引用本文： 张志坚, 董瑶瑶, 吴灿, 首云峰, 何有虎, 彭礼波. 百草枯致大鼠肺纤维化肺组织内质网相关凋亡基因Caspase-12的表达. 中国呼吸与危重监护杂志, 2014, 13(3): 268-272. doi: 10.7507/1671-6205.2014064 复制
百草枯属于高效吡啶类接触性除草剂，因其除草效果好，价格便宜，在我国农村应用广泛。百草枯对人畜均有较强毒性，因其缺乏有效治疗措施，中毒后死亡率极高，严重危害生命健康。由于肺脏为其特异的靶器官，因此肺损伤是百草枯中毒后最突出的临床表现且进展迅速，后期多不可逆发生肺纤维化，患者多死于严重呼吸衰竭 [1-2]。迄今为止百草枯中毒的机制尚未完全明了，因此继续研究中毒机制，找到治疗的靶点是当前亟待解决的难题。
细胞凋亡是百草枯中毒后脏器损伤的重要机制之一，在百草枯中毒后肺、肾、脑及亚细胞器损伤的发生发展中占有重要地位[3-6]。内质网应激介导的细胞凋亡途径是较重要的细胞凋亡途径之一，而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(Caspase-12)途径是内质网应激诱导凋亡的重要途径[7]。本研究通过免疫组化、聚合酶链反应检测百草枯诱导肺纤维化大鼠模型Caspase-12的表达，从而为百草枯中毒的治疗提供新方向。
对象与方法
一 材料
1.主要实验试剂及仪器：20%百草枯溶液由先正达(中国)投资有限公司提供；Caspase-12抗体购自武汉博士德公司；β-actin抗体、总蛋白提取试剂盒、ABC试剂盒、免疫组化染色试剂盒由北京博奥森生物技术有限公司提供；TRLAOL，RT试剂盒购自Invitrogen公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。PCR仪为德国Eppendorf公司产品；LOGENE PAS900病理图像分析系统为无锡朗伽生物工程有限公司产品。
2.实验动物分组及模型制作：30只清洁级雄性Spragne-Dawley(SD)大鼠，体质量(220±40) g，由第三军医大学提供。将实验动物随机分为正常对照组(14 d对照组和28 d对照组，各5只大鼠)，14 d模型组、28 d模型组，每组10只大鼠。模型组参照文献[8]百草枯灌胃法诱导肺纤维化模型。
二 方法
1.肺组织采集：按预定时间点称重后处死动物。分离主支气管并向下剥离后取出全肺，无菌生理盐水冲洗，滤纸吸干并称重，计算肺系数(肺湿重/活体重)。取右肺中叶4%中性甲醛溶液固定48 h后转移至0.1 mol/L PBS溶液中保存，待行肺组织病理学形态及免疫组化检测。左肺中叶取下后-80 ℃保存，用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)Caspase-12。
2.肺组织病理学观察：按常规病理学方法对肺组织进行固定、包埋、切片。分别进行苏木精-伊红(HE)染色和Masson染色后镜下观察。按文献[9]研究标准评价肺泡炎及肺纤维化程度。
3.肺组织Caspase-12蛋白免疫组织化学检测：多聚甲醛固定24 h(4 ℃)肺组织进行逐级脱水、透明、浸蜡、包埋，切片，随后按说明书进行免疫组化染色，结果以胞浆出现棕色或棕黄色为阳性，于200倍光镜下用图像分析系统测量其吸光度，每张切片随机检测5个视野，计算出平均吸光度值(MOD)，以MOD作为Caspase-12表达水平的半定量参数。
4.肺组织Caspase-12 mRNA表达检测：取左肺组织100 mg按试剂盒说明书用Trizol提取总RNA，逆转录合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)，再进行PCR扩增。Caspase-12上游引物为(扩增产物438bpm)5′-CCTGGAAGGAATCTGTGG-3′，下游引物为5′-AGTTCACCTGGGACCTCA-3′；β-actin上游引物为(扩增产物260bpm)5′-GAGACCTTCAACACC CCAGC-3′，下游引物为5′-ATGTCACGCACGATT TCCC-3′。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，72 ℃延伸5 min。扩增产物5 μL经1.5%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶图像分析仪扫描图像，再进行吸光度分析。
