬标志物NCOA4和ferritin在CRC组织及其癌旁组织中的表达水平。如图1a、1b所示，与癌旁组织（包括有、无淋巴结转移）相比，NCOA4在无淋巴结转移和有淋巴结转移的CRC肿瘤组织中的表达水平下调（P<0.001），在伴有淋巴结转移的CRC肿瘤组织中表达水平更低（P<0.01）；而ferritin在无淋巴结转移和有淋巴结转移的CRC肿瘤组织中表达水平上调，在伴有淋巴结转移的CRC肿瘤组织中表达水平更高（P<0.05）。根据NCOA4、ferritin在CRC肿瘤组织的中位相对表达量将其分为高、低表达，如表2所示，高糖饮食与CRC患者肿瘤组织中NCOA4的表达水平呈负相关（P=0.008），与ferritin表达水平呈正相关性（P<0.001）。
表1
饮食习惯与CRC患者临床病理特征的关系（例）
图1
示CRC组织及其癌旁组织中NCOA4以及ferritin的表达水平比较
a：NCOA4在无淋巴结转移和有淋巴结转移的CRC组织中表达水平下调，在伴有淋巴结转移的CRC组织中表达水平更低；b：ferritin在无淋巴结转移和有淋巴结转移的CRC组织中表达水平上调，在伴有淋巴结转移的CRC肿瘤组织中表达水平更高。与癌旁组织（包括有、无淋巴结转移）比较，
表2
饮食习惯与CRC患者NCOA4以及ferritin表达水平的相关性（例）
2.2 高浓度葡萄糖抑制铁自噬并促进CRC细胞侵袭转移
研究[12]表明高浓度葡萄糖具有抑制铁自噬并促进多种人类恶性肿瘤细胞增殖分化的作用。为了分析高浓度葡萄糖对HT29和HCT116 CRC细胞铁自噬的调节作用以及对细胞增殖分化的影响，本研究以不同浓度葡萄糖处理CRC细胞系，结果如图2a所示：高浓度葡萄糖显著促进CRC细胞的增殖分化，其效果随葡萄糖浓度的增加（0、35、70、105、140 mmol/L）变得更加显著。细胞毒性实验分析结果如图2b所示，当葡萄糖浓度达到140 mmol/L处理时，结肠癌细胞表现出显著的细胞毒性作用。因此，后续实验中采用105 mmol/L作为最适浓度。如图2c所示，与对照组相比，高糖组HT29和HCT116细胞中自噬小体数量显著减少；在图2d～2g所示的western blot实验中，高浓度葡萄糖处理显著下调HT29和HCT116细胞的NCOA4表达，促进ferritin表达。在细胞划痕（图2h～2j）和侵袭小室实验（图2k～2n）中，本研究发现以高浓度葡萄糖培养HT29和HCT116细胞后显著提高细胞的迁移侵袭能力：与对照组比较，高糖组HT29和HCT116的划痕愈合度较低（P<0.05）、迁移和侵袭细胞数较高（P<0.05）。
图2
示高浓度葡萄糖抑制铁自噬并促进CRC细胞侵袭转移
a：高浓度葡萄糖呈浓度依赖性促进CRC细胞的增殖分化；b：当葡萄糖浓度达到140 mmol/L时，结肠癌细胞表现出显著的细胞毒性作用；c：高糖组HT29和HCT116细胞中自噬小体数量显著减少，黑箭所指为自噬小体；d～g：HT29和HCT116细胞中，高浓度葡萄糖处理均下调NCOA4表达，促进ferritin表达；h～j：细胞划痕实验表明高浓度葡萄糖促进CRC细胞迁移（h、i：×10）；k～n：细胞迁移与侵袭实验证实高浓度葡萄糖促进CRC细胞的迁移侵袭（k、m：结晶紫染色 ×100）；与对照组相比，*
2.3 mTOR/RAGE信号通路参与调控高浓度葡萄糖抑制铁自噬，促进CRC细胞侵袭转移
为了验证高浓度葡萄糖通过调控mTOR/RAGE信号通路抑制铁自噬、促进CRC细胞侵袭转移过程，本研究以高浓度葡萄糖和RAGE特异性siRNAs处理HT29和HCT116细胞。如图3a所示，与对照组相比，高糖组HT29和HCT116细胞的自噬小体显著减少，si-RAGE组HT29和HCT116细胞内自噬小体显著增多；与高糖组比较，高糖+si-RAGE组HT29和HCT116细胞中自噬小体显著增多。如图3b～3e所示，与对照组比较，高糖组HT29和HCT116细胞中RAGE、p-mTOR、ferritin表达上调（P<0.001），NCOA4表达下调（P<0.001）；si-RAGE组RAGE、mTOR、ferritin表达下调（P<0.001），NCOA4表达上调（P<0.001）。与高糖组比较，高糖+si-RAGE组RAGE、p-mTOR、ferritin表达下调（P<0.001），NCOA4表达上调（P<0.001）。结果表明，高浓度葡萄糖下调CRC细胞NCOA4表达，促进p-mTOR、RAGE以及ferritin表达；si-RAGE处理后CRC细胞NCOA4表达上调，p-mTOR、RAGE以及ferritin表达下调；重要的是，在si-RAGE处理CRC细胞后，高浓度葡萄糖对CRC细胞NCOA4表达的抑制效果以及对p-mTOR、RAGE和ferritin表达的促进作用均显著减弱。
图3
示高浓度葡萄糖激活mTOR/RAGE信号通路，抑制铁自噬，促进CRC细胞侵袭转移
a：与对照组比较，高糖组HT29和HCT116细胞内自噬小体显著减少，si-RAGE组细胞内自噬小体显著增多，而与高糖组比较，高糖+si-RAGE组细胞内自噬小体数量增多（黑箭所指为自噬小体）。b～e：与对照组比较，高糖组HT29和HCT116细胞中NCOA4表达下调，p-mTOR、RAGE以及ferritin表达上调，si-RAGE组NCOA4表达上调，p-mTOR、RAGE以及ferritin表达下调；而与高糖组比较，高糖+si-RAGE组细胞中NCOA4表达上调，p-mTOR、RAGE和ferritin表达下调。f～g：细胞划痕实验表明与对照组比较，高糖组HT29和HCT116细胞的划痕愈合度较低，si-RAGE组较高；与高糖组比较，高糖+si-RAGE组的划痕愈合度较高（ ×10）。h～j：细胞迁移与侵袭实验表明，与对照组比较，高糖组HT29和HCT116细胞的迁移侵袭数量高，si-RAGE组较低；与高糖组比较，高糖+si-RAGE组的迁移侵袭数量较低（结晶紫染色 ×100）。与对照组相比，*
在细胞划痕（图3f～3g）中，与对照组比较，高糖组HT29和HCT116细胞的划痕愈合度较低（P<0.05），si-RAGE组较高（P<0.05）；与高糖组比较，高糖+si-RAGE组的划痕愈合度较高（P<0.05）。在迁移侵袭小室实验（图3h～3j）中，与对照组比较，高糖组的迁移侵袭数量高（P<0.05），si-RAGE组较低（P<0.05）；与高糖组比较，高糖+si-RAGE组的迁移侵袭数量较低（P<0.05）。表明高浓度葡萄糖显著提高了CRC细胞的迁移侵袭能力，si-RAGE处理后CRC细胞迁移侵袭能力降低；在沉默CRC细胞RAGE表达后，高浓度葡萄糖对CRC细胞迁移和侵袭能力的促进作用均显著减弱。上述实验结果表明，mTOR/RAGE信号通路参与调控高浓度葡萄糖抑制铁自噬，促进CRC细胞侵袭转移。
2.4 高浓度葡萄糖调控的铁自噬参与促进CRC细胞侵袭转移
为了验证高浓度葡萄糖调控的铁自噬参与促进CRC细胞侵袭转移过程，本研究以高浓度葡萄糖和铁自噬激活剂雷帕霉素处理HT29和HCT116细胞。如图4a所示，与对照组相比，高糖组HT29和HCT116细胞的自噬小体显著减少，雷帕霉素组细胞内自噬小体显著增多；与高糖组比较，高糖+雷帕霉素组细胞的自噬小体明显增加，提示雷帕霉素削弱了高浓度葡萄糖对CRC细胞铁自噬的抑制作用。图4b～4e western blot实验结果表明，与对照组比较，高糖组HT29和HCT116细胞中NCOA4表达下调（P<0.05），ferritin表达上调（P<0.05）；雷帕霉素组NCOA4表达上调（P<0.05），ferritin表达下调（P<0.05）；与高糖组比较，高糖+雷帕霉素组NCOA4表达上调（P<0.05），ferritin表达下调（P<0.05），提示在雷帕霉素处理CRC细胞后，高浓度葡萄糖对CRC细胞NCOA4表达的抑制效果以及对ferritin表达的促进作用均显著减弱。
图4
示高浓度葡萄糖调控的铁自噬促进CRC细胞侵袭转移
a：与对照组比较，高糖组HT29和HCT116细胞内自噬小体显著减少，雷帕霉素组细胞内自噬小体显著增多，而与高糖组比较，高糖+雷帕霉素组细胞内自噬小体数量增多（黑箭所指为自噬小体）。b～e：与对照组比较，高糖组HT29和HCT116细胞中NCOA4表达下调、ferritin表达上调，雷帕霉素组NCOA4表达上调、ferritin表达下调；与高糖组比较，高糖+雷帕霉素组细胞中NCOA4表达上调，ferritin表达下调。f～g：细胞划痕实验表明与对照组比较，高糖组HT29和HCT116细胞的划痕愈合度较高，雷帕霉素组较低；与高糖组比较，高糖+雷帕霉素组的划痕愈合度较低（ ×10）。h～j：细胞迁移与侵袭实验表明与对照组比较，高糖组HT29和HCT116细胞的迁移侵袭数量高，雷帕霉素组较低；与高糖组比较，高糖+雷帕霉素组的迁移侵袭数量较低（结晶紫染色 ×100）。与对照组比较，*
在细胞划痕（图4f～4g）中，与对照组比较，高糖组HT29和HCT116细胞的划痕愈合度较低（P<0.05），雷帕霉素组较高（P<0.05）；与高糖组比较，高糖+雷帕霉素组的划痕愈合度较高（P<0.05）。在迁移侵袭小室实验（图4h～4j）中，与对照组比较，高糖组的迁移侵袭数量高（P<0.05），雷帕霉素组较低（P<0.05）；与高糖组比较，高糖+雷帕霉素组的迁移侵袭数量较低（P<0.05）。提示高浓度葡萄糖显著提高了CRC细胞的迁移侵袭能力，雷帕霉素处理后CRC细胞迁移侵袭能力降低；在雷帕霉素处理CRC细胞后，高浓度葡萄糖对CRC细胞迁移和侵袭能力的促进作用均显著减弱。以上实验结果表明，高浓度葡萄糖环境下抑制的铁自噬参与促进CRC细胞侵袭转移。
2.5 高糖饮食通过mTOR/RAGE信号通路促进大鼠CRC发生发展
本研究采用AOM诱导的大鼠原位CRC模型进一步验证高糖饮食通过mTOR/RAGE信号通路抑制铁自噬，促进CRC发生发展过程。如图5a所示，与对照组相比，高糖饮食组大鼠的结直肠肿瘤数量增多（P<0.05）。如图5b和5c所示，对照组大鼠结直肠肿瘤组织可见典型的黏膜内癌，肿瘤呈现不规则腺体结构，可见典型的异型性细胞核；高糖饮食组大鼠肿瘤组织中黏膜内癌的分化程度显著降低，腺体结构严重不规则，炎性细胞的浸润情况较对照组明显增加，细胞核异型性明显增加。为进一步明确高糖饮食对大鼠CRC形成的促进机制，本研究通过RT-qPCR方法检测2组大鼠结直肠组织中NCOA4、ferritin、RAGE以及mTOR的表达情况，如图5d～5g所示：与对照组相比，高糖饮食组大鼠结直肠肿瘤组织中NCOA4表达水平降低（P<0.05），ferritin、RAGE以及mTOR表达水平增高（P<0.05）。以上实验结果表明高糖饮食通过mTOR/RAGE信号通路抑制铁自噬，促进实验动物CRC发生发展。
图5
示高糖饮食激活mTOR/RAGE信号通路，促进大鼠CRC发生发展
a：与对照组相比，高糖饮食组大鼠结直肠肿瘤数量增多。b、c：肿瘤组织HE染色示对照组大鼠（b）结直肠肿瘤组织可见典型的黏膜内癌，肿瘤呈现不规则腺体结构，可见典型的异型性细胞核；高糖饮食组大鼠（c）肿瘤组织中黏膜内癌的分化程度显著降低，腺体结构严重不规则，炎性细胞的浸润情况较对照组明显增加，细胞核异型性明显增加（HE ×400）。d～g：与对照组相比，高糖饮食组大鼠结直肠肿瘤组织中NCOA4表达水平降低（d），ferritin（e）、RAGE（f）以及mTOR（g）表达水平增高。与对照组相比，*
3 讨论