三 统计学处理
所有数据采用SPSS 16.0统计软件分析，计量资料以
结果
一 动物一般情况与体量变化
模型组在百草枯灌胃后第1 d出现活动减少，精神萎靡不振，摄食差，体质量增加缓慢；对照组大鼠精神、食欲可，活动敏捷，体质量增加明显。14 d对照组和14 d模型组体重分别为(269.1±4.7) g和(231.8±3.8)g，二者比较差异有统计学意义(P＜0.05)；28 d对照组和28 d模型组体重分别为(305.7±8.8)g和(241.2±5.4)g，二者比较差异有统计学意义(P＜0.01)。
二 肺组织病理学改变
石蜡切片HE、Masson染色光镜观察肺泡炎和纤维化程度。对照组肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺泡间隔正常，肺泡腔内无炎性细胞浸润，可见少许胶原纤维增生。模型组光镜下见肺间质和肺泡水肿，可见大量炎性细胞浸润，间质不同程度增生，肺泡腔结构破坏，可见胶原纤维增生，且28 d模型组大鼠胶原纤维增生更明显，肺泡炎及肺纤维化程度更明显。结果见图 1和表 1。
图1
各组大鼠肺组织HE染色病理学图(×200) a.对照组28 d；b.模型组14 d；c.模型组28 d
图2
各组大鼠肺组织Masson染色病理学图(×200) a.对照组28 d；b.模型组14 d；c.模型组28 d
表1
各组大鼠肺泡炎变及肺纤维化程度比较(n=10，三 Caspase-12 mRNA在肺组织中表达
对照组大鼠肺组织中Caspase-12 mRNA表达最低，14 d模型组较对照组明显升高(P＜0.01)，28 d模型组较14 d模型组明显增高(P＜0.01)。结果见图 3和表 2。
图3
各组大鼠肺组织Caspase-12 mRNA表达
1：对照组；2：14 d模型组；3：28 d模型组
图4
各组大鼠肺组织Caspase-12蛋白表达(×200) a.对照组28 d；b.模型组14 d；c.模型组28 d
表2
各组大鼠肺组织Caspase-12 mRNA表达(n=10，四 肺组织中Caspase-12蛋白表达
对照组仅有少数细胞胞浆黄染；14 d模型组肺组织细胞中可见大量Caspase-12阳性表达呈棕黄色；28 d模型组阳性表达较14 d模型组明显增加。结果见图 4和表 3。
表3
各组大鼠肺组织Caspase-12平均吸光度值变化(n=10，MOD值，讨论
研究表明百草枯进入机体后，即使轻微肺损伤仍能引起较长时间的限制性肺功能损伤，最终多出现不可逆的肺间质纤维化，对存活患者生存质量构成极大的危害[10]。百草枯中毒机制仍然尚不十分明确，而传统治疗百草枯中毒策略中抗氧自由基、拮抗炎症反应如大剂量糖皮质激素、细胞毒性药物使用，新的治疗措施如持续血液净化等均没有令人满意的效果。故进一步研究百草枯中毒肺损伤的相关机制，寻找治疗肺纤维化的靶点仍是目前需要解决的问题。
目前研究认为百草枯进入体内后可通过多途径、多机制损伤其靶器官肺组织。而百草枯中毒所致的DNA损伤、基因异常表达，最终引起组织细胞凋亡在其中起到相当重要的作用[11]。细胞凋亡由十分复杂的信号通路调控，目前研究较多的如线粒体通路、死亡受体通路和内质网应激介导细胞凋亡通路。内质网作为真核细胞内蛋白质(膜蛋白和分泌蛋白)合成、加工、转运和钙离子浓度调节的主要部位，也是多肽链正确折叠与装配、参与脂质代谢和类固醇激素合成的重要场所。研究发现，多种因素可导致内质网稳态破坏。