碳水化合物是日常膳食的重要组成部分，作为细胞结构的主要成分和主要供能物质，可调节人体细胞活动、肠道菌群结构、表观遗传和内分泌代谢，由此调控人类恶性肿瘤的发生发展[13-14]。葡萄糖是人类日常膳食中最常见的单糖，Miles等[15]对包含22 720例男性的癌症筛查样本库进行数据分析后发现，精制糖的摄入量与前列腺癌患病风险存在正相关性。另有研究表明过量精制糖的摄入可能增加非酒精性肝硬化相关肝癌的发生风险[16]。一项针对欧洲人群的流行病学研究[4]提示，精制糖的摄入量与男性群体的CRC发生存在低度正相关性，与女性群体存在中度正相关性。近期发表于Science的研究[5]表明：敲除APC基因的小鼠经长期喂食高果糖饮食后，CRC肿瘤体积显著增大、恶性程度更高，提示长期过量精制糖的摄入可能是CRC发生发展的独立危险因素。本研究通过分析收集的CRC患者临床病例资料发现，日常生活中碳水化合物摄入量偏高的患者更容易出现淋巴结转移和较晚的TNM分期，并且其肿瘤组织中铁自噬水平相对较低。越来越多的研究表明，铁自噬是细胞铁死亡和自噬之间非常重要的对话方式，敲除铁自噬关键蛋白NCOA4或自噬关键蛋白（autophagy-related gene，ATG），均会导致铁自噬被抑制，进而抑制铁死亡[17-18]，这也是铁自噬被用来发挥抑制肿瘤细胞增殖分化的理论基础[19]。本实验中，笔者在CRC原位动物模型和CRC细胞系中均证实了猜测，即高浓度葡萄糖具有抑制CRC细胞铁自噬的作用，本研究发现以自噬激活剂雷帕霉素激活CRC细胞铁自噬后，高浓度葡萄糖对CRC细胞迁移和侵袭能力的增强作用显著减弱，这表明高浓度葡萄糖环境下抑制的铁自噬参与促进了CRC细胞的侵袭转移。然而，本研究也存在不足：雷帕霉素是细胞自噬的激活剂，并非铁自噬的特异性激活剂，因此雷帕霉素激活了包括但不限于铁自噬的全部自噬，在今后的研究中笔者将进一步采用特异性铁自噬激活剂深入挖掘高浓度葡萄糖环境下抑制的铁自噬对CRC细胞侵袭转移的影响。
基于肿瘤细胞Warburg效应下的糖代谢特点，肿瘤细胞增殖速率与可利用碳水化合物的摄入量存在正相关性[20]。过量碳水化合物的摄入导致体内葡萄糖与蛋白质、脂质或核酸的自由氨基经过一系列复杂的非酶触反应，形成大量晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs），其受体RAGE随着AGEs的升高而积聚，二者相互作用具有促进肿瘤生长、滋养血管形成及肿瘤转移的作用[21]。同时，AGEs/RAGE信号也是细胞自噬和铁死亡程序的关键调控因子。有研究[22]报道枫树糖浆通过抑制AGEs/RAGE信号激活抑制CRC细胞自噬，进而发挥抑制CRC细胞增殖分化的作用。有趣的是，高糖环境下AGEs/RAGE信号被异常激活，其介导的铁死亡程序参与调控2型糖尿病的发生进展[23]。本研究结果表明，沉默CRC细胞RAGE表达后，CRC细胞铁自噬被激活，细胞迁移侵袭能力降低；更重要的是，在沉默CRC细胞RAGE表达后，高浓度葡萄糖对CRC细胞铁自噬的抑制作用被削弱，对CRC细胞迁移和侵袭能力的促进作用也随之减弱。本动物实验同样表明，经高糖喂养的大鼠结直肠肿瘤数量明显增多，黏膜内癌的分化程度更低，铁自噬显著被抑制，RAGE表达量异常增高。
铁自噬是由NCOA4作为伴侣分子所介导的一种特异性自噬，NCOA4通过特异性地识别结合细胞内结合铁离子的铁蛋白，并将其转运至溶酶体降解并释放出游离铁离子。铁蛋白是细胞内铁离子储存的重要结构，由铁蛋白重链（ferritin heavy chain）和轻链（ferritin light chain）亚基组成铁蛋白复合体[24]。研究[25]表明，细胞铁死亡过程中所依赖的铁离子来自铁自噬释放的铁离子，因此铁死亡被认为属于自噬依赖的细胞死亡过程。众所周知，mTOR信号是调控自噬的关键分子，有研究[26]表明酚甲烷通过诱导肾小管上皮细胞铁死亡导致肾损伤，这一过程需要mTOR/UNC51样激酶1（UNC51-like kinase-1，ULK1）信号通路介导的铁自噬参与。高糖通过激活单磷酸腺苷依赖蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）/mTOR信号通路诱导成骨细胞铁自噬进而促进细胞铁死亡，加重2型糖尿病患者的骨质疏松[27]。纳米氧化锌通过AMPK/mTOR信号通路调节铁自噬促进血管内皮细胞铁死亡[28]。本研究结果表明，高浓度葡萄糖导致mTOR信号磷酸化激活，抑制CRC细胞铁自噬，增强CRC细胞的迁移和侵袭能力；在沉默CRC细胞RAGE表达后，高浓度葡萄糖对CRC细胞mTOR信号的激活效果、对铁自噬的抑制作用以及对CRC细胞迁移和侵袭能力的促进作用均被削弱。本研究尚存在一些不足：本研究采用RT-qPCR方法检测大鼠结直肠组织中NCOA4、ferritin、RAGE以及mTOR的mRNA表达情况，并未对上述基因蛋白表达情况进行检测，在今后的研究中笔者将进一步对NCOA4、ferritin、RAGE以及mTOR在大鼠结直肠组织中的蛋白表达情况进行分析。
综上所述，本研究结果证实高糖饮食促进CRC发生发展，CRC细胞长期暴露高糖环境下后铁自噬被抑制，导致CRC细胞的迁移侵袭能力增强，其作用机制与mTOR/RAGE信号通路的异常激活及过度磷酸化密切相关。本研究揭示了长期高碳水化合物饮食促进CRC发展的潜在机制，丰富了国民对健康饮食降低CRC患病的认识，为通过改善饮食习惯从而寻求针对CRC的预防提供了理论依据。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：乔鹏飞完成实验设计；熊枭、陈豪、李元亮、唐研共同进行实验、收集数据并做统计分析；乔鹏飞、熊枭和张好刚共同完成论文写作。
伦理声明：本研究已通过哈尔滨医科大学附属第二医院伦理委员会的伦理审核批准（批文编号：KY2020-122）。
结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是世界范围内发病率较高的恶性肿瘤，目前仍有增高趋势，可能与饮食结构逐渐西方化有关。虽然近年来诊疗技术不断提高，但仍有许多晚期患者因复发转移而死亡[1]。因此，深入探讨CRC发生发展机制，寻求针对CRC的预防、早期诊断和新的治疗策略，对于降低CRC死亡率以及改善患者预后具有重要意义。碳水化合物作为细胞结构的主要成分参与调节人体多种生理和病理过程[2]。过量摄入碳水化合物与CRC的发生密切相关，调查发现每天饮用超过2份含糖饮料的Ⅲ期CRC患者复发率和病死率显著增高[3]。2018年针对欧洲国家的研究[4]发现，精制糖的摄入量与男性群体的CRC发生存在低度正相关性，与女性群体存在中度正相关性。Science发表的研究[5]表明：敲除肿瘤抑制基因APC的小鼠经喂食高果糖玉米糖浆后，CRC肿瘤体积显著增大、恶性程度更高。
铁自噬是一种细胞调控铁离子代谢的自噬类型，该过程由核受体辅助激活因子4（nuclear receptor coactivator 4，NCOA4）介导，结合铁离子的铁蛋白（ferritin）被NCOA4识别并结合后被转运至溶酶体吞噬泡膜上形成自噬小体，然后被溶酶体降解并释放出游离亚铁离子[6-7]。研究[8]显示，铁自噬释放出的游离亚铁离子是铁死亡发生的重要条件之一。铁自噬在多种人类疾病的发病过程中发挥重要调控作用。近期研究[9]表明，高脂饮食通过抑制铁死亡，诱导小鼠结肠炎以及炎性相关肠癌的发生发展。本研究中，笔者将通过实验验证高糖饮食激活的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，mTOR）/晚期糖基化终末产物受体RAGE（receptor of advanced glycation end products，RAGE）信号通路通过抑制铁自噬，发挥促进CRC侵袭转移的作用。
1 材料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 临床病例
以多阶段整群随机抽取和自愿参与的形式招募2022年10月至2023年10月期间于哈尔滨医科大学附属第二医院接受手术治疗的CRC患者，本研究方案取得哈尔滨医科大学伦理委员会的批准（KY2020-122），研究遵循赫尔辛基宣言所规定的道德标准，所有自愿者都被充分告知程序，所有参与研究的患者均签署了哈尔滨医科大学伦理委员会提供的知情同意书。最终有66例进入研究，网络食物频率问卷和填写方式参见文献[10]。术中收集上述CRC患者的肿瘤组织及其癌旁结直肠组织标本，贮存于–80 °C超低温冰箱中保存备用。记录上述患者的姓名、性别、年龄、就诊时间、联系电话等个人资料，记录病理诊断中描述的肿瘤部位、大小、病理学分型，有无淋巴结转移，TNM分期，并记录癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和CA19-9水平。
1.1.2 CRC细胞
人结肠癌细胞系HT29以及HCT116常规培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，培养基中均加入1%双抗（青霉素、链霉素100 U/mL），置于37 °C、5% CO2培养箱中恒温培养。48～72 h传代。
1.1.3 实验动物
SPF级3周龄雄性SD大鼠共16只，体质量约50 g/只，由哈尔滨兽医研究所动物实验中心提供，饲养于哈尔滨兽医研究所动物实验中心，3只/笼，实验室环境温度为（23±3）°C，相对湿度为（55±15）%，昼夜明暗交替时间为12 h/12 h，每3天更换垫料。本研究方案取得哈尔滨医科大学伦理委员会的批准（KY2020-122）。
1.2 主要试剂和仪器
氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM，
1.3 实验方法
1.3.1 网络食物频率问卷
网络食物频率问卷包括我国南北方常食用的谷类及制品、薯类淀粉及其制品、豆类及其制品、蔬菜类食品、菌藻类、鲜果、坚果及种子类、家畜类及其食品、禽肉类及其食品、乳类及制品、蛋类及其食品、鱼虾蟹贝类、速食食品、糖及蜜饯类、饮料、调味品、其他，共17大类136种食物。调查中用各种标有食物重量的图片和容器进行定量，帮助受调查者判断摄入量。根据《中国食物成分表》计算能量和营养素摄入量；根据每月家庭总用油/盐量÷30÷家中人数计算每天的人均用油/盐量。在认真填写完网络食物频率问卷后，每个被调查者将获得1份详细的膳食评估反馈，根据膳食评估反馈，将反馈结果为“蛋白质供能适宜，脂肪供能适宜，碳水化合物供能偏高”的CRC患者定义为高糖饮食组，将反馈结果为“蛋白质供能适宜，脂肪供能适宜，碳水化合物供能适宜”的CRC患者定义为正常饮食组[10]。
1.3.2 实验动物分组
将大鼠随机分为对照组和高糖饮食组，每组8只，大鼠经适应性饲养1周后，每周给予浓度为15 mg/kg的AOM腹腔注射，持续7周，每日观察动物一般情况。对照组大鼠给予基础饲料喂养，高糖饮食组给予80%基础饲料+20%葡萄糖饲养。首次注射AOM后3个月，采用脱颈椎法处死大鼠，结直肠组织完整取材并以PBS缓冲液冲洗，所有实验大鼠均可见结直肠肿瘤，AOM建模成功率为100%，记录肉眼可见的结直肠肿瘤数目；将每个结直肠组织等分为2份，1份放于10%中性缓冲甲醛溶液固定并进行组织学检查；另1份标本于–80 °C超低温冰箱中保存用于实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（real-time quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）检测[11]。
1.3.3 细胞的处理与分组
① 取活力良好的对数生长期HT29和HCT116细胞，以5×103个/孔接种于96孔板，待细胞融合至80%时，分别以含35、70、105、140 mmol/L葡萄糖的RPMI1640培养基培养。② 取活力良好的对数生长期HT29和HCT116细胞分为对照组、高糖培养组、靶向RAGE的siRNA转染组（si-RAGE组）、靶向RAGE的siRNA转染同时以高糖培养组（高糖+si-RAGE组）。③ 取活力良好的对数生长期HT29和HCT116细胞分为对照组、高糖培养组、铁自噬激活剂处理组（雷帕霉素组）、铁自噬激活剂处理同时以高糖培养组（高糖+雷帕霉素组）。④ 各组细胞处理：对照组为未经任何处理的HT29和HCT116细胞；高糖组以含105 mmol/L葡萄糖的RPMI1640培养基培养HT29和HCT116细胞48 h。si-RAGE组以RAGE siRNAs转染HT29和HCT116细胞6 h，si-RAGE转染CRC细胞操作按照说明书进行，转染后6 h更换新鲜培养液继续培养。雷帕霉素组为以10 nmol/L雷帕霉素处理HT29和HCT116细胞48 h。高糖+si-RAGE组以含105 mmol/L葡萄糖的RPMI1640培养基培养HT29和HCT116细胞48 h的同时以RAGE siRNAs转染HT29和HCT116细胞6 h。高糖+雷帕霉素组以含105 mmol/L葡萄糖的RPMI1640培养基培养HT29和HCT116细胞48 h的同时以10 nmol/L雷帕霉素处理HT29和HCT116细胞48 h。每组均设6个复孔。