当新合成的蛋白质N末端糖基化、二硫键形成及蛋白质由内质网向高尔基体转运受阻时，非折叠或错误折叠的新合成蛋白质在内质网中大量堆积，或者钙稳态被打破等，都会损伤内质网正常生理功能，这种变化称为内质网应激(endoplasmic reticulum stresss，ER stresss)[12-13]。内质网应激诱导细胞凋亡有3个主要的途径，包括CHOP通路(C/EBP homologous protein，C/EBP同源蛋白)、JNK通路(c-Jun氨基末端激酶通路)和Caspase-12通路。其中Caspase-12通路又是内质网应激诱导细胞凋亡的主要途径之一[14-15]。近年研究也发现内质网应激可能是介导气道结构细胞发生凋亡的重要途径，其活化机制包括钙依赖的calpain活化机制、肿瘤坏死因子受体相关因子2依赖性机制、Caspase-7 ER转位机制及GRP78、Caspase-7、Caspase-12复合物途径[16-17]。
本实验采用百草枯灌胃法复制大鼠肺纤维化模型，利用石蜡切片HE、Masson染色光镜观察肺泡炎和纤维化程度。发现模型组光镜下肺间质和肺泡水肿明显，可见大量炎性细胞浸润，间质不同程度增生，肺泡腔结构破坏，可见胶原纤维增生，且28 d模型组大鼠胶原纤维增生更明显，肺泡炎及肺纤维化程度更明显，表明模型复制成功。
本研究对大鼠肺组织Caspase-12进行免疫组织化学法观察其蛋白表达，模型组MOD值与对照组比较明显增加，且随着时间的推移MOD值明显增强。进而又对大鼠Caspase-12 mRNA进行检测，得出同样的结论，28 d模型组与14 d模型组比较，差异有显著差异(P＜0.01)。上述结果表明百草枯中毒后由于存在大量活性氧的形成，可活化肺泡上皮细胞中Caspase-12蛋白表达，肺泡上皮细胞发生了内质网应激诱导的细胞凋亡，促进肺纤维化的发生发展。
综上所述，内质网应激可能在百草枯诱导肺纤维化肺泡细胞凋亡中起重要作用，但我们还不能完全判断不同肺组织、肺细胞中Caspase-12基因表达情况。如果进一步研究中能明确该机制，则有望探索出一套程序来识别肺间质纤维化治疗的靶点，同时可利用激动剂或拮抗剂来干预信号关键调控点治疗肺纤维化，可能为百草枯中毒肺损伤带来新的希望。
百草枯属于高效吡啶类接触性除草剂，因其除草效果好，价格便宜，在我国农村应用广泛。百草枯对人畜均有较强毒性，因其缺乏有效治疗措施，中毒后死亡率极高，严重危害生命健康。由于肺脏为其特异的靶器官，因此肺损伤是百草枯中毒后最突出的临床表现且进展迅速，后期多不可逆发生肺纤维化，患者多死于严重呼吸衰竭 [1-2]。迄今为止百草枯中毒的机制尚未完全明了，因此继续研究中毒机制，找到治疗的靶点是当前亟待解决的难题。
细胞凋亡是百草枯中毒后脏器损伤的重要机制之一，在百草枯中毒后肺、肾、脑及亚细胞器损伤的发生发展中占有重要地位[3-6]。内质网应激介导的细胞凋亡途径是较重要的细胞凋亡途径之一，而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(Caspase-12)途径是内质网应激诱导凋亡的重要途径[7]。本研究通过免疫组化、聚合酶链反应检测百草枯诱导肺纤维化大鼠模型Caspase-12的表达，从而为百草枯中毒的治疗提供新方向。
对象与方法
一 材料
1.主要实验试剂及仪器：20%百草枯溶液由先正达(中国)投资有限公司提供；Caspase-12抗体购自武汉博士德公司；β-actin抗体、总蛋白提取试剂盒、ABC试剂盒、免疫组化染色试剂盒由北京博奥森生物技术有限公司提供；TRLAOL，RT试剂盒购自Invitrogen公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。PCR仪为德国Eppendorf公司产品；LOGENE PAS900病理图像分析系统为无锡朗伽生物工程有限公司产品。
2.实验动物分组及模型制作：30只清洁级雄性Spragne-Dawley(SD)大鼠，体质量(220±40) g，由第三军医大学提供。将实验动物随机分为正常对照组(14 d对照组和28 d对照组，各5只大鼠)，14 d模型组、28 d模型组，每组10只大鼠。模型组参照文献[8]百草枯灌胃法诱导肺纤维化模型。