1.3.4 RT-qPCR
按Trizol试剂盒说明书操作提取标本的总RNA，按试剂盒说明书逆转录为cDNA。根据Genebank序列设计、合成目的基因引物，以PCR进行扩增，采用β-actin为内参，具体操作按试剂盒说明书进行。以2–∆∆Ct表示每个目的基因的相对表达量，∆Ct=CtmRNA–Ctβ-actin，实验重复3次。RAGE上游引物为5’-GAATCCTCCCCAATGGTTCA-3’，下游引物为5’-GCCCGACACCGGAAAGT-3’；mTOR上游引物为5’-TCCGAGAGATGAGTCAAGAGG-3’，下游引物为5’-CACCTTCCACTCCTATGAGGC-3’；NCOA4上游引物为5’-TACCCAAAAGCAGACCTTGG-3’，下游引物为5’-CGCCTTCTCCTAGAGTTTTTCC-3’；ferritin上游引物为5’-CCCCCATTTGTGTGACTTCAT-3’，下游引物为5’-GCCCGAGGCTTAGCTTTCATT-3’；β-actin上游引物为5’-ATGTTGAGACCTTCAACACC-3’，下游引物为5’-AGGTAGTCAGTCAGGTCCCGGCC-3’。
1.3.5 蛋白免疫印迹（western blot）实验
提取样本总蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后采用半干法转膜，10%脱脂牛奶封闭2 h，洗涤后加入目的蛋白的一抗（1∶500），4 °C过夜孵育，次日加入Alexa Fluor 680驴抗鼠IgG（H+L）或Alexa Fluor 680驴抗兔IgG（H+L）二抗（1∶5 000），37 °C孵育1 h。洗涤后采用Odyssey™近红外成像系统检测目的蛋白的相对表达水平。
1.3.6 细胞存活率的检测
取对数生长期的HT29、HCT116细胞接种于96孔板中（3×103个/mL），以含10%血清的培养基培养24 h后将培养基更换为实验组培养基继续培养，24 h后每孔加入细胞计数试剂盒CCK-8工作液10 μL，培养2 h后，在570 nm处测定吸光度（A）值。实验重复3次。细胞存活率（%）=实验组A值/对照组A值×100%。
1.3.7 细胞毒性的检测
取对数生长期的HT29、HCT116细胞以5×103个/孔均匀接种于96孔板，每组设6个复孔。每孔加入LDH释放液10 μL，孵育1 h后以400 g离心5 min，取上清液，使用LDH检测试剂盒按说明书加入LDH检测液后，于450 nm波长处测定A值。LDH活性（%）=（样本A值–无细胞的空白孔A值）–溶剂对照组平均A值/（阳性对照组平均A值–溶剂对照组平均A值）×100%。
1.3.8 透射电镜观察铁自噬体的形成
收集HT29、HCT116细胞，加入预冷的戊二醛1 mL固定，洗涤后以1%四氧化锇置于4 °C条件下固定2 h，依次置入30%、50%、70%、80%、90%和100%乙醇中脱水，吸净脱水剂，以体积比1∶1加入3 mL纯丙酮-EPON 812，室温静置30 min后，加入纯包埋剂1 mL，固化。显微镜下修正包块，制备超薄切片，使用醋酸双氧铀染色，冲洗晾干后于电镜（Jeol，日本）下观察记录并拍照。
1.3.9 划痕实验
将生长状态良好的HT29、HCT116细胞铺入6孔板中，每组设6个复孔，待细胞融合度达80%后给予实验处理，暴露24 h后垂直板底划直线，PBS溶液清洗漂浮的细胞后立即拍照记录；随后将6孔板置于37 °C、5% CO2培养箱中恒温培养，48 h后弃去培养上清，以PBS溶液清洗后拍照记录。采用Image J软件计算空白划痕的面积，按照公式：（0 h的划痕面积–48 h后的划痕面积）/0 h的划痕面积，计算HT29、HCT116细胞的划痕与合度。
1.3.10 细胞迁移与侵袭实验
取对数生长期的HT29、HCT116细胞以PBS溶液洗涤3次后，计数1×105个细胞重悬于100 μL无血清培养基，接种于上室，在下室加入600 μL含有10%胎牛血清的完全培养基。孵育24 h后取出小室，以95%的乙醇棉签擦去上室的细胞，加入预冷的4%多聚甲醛固定。静置15 min后，使用PBS溶液洗涤3次，每次5 min。烘干后，加入1%结晶紫染色10 min，PBS溶液洗涤3次。置于100倍显微镜下每张膜取5个随机视野进行拍照，计数视野内穿过8 μm微孔的细胞数，取其均值制作统计图，评估结肠癌细胞的迁移能力。
取4 °C预冷的不含血清的空培养基按1∶8比例稀释Matrigel，每个小室铺Matrigel 80 μL，取对数生长期的结肠癌细胞以PBS溶液洗涤3次后，计数1×105个细胞重悬于100 μL无血清培养基接种于上室，下室加入完全培养基，孵育24 h后用95%的乙醇棉签擦去细胞，加入预冷的4%多聚甲醛置于摇床上缓慢摇匀15 min固定。将固定好的细胞烘干，使用1%结晶紫染色10 min，PBS溶液洗涤3次，置于100倍显微镜下取5个随机视野进行拍照计数视野内穿过8 μm微孔的细胞数，取其均值制作统计图，评估结肠癌细胞的侵袭能力。
1.3.11 苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察组织形态学变化
收集组织标本以预冷的4%多聚甲醛在4 °C下固定2 h后进行低温保护处理，置于30%蔗糖溶液中4 °C过夜。将固定好的组织进行液体石蜡包埋：依次置于50%、60%、70%、80%、90%浓度梯度乙醇中分别浸泡1.5 h，再于95%乙醇中浸泡1 h，然后置于100%乙醇Ⅰ及Ⅱ中分别浸泡10 min使组织脱水。置于二甲苯Ⅰ及Ⅱ中各浸泡10 min后，将组织浸于65 °C石蜡中1 h包埋成组织块。包埋好后对蜡块组织连续切片，切片厚度为6.0 μm，用涂有多聚赖氨酸的切片铺片，防止标本脱落。预冷的丙酮浸泡10 min后70 °C烘干，行HE染色后，分别置于95%乙醇Ⅰ和Ⅱ中各2 min，无水乙醇Ⅰ和Ⅱ中各2 min，苯酚二甲苯溶液处理5 min后置于二甲苯溶液透明处理10 min；最后用中性树胶封片，切片做好标记后置于光学显微镜下观察组织形态学改变。
1.4 统计学方法
采用SPSS 22.0（IBM，美国）或GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software，美国）统计软件进行统计学分析。计量资料比较采用单因素方差分析，率的比较采用成组χ2检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 高糖饮食与CRC侵袭转移及铁自噬的相关性
本研究共纳入2022年10月至2023年10月期间于哈尔滨医科大学附属第二医院普外科接受手术治疗的66例CRC患者，根据调查问卷结果将其分为高糖饮食组和正常饮食组，2组患者的年龄、性别、肿瘤直径、分化程度、CEA水平和CA19-9水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。然而，高糖饮食组伴有淋巴结转移和Ⅲ/Ⅳ期患者的比例均高于正常饮食组（P=0.004、P=0.004），见表1。然后，本研究通过RT-qPCR方法检测了铁自噬标志物NCOA4和ferritin在CRC组织及其癌旁组织中的表达水平。如图1a、1b所示，与癌旁组织（包括有、无淋巴结转移）相比，NCOA4在无淋巴结转移和有淋巴结转移的CRC肿瘤组织中的表达水平下调（P<0.001），在伴有淋巴结转移的CRC肿瘤组织中表达水平更低（P<0.01）；而ferritin在无淋巴结转移和有淋巴结转移的CRC肿瘤组织中表达水平上调，在伴有淋巴结转移的CRC肿瘤组织中表达水平更高（P<0.05）。根据NCOA4、ferritin在CRC肿瘤组织的中位相对表达量将其分为高、低表达，如表2所示，高糖饮食与CRC患者肿瘤组织中NCOA4的表达水平呈负相关（P=0.008），与ferritin表达水平呈正相关性（P<0.001）。
表1
饮食习惯与CRC患者临床病理特征的关系（例）
图1
示CRC组织及其癌旁组织中NCOA4以及ferritin的表达水平比较
a：NCOA4在无淋巴结转移和有淋巴结转移的CRC组织中表达水平下调，在伴有淋巴结转移的CRC组织中表达水平更低；b：ferritin在无淋巴结转移和有淋巴结转移的CRC组织中表达水平上调，在伴有淋巴结转移的CRC肿瘤组织中表达水平更高。与癌旁组织（包括有、无淋巴结转移）比较，
表2
饮食习惯与CRC患者NCOA4以及ferritin表达水平的相关性（例）
2.2 高浓度葡萄糖抑制铁自噬并促进CRC细胞侵袭转移
研究[12]表明高浓度葡萄糖具有抑制铁自噬并促进多种人类恶性肿瘤细胞增殖分化的作用。为了分析高浓度葡萄糖对HT29和HCT116 CRC细胞铁自噬的调节作用以及对细胞增殖分化的影响，本研究以不同浓度葡萄糖处理CRC细胞系，结果如图2a所示：高浓度葡萄糖显著促进CRC细胞的增殖分化，其效果随葡萄糖浓度的增加（0、35、70、105、140 mmol/L）变得更加显著。细胞毒性实验分析结果如图2b所示，当葡萄糖浓度达到140 mmol/L处理时，结肠癌细胞表现出显著的细胞毒性作用。因此，后续实验中采用105 mmol/L作为最适浓度。如图2c所示，与对照组相比，高糖组HT29和HCT116细胞中自噬小体数量显著减少；在图2d～2g所示的western blot实验中，高浓度葡萄糖处理显著下调HT29和HCT116细胞的NCOA4表达，促进ferritin表达。在细胞划痕（图2h～2j）和侵袭小室实验（图2k～2n）中，本研究发现以高浓度葡萄糖培养HT29和HCT116细胞后显著提高细胞的迁移侵袭能力：与对照组比较，高糖组HT29和HCT116的划痕愈合度较低（P<0.05）、迁移和侵袭细胞数较高（P<0.05）。
图2
示高浓度葡萄糖抑制铁自噬并促进CRC细胞侵袭转移
a：高浓度葡萄糖呈浓度依赖性促进CRC细胞的增殖分化；b：当葡萄糖浓度达到140 mmol/L时，结肠癌细胞表现出显著的细胞毒性作用；c：高糖组HT29和HCT116细胞中自噬小体数量显著减少，黑箭所指为自噬小体；d～g：HT29和HCT116细胞中，高浓度葡萄糖处理均下调NCOA4表达，促进ferritin表达；h～j：细胞划痕实验表明高浓度葡萄糖促进CRC细胞迁移（h、i：×10）；k～n：细胞迁移与侵袭实验证实高浓度葡萄糖促进CRC细胞的迁移侵袭（k、m：结晶紫染色 ×100）；与对照组相比，*
2.3 mTOR/RAGE信号通路参与调控高浓度葡萄糖抑制铁自噬，促进CRC细胞侵袭转移
为了验证高浓度葡萄糖通过调控mTOR/RAGE信号通路抑制铁自噬、促进CRC细胞侵袭转移过程，本研究以高浓度葡萄糖和RAGE特异性siRNAs处理HT29和HCT116细胞。如图3a所示，与对照组相比，高糖组HT29和HCT116细胞的自噬小体显著减少，si-RAGE组HT29和HCT116细胞内自噬小体显著增多；与高糖组比较，高糖+si-RAGE组HT29和HCT116细胞中自噬小体显著增多。如图3b～3e所示，与对照组比较，高糖组HT29和HCT116细胞中RAGE、p-mTOR、ferritin表达上调（P<0.001），NCOA4表达下调（P<0.001）；si-RAGE组RAGE、mTOR、ferritin表达下调（P<0.001），NCOA4表达上调（P<0.001）。与高糖组比较，高糖+si-RAGE组RAGE、p-mTOR、ferritin表达下调（P<0.001），NCOA4表达上调（P<0.001）。结果表明，高浓度葡萄糖下调CRC细胞NCOA4表达，促进p-mTOR、RAGE以及ferritin表达；si-RAGE处理后CRC细胞NCOA4表达上调，p-mTOR、RAGE以及ferritin表达下调；重要的是，在si-RAGE处理CRC细胞后，高浓度葡萄糖对CRC细胞NCOA4表达的抑制效果以及对p-mTOR、RAGE和ferritin表达的促进作用均显著减弱。
图3
示高浓度葡萄糖激活mTOR/RAGE信号通路，抑制铁自噬，促进CRC细胞侵袭转移