二 方法
1.肺组织采集：按预定时间点称重后处死动物。分离主支气管并向下剥离后取出全肺，无菌生理盐水冲洗，滤纸吸干并称重，计算肺系数(肺湿重/活体重)。取右肺中叶4%中性甲醛溶液固定48 h后转移至0.1 mol/L PBS溶液中保存，待行肺组织病理学形态及免疫组化检测。左肺中叶取下后-80 ℃保存，用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)Caspase-12。
2.肺组织病理学观察：按常规病理学方法对肺组织进行固定、包埋、切片。分别进行苏木精-伊红(HE)染色和Masson染色后镜下观察。按文献[9]研究标准评价肺泡炎及肺纤维化程度。
3.肺组织Caspase-12蛋白免疫组织化学检测：多聚甲醛固定24 h(4 ℃)肺组织进行逐级脱水、透明、浸蜡、包埋，切片，随后按说明书进行免疫组化染色，结果以胞浆出现棕色或棕黄色为阳性，于200倍光镜下用图像分析系统测量其吸光度，每张切片随机检测5个视野，计算出平均吸光度值(MOD)，以MOD作为Caspase-12表达水平的半定量参数。
4.肺组织Caspase-12 mRNA表达检测：取左肺组织100 mg按试剂盒说明书用Trizol提取总RNA，逆转录合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)，再进行PCR扩增。Caspase-12上游引物为(扩增产物438bpm)5′-CCTGGAAGGAATCTGTGG-3′，下游引物为5′-AGTTCACCTGGGACCTCA-3′；β-actin上游引物为(扩增产物260bpm)5′-GAGACCTTCAACACC CCAGC-3′，下游引物为5′-ATGTCACGCACGATT TCCC-3′。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，72 ℃延伸5 min。扩增产物5 μL经1.5%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶图像分析仪扫描图像，再进行吸光度分析。
三 统计学处理
所有数据采用SPSS 16.0统计软件分析，计量资料以
结果
一 动物一般情况与体量变化
模型组在百草枯灌胃后第1 d出现活动减少，精神萎靡不振，摄食差，体质量增加缓慢；对照组大鼠精神、食欲可，活动敏捷，体质量增加明显。14 d对照组和14 d模型组体重分别为(269.1±4.7) g和(231.8±3.8)g，二者比较差异有统计学意义(P＜0.05)；28 d对照组和28 d模型组体重分别为(305.7±8.8)g和(241.2±5.4)g，二者比较差异有统计学意义(P＜0.01)。
二 肺组织病理学改变
石蜡切片HE、Masson染色光镜观察肺泡炎和纤维化程度。对照组肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺泡间隔正常，肺泡腔内无炎性细胞浸润，可见少许胶原纤维增生。模型组光镜下见肺间质和肺泡水肿，可见大量炎性细胞浸润，间质不同程度增生，肺泡腔结构破坏，可见胶原纤维增生，且28 d模型组大鼠胶原纤维增生更明显，肺泡炎及肺纤维化程度更明显。结果见图 1和表 1。
图1
各组大鼠肺组织HE染色病理学图(×200) a.对照组28 d；b.模型组14 d；c.模型组28 d
图2
各组大鼠肺组织Masson染色病理学图(×200) a.对照组28 d；b.模型组14 d；c.模型组28 d
表1
各组大鼠肺泡炎变及肺纤维化程度比较(n=10，三 Caspase-12 mRNA在肺组织中表达
对照组大鼠肺组织中Caspase-12 mRNA表达最低，14 d模型组较对照组明显升高(P＜0.01)，28 d模型组较14 d模型组明显增高(P＜0.01)。结果见图 3和表 2。
图3
各组大鼠肺组织Caspase-12 mRNA表达
1：对照组；2：14 d模型组；3：28 d模型组
图4
各组大鼠肺组织Caspase-12蛋白表达(×200) a.对照组28 d；b.模型组14 d；c.模型组28 d
表2
各组大鼠肺组织Caspase-12 mRNA表达(n=10，四 肺组织中Caspase-12蛋白表达
对照组仅有少数细胞胞浆黄染；14 d模型组肺组织细胞中可见大量Caspase-12阳性表达呈棕黄色；28 d模型组阳性表达较14 d模型组明显增加。结果见图 4和表 3。
表3
各组大鼠肺组织Caspase-12平均吸光度值变化(n=10，MOD值，讨论
研究表明百草枯进入机体后，即使轻微肺损伤仍能引起较长时间的限制性肺功能损伤，最终多出现不可逆的肺间质纤维化，对存活患者生存质量构成极大的危害[10]。百草枯中毒机制仍然尚不十分明确，而传统治疗百草枯中毒策略中抗氧自由基、拮抗炎症反应如大剂量糖皮质激素、细胞毒性药物使用，新的治疗措施如持续血液净化等均没有令人满意的效果。故进一步研究百草枯中毒肺损伤的相关机制，寻找治疗肺纤维化的靶点仍是目前需要解决的问题。
目前研究认为百草枯进入体内后可通过多途径、多机制损伤其靶器官肺组织。而百草枯中毒所致的DNA损伤、基因异常表达，最终引起组织细胞凋亡在其中起到相当重要的作用[11]。细胞凋亡由十分复杂的信号通路调控，目前研究较多的如线粒体通路、死亡受体通路和内质网应激介导细胞凋亡通路。内质网作为真核细胞内蛋白质(膜蛋白和分泌蛋白)合成、加工、转运和钙离子浓度调节的主要部位，也是多肽链正确折叠与装配、参与脂质代谢和类固醇激素合成的重要场所。研究发现，多种因素可导致内质网稳态破坏。当新合成的蛋白质N末端糖基化、二硫键形成及蛋白质由内质网向高尔基体转运受阻时，非折叠或错误折叠的新合成蛋白质在内质网中大量堆积，或者钙稳态被打破等，都会损伤内质网正常生理功能，这种变化称为内质网应激(endoplasmic reticulum stresss，ER stresss)[12-13]。内质网应激诱导细胞凋亡有3个主要的途径，包括CHOP通路(C/EBP homologous protein，C/EBP同源蛋白)、JNK通路(c-Jun氨基末端激酶通路)和Caspase-12通路。其中Caspase-12通路又是内质网应激诱导细胞凋亡的主要途径之一[14-15]。近年研究也发现内质网应激可能是介导气道结构细胞发生凋亡的重要途径，其活化机制包括钙依赖的calpain活化机制、肿瘤坏死因子受体相关因子2依赖性机制、Caspase-7 ER转位机制及GRP78、Caspase-7、Caspase-12复合物途径[16-17]。
本实验采用百草枯灌胃法复制大鼠肺纤维化模型，利用石蜡切片HE、Masson染色光镜观察肺泡炎和纤维化程度。发现模型组光镜下肺间质和肺泡水肿明显，可见大量炎性细胞浸润，间质不同程度增生，肺泡腔结构破坏，可见胶原纤维增生，且28 d模型组大鼠胶原纤维增生更明显，肺泡炎及肺纤维化程度更明显，表明模型复制成功。
本研究对大鼠肺组织Caspase-12进行免疫组织化学法观察其蛋白表达，模型组MOD值与对照组比较明显增加，且随着时间的推移MOD值明显增强。进而又对大鼠Caspase-12 mRNA进行检测，得出同样的结论，28 d模型组与14 d模型组比较，差异有显著差异(P＜0.01)。上述结果表明百草枯中毒后由于存在大量活性氧的形成，可活化肺泡上皮细胞中Caspase-12蛋白表达，肺泡上皮细胞发生了内质网应激诱导的细胞凋亡，促进肺纤维化的发生发展。
综上所述，内质网应激可能在百草枯诱导肺纤维化肺泡细胞凋亡中起重要作用，但我们还不能完全判断不同肺组织、肺细胞中Caspase-12基因表达情况。如果进一步研究中能明确该机制，则有望探索出一套程序来识别肺间质纤维化治疗的靶点，同时可利用激动剂或拮抗剂来干预信号关键调控点治疗肺纤维化，可能为百草枯中毒肺损伤带来新的希望。