a：与对照组比较，高糖组HT29和HCT116细胞内自噬小体显著减少，si-RAGE组细胞内自噬小体显著增多，而与高糖组比较，高糖+si-RAGE组细胞内自噬小体数量增多（黑箭所指为自噬小体）。b～e：与对照组比较，高糖组HT29和HCT116细胞中NCOA4表达下调，p-mTOR、RAGE以及ferritin表达上调，si-RAGE组NCOA4表达上调，p-mTOR、RAGE以及ferritin表达下调；而与高糖组比较，高糖+si-RAGE组细胞中NCOA4表达上调，p-mTOR、RAGE和ferritin表达下调。f～g：细胞划痕实验表明与对照组比较，高糖组HT29和HCT116细胞的划痕愈合度较低，si-RAGE组较高；与高糖组比较，高糖+si-RAGE组的划痕愈合度较高（ ×10）。h～j：细胞迁移与侵袭实验表明，与对照组比较，高糖组HT29和HCT116细胞的迁移侵袭数量高，si-RAGE组较低；与高糖组比较，高糖+si-RAGE组的迁移侵袭数量较低（结晶紫染色 ×100）。与对照组相比，*
在细胞划痕（图3f～3g）中，与对照组比较，高糖组HT29和HCT116细胞的划痕愈合度较低（P<0.05），si-RAGE组较高（P<0.05）；与高糖组比较，高糖+si-RAGE组的划痕愈合度较高（P<0.05）。在迁移侵袭小室实验（图3h～3j）中，与对照组比较，高糖组的迁移侵袭数量高（P<0.05），si-RAGE组较低（P<0.05）；与高糖组比较，高糖+si-RAGE组的迁移侵袭数量较低（P<0.05）。表明高浓度葡萄糖显著提高了CRC细胞的迁移侵袭能力，si-RAGE处理后CRC细胞迁移侵袭能力降低；在沉默CRC细胞RAGE表达后，高浓度葡萄糖对CRC细胞迁移和侵袭能力的促进作用均显著减弱。上述实验结果表明，mTOR/RAGE信号通路参与调控高浓度葡萄糖抑制铁自噬，促进CRC细胞侵袭转移。
2.4 高浓度葡萄糖调控的铁自噬参与促进CRC细胞侵袭转移
为了验证高浓度葡萄糖调控的铁自噬参与促进CRC细胞侵袭转移过程，本研究以高浓度葡萄糖和铁自噬激活剂雷帕霉素处理HT29和HCT116细胞。如图4a所示，与对照组相比，高糖组HT29和HCT116细胞的自噬小体显著减少，雷帕霉素组细胞内自噬小体显著增多；与高糖组比较，高糖+雷帕霉素组细胞的自噬小体明显增加，提示雷帕霉素削弱了高浓度葡萄糖对CRC细胞铁自噬的抑制作用。图4b～4e western blot实验结果表明，与对照组比较，高糖组HT29和HCT116细胞中NCOA4表达下调（P<0.05），ferritin表达上调（P<0.05）；雷帕霉素组NCOA4表达上调（P<0.05），ferritin表达下调（P<0.05）；与高糖组比较，高糖+雷帕霉素组NCOA4表达上调（P<0.05），ferritin表达下调（P<0.05），提示在雷帕霉素处理CRC细胞后，高浓度葡萄糖对CRC细胞NCOA4表达的抑制效果以及对ferritin表达的促进作用均显著减弱。
图4
示高浓度葡萄糖调控的铁自噬促进CRC细胞侵袭转移
a：与对照组比较，高糖组HT29和HCT116细胞内自噬小体显著减少，雷帕霉素组细胞内自噬小体显著增多，而与高糖组比较，高糖+雷帕霉素组细胞内自噬小体数量增多（黑箭所指为自噬小体）。b～e：与对照组比较，高糖组HT29和HCT116细胞中NCOA4表达下调、ferritin表达上调，雷帕霉素组NCOA4表达上调、ferritin表达下调；与高糖组比较，高糖+雷帕霉素组细胞中NCOA4表达上调，ferritin表达下调。f～g：细胞划痕实验表明与对照组比较，高糖组HT29和HCT116细胞的划痕愈合度较高，雷帕霉素组较低；与高糖组比较，高糖+雷帕霉素组的划痕愈合度较低（ ×10）。h～j：细胞迁移与侵袭实验表明与对照组比较，高糖组HT29和HCT116细胞的迁移侵袭数量高，雷帕霉素组较低；与高糖组比较，高糖+雷帕霉素组的迁移侵袭数量较低（结晶紫染色 ×100）。与对照组比较，*
在细胞划痕（图4f～4g）中，与对照组比较，高糖组HT29和HCT116细胞的划痕愈合度较低（P<0.05），雷帕霉素组较高（P<0.05）；与高糖组比较，高糖+雷帕霉素组的划痕愈合度较高（P<0.05）。在迁移侵袭小室实验（图4h～4j）中，与对照组比较，高糖组的迁移侵袭数量高（P<0.05），雷帕霉素组较低（P<0.05）；与高糖组比较，高糖+雷帕霉素组的迁移侵袭数量较低（P<0.05）。提示高浓度葡萄糖显著提高了CRC细胞的迁移侵袭能力，雷帕霉素处理后CRC细胞迁移侵袭能力降低；在雷帕霉素处理CRC细胞后，高浓度葡萄糖对CRC细胞迁移和侵袭能力的促进作用均显著减弱。以上实验结果表明，高浓度葡萄糖环境下抑制的铁自噬参与促进CRC细胞侵袭转移。
2.5 高糖饮食通过mTOR/RAGE信号通路促进大鼠CRC发生发展
本研究采用AOM诱导的大鼠原位CRC模型进一步验证高糖饮食通过mTOR/RAGE信号通路抑制铁自噬，促进CRC发生发展过程。如图5a所示，与对照组相比，高糖饮食组大鼠的结直肠肿瘤数量增多（P<0.05）。如图5b和5c所示，对照组大鼠结直肠肿瘤组织可见典型的黏膜内癌，肿瘤呈现不规则腺体结构，可见典型的异型性细胞核；高糖饮食组大鼠肿瘤组织中黏膜内癌的分化程度显著降低，腺体结构严重不规则，炎性细胞的浸润情况较对照组明显增加，细胞核异型性明显增加。为进一步明确高糖饮食对大鼠CRC形成的促进机制，本研究通过RT-qPCR方法检测2组大鼠结直肠组织中NCOA4、ferritin、RAGE以及mTOR的表达情况，如图5d～5g所示：与对照组相比，高糖饮食组大鼠结直肠肿瘤组织中NCOA4表达水平降低（P<0.05），ferritin、RAGE以及mTOR表达水平增高（P<0.05）。以上实验结果表明高糖饮食通过mTOR/RAGE信号通路抑制铁自噬，促进实验动物CRC发生发展。
图5
示高糖饮食激活mTOR/RAGE信号通路，促进大鼠CRC发生发展
a：与对照组相比，高糖饮食组大鼠结直肠肿瘤数量增多。b、c：肿瘤组织HE染色示对照组大鼠（b）结直肠肿瘤组织可见典型的黏膜内癌，肿瘤呈现不规则腺体结构，可见典型的异型性细胞核；高糖饮食组大鼠（c）肿瘤组织中黏膜内癌的分化程度显著降低，腺体结构严重不规则，炎性细胞的浸润情况较对照组明显增加，细胞核异型性明显增加（HE ×400）。d～g：与对照组相比，高糖饮食组大鼠结直肠肿瘤组织中NCOA4表达水平降低（d），ferritin（e）、RAGE（f）以及mTOR（g）表达水平增高。与对照组相比，*
3 讨论
碳水化合物是日常膳食的重要组成部分，作为细胞结构的主要成分和主要供能物质，可调节人体细胞活动、肠道菌群结构、表观遗传和内分泌代谢，由此调控人类恶性肿瘤的发生发展[13-14]。葡萄糖是人类日常膳食中最常见的单糖，Miles等[15]对包含22 720例男性的癌症筛查样本库进行数据分析后发现，精制糖的摄入量与前列腺癌患病风险存在正相关性。另有研究表明过量精制糖的摄入可能增加非酒精性肝硬化相关肝癌的发生风险[16]。一项针对欧洲人群的流行病学研究[4]提示，精制糖的摄入量与男性群体的CRC发生存在低度正相关性，与女性群体存在中度正相关性。近期发表于Science的研究[5]表明：敲除APC基因的小鼠经长期喂食高果糖饮食后，CRC肿瘤体积显著增大、恶性程度更高，提示长期过量精制糖的摄入可能是CRC发生发展的独立危险因素。本研究通过分析收集的CRC患者临床病例资料发现，日常生活中碳水化合物摄入量偏高的患者更容易出现淋巴结转移和较晚的TNM分期，并且其肿瘤组织中铁自噬水平相对较低。越来越多的研究表明，铁自噬是细胞铁死亡和自噬之间非常重要的对话方式，敲除铁自噬关键蛋白NCOA4或自噬关键蛋白（autophagy-related gene，ATG），均会导致铁自噬被抑制，进而抑制铁死亡[17-18]，这也是铁自噬被用来发挥抑制肿瘤细胞增殖分化的理论基础[19]。本实验中，笔者在CRC原位动物模型和CRC细胞系中均证实了猜测，即高浓度葡萄糖具有抑制CRC细胞铁自噬的作用，本研究发现以自噬激活剂雷帕霉素激活CRC细胞铁自噬后，高浓度葡萄糖对CRC细胞迁移和侵袭能力的增强作用显著减弱，这表明高浓度葡萄糖环境下抑制的铁自噬参与促进了CRC细胞的侵袭转移。然而，本研究也存在不足：雷帕霉素是细胞自噬的激活剂，并非铁自噬的特异性激活剂，因此雷帕霉素激活了包括但不限于铁自噬的全部自噬，在今后的研究中笔者将进一步采用特异性铁自噬激活剂深入挖掘高浓度葡萄糖环境下抑制的铁自噬对CRC细胞侵袭转移的影响。
基于肿瘤细胞Warburg效应下的糖代谢特点，肿瘤细胞增殖速率与可利用碳水化合物的摄入量存在正相关性[20]。过量碳水化合物的摄入导致体内葡萄糖与蛋白质、脂质或核酸的自由氨基经过一系列复杂的非酶触反应，形成大量晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs），其受体RAGE随着AGEs的升高而积聚，二者相互作用具有促进肿瘤生长、滋养血管形成及肿瘤转移的作用[21]。同时，AGEs/RAGE信号也是细胞自噬和铁死亡程序的关键调控因子。有研究[22]报道枫树糖浆通过抑制AGEs/RAGE信号激活抑制CRC细胞自噬，进而发挥抑制CRC细胞增殖分化的作用。有趣的是，高糖环境下AGEs/RAGE信号被异常激活，其介导的铁死亡程序参与调控2型糖尿病的发生进展[23]。本研究结果表明，沉默CRC细胞RAGE表达后，CRC细胞铁自噬被激活，细胞迁移侵袭能力降低；更重要的是，在沉默CRC细胞RAGE表达后，高浓度葡萄糖对CRC细胞铁自噬的抑制作用被削弱，对CRC细胞迁移和侵袭能力的促进作用也随之减弱。本动物实验同样表明，经高糖喂养的大鼠结直肠肿瘤数量明显增多，黏膜内癌的分化程度更低，铁自噬显著被抑制，RAGE表达量异常增高。
铁自噬是由NCOA4作为伴侣分子所介导的一种特异性自噬，NCOA4通过特异性地识别结合细胞内结合铁离子的铁蛋白，并将其转运至溶酶体降解并释放出游离铁离子。铁蛋白是细胞内铁离子储存的重要结构，由铁蛋白重链（ferritin heavy chain）和轻链（ferritin light chain）亚基组成铁蛋白复合体[24]。研究[25]表明，细胞铁死亡过程中所依赖的铁离子来自铁自噬释放的铁离子，因此铁死亡被认为属于自噬依赖的细胞死亡过程。众所周知，mTOR信号是调控自噬的关键分子，有研究[26]表明酚甲烷通过诱导肾小管上皮细胞铁死亡导致肾损伤，这一过程需要mTOR/UNC51样激酶1（UNC51-like kinase-1，ULK1）信号通路介导的铁自噬参与。高糖通过激活单磷酸腺苷依赖蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）/mTOR信号通路诱导成骨细胞铁自噬进而促进细胞铁死亡，加重2型糖尿病患者的骨质疏松[27]。纳米氧化锌通过AMPK/mTOR信号通路调节铁自噬促进血管内皮细胞铁死亡[28]。本研究结果表明，高浓度葡萄糖导致mTOR信号磷酸化激活，抑制CRC细胞铁自噬，增强CRC细胞的迁移和侵袭能力；在沉默CRC细胞RAGE表达后，高浓度葡萄糖对CRC细胞mTOR信号的激活效果、对铁自噬的抑制作用以及对CRC细胞迁移和侵袭能力的促进作用均被削弱。本研究尚存在一些不足：本研究采用RT-qPCR方法检测大鼠结直肠组织中NCOA4、ferritin、RAGE以及mTOR的mRNA表达情况，并未对上述基因蛋白表达情况进行检测，在今后的研究中笔者将进一步对NCOA4、ferritin、RAGE以及mTOR在大鼠结直肠组织中的蛋白表达情况进行分析。
综上所述，本研究结果证实高糖饮食促进CRC发生发展，CRC细胞长期暴露高糖环境下后铁自噬被抑制，导致CRC细胞的迁移侵袭能力增强，其作用机制与mTOR/RAGE信号通路的异常激活及过度磷酸化密切相关。本研究揭示了长期高碳水化合物饮食促进CRC发展的潜在机制，丰富了国民对健康饮食降低CRC患病的认识，为通过改善饮食习惯从而寻求针对CRC的预防提供了理论依据。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：乔鹏飞完成实验设计；熊枭、陈豪、李元亮、唐研共同进行实验、收集数据并做统计分析；乔鹏飞、熊枭和张好刚共同完成论文写作。
伦理声明：本研究已通过哈尔滨医科大学附属第二医院伦理委员会的伦理审核批准（批文编号：KY2020-122）。
