引用本文： 张向峰, 刘芬, 朱光发, 王增智. 重组骨桥蛋白通过抑制核因子κB和基质金属蛋白酶2和9减轻高氧急性肺损伤. 中国呼吸与危重监护杂志, 2014, 13(4): 364-369. doi: 10.7507/1671-6205.2014089 复制
临床上往往通过氧疗来纠正呼吸衰竭，有时必须吸入较高浓度的氧才能维持适当的动脉血氧分压和血氧饱和度，然而长时间吸入高浓度的氧(＞60%)可导致肺损伤。急性肺损伤的发生机制尚未完全阐明，除了氧自由基对肺泡膜的直接损伤外，更重要的是多种炎症细胞(巨噬细胞、中性粒细胞、血小板)及其释放的炎性介质和蛋白酶类如明胶酶介导的肺部炎症反应，通过降解细胞基底膜的主要组分Ⅳ型胶原，从而在细胞外基底膜的转复中发挥重要作用[1-2]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的组织抑制酶类--基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)是主要抑制该类酶的物质，它们之间的平衡对于维持细胞外基质的结构完整及功能正常具有重要作用[3]。核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是普遍存在于真核细胞中的一个转录因子，在炎症反应的细胞因子网络调节中起关键作用。高氧作为一种刺激因素，可激活中性粒细胞或肺组织中的NF-κB，肺组织中NF-κB被激活的同时，伴有IL-1β、TNF-α及明胶酶等mRNA表达增高，且这些mRNA均受NF-κB控制。因此，如果能够抑制NF-κB活化将有利于肺保护，减轻肺部炎性反应[4]。骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是一种包含精氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸整合素结合区域的糖基化的磷蛋白。OPN能调节NF-κB的生物活性，许多研究证实OPN能抑制NF-κB的活性。最近多篇研究都报道了在蛛网膜下腔出血后出现的脑损伤中，外源性OPN可通过抑制NF-κB的活性，保持脑微血管基底膜的完整性，从而减轻脑损伤[5-6]。在高氧所致急性肺损伤中，OPN是否通过影响转录因子NF-κB信号通路进而抑制炎性细胞因子的产生减轻肺损伤目前尚不明确。本研究观察了外源性重组骨桥蛋白(recombinant OPN，r-OPN)对于高氧所致急性肺损伤时NF-κB和MMP-2和MMP-9表达的影响及其对肺损伤的防治作用。
对象与方法
一 材料
实验用清洁级雄性昆明小鼠96只，体重18~20 g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，按随机数字表法分为8小组，每小组12只。其中PBS处理组分为4小组，分别为对照组(N组)、高氧24 h组(O1组)、高氧48 h组(O3组)、高氧72 h组(O5组)；r-OPN处理组同样分为4小组，分别为对照组(n组)、高氧24 h组(O2组)、高氧48 h组(O4组)、高氧72 h组(O6组)。OPN蛋白由Invitrogen公司(Carlsbad，CA，USA)合成，然后溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，配制成0.1 μg/μL的溶液。
二 方法
1．动物处理：实验组动物被置于Plexiglas氧气室，内置氧浓度仪持续监测室内氧浓度，保证氧浓度＞95%，于暴露时间终末时取出动物。对照组小鼠置于室内空气中。1 μL r-OPN蛋白和对照的PBS经鼻腔滴入，24 h后暴露于高氧制备不同时段(24 h，48 h，72 h)制备急性肺损伤的动物模型。
2．肺损伤严重程度根据以下结果判定：(1)测定肺湿重/干重比值；(2)收集胸腔积液；(3)支气管肺泡灌洗液(BALF)蛋白浓度测定：小鼠处死后立即行气管插管，用1 mL PBS行支气管肺泡灌洗，共3次，离心灌洗液并测定上清液蛋白浓度。
3．肺组织切片的制备：通过气管插管用10%中性甲醛以20 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)压力灌注鼠肺，持续20 min后摘除置于10%中性甲醛固定12 h，常规脱水石蜡包埋，制成5 μm组织切片，苏木精-伊红(HE)染色部分切片。
4．逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定肺组织NF-κB、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表达：取每只小鼠50 mg肺组织，Trizol(Gibco)提取总RNA，逆转录为相应的cDNA。NF-κB引物序列：上游引物5′-TGTCAGAGCCCTTGTAACTG-3′，下游引物5′-CTGTGGGTAGGATTTCTTGT-3′；产物为296 bp的cDNA片段；MMP-2引物序列：上游引物5′-CACCATCGCCCATCATCAAGT-3′，下游引物5′-TGGATTCGAGAAAAGCGCAGCGG-3′，产物为399 bp的cDNA片段；MMP-9引物序列：上游引物5′-GCTTTCGGCTGCAGCTCTGCTG-3′，下游引物5′-GAGGCCTTTGAAGGTTTGGAAT-3′，产物为305 bp的cDNA片段；TIMP-1引物序列：上游引物5′-GCTAAAAGGATTCAAGGCTGTGGG-3′，下游引物5′-AAAGCTCTTTGCTGAGCAGGGC-3′，产物为210 bp的cDNA片段。TIMP-2引物序列：上游引物5′-TGCGGGGTCTCGCTGGACGTT-3′，下游引物5′-CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGG-3′，产物为150 bp的cDNA片段。β-actin引物序列：上游引物5′-GTGGGCCGCTCTAGGCACCA-3′，下游引物5′-CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGG-3′，产物为244 bp的cDNA片段。
PCR反应体系为25 μL，包括5 μL反转录产物，2.5 μL 10×PCR反应缓冲液(Mg2+终浓度为1.5 mmol/L)，0.5 U Tfl DNA聚合酶，1 mmol/L的引物。循环参数为：96 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环，最后72 ℃ 10 min(NF-κB，MMP-2和MMP-9)；94 ℃ 60 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，32个循环，(TIMP-1和TIMP-2)。取10 μL PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳并用凝胶成像分析系统(Alpha Image)作密度扫描分析测定扩增条带积分光密度值，用内参照β-actin修正比较各组表达水平的差异。
5．链酶亲和素-生物素-过氧化物酶法(SABC)检测肺组织NF-κB蛋白的表达：鼠抗人NF-κB多克隆抗体工作液浓度为1∶100，购自美国Santa Cruz公司。滴加一抗后4 ℃过夜，同时用PBS代替一抗而其他条件均相同做阴性对照，联苯二胺(DAB)显色，苏木素复染、封片。结果按Barbera等[7]确定的标准判定：阳性染色为胞浆或胞核中的棕褐色颗粒并按颜色强度分为4级：无棕色染色为阴性定为0分，浅棕色为弱阳性定为1分，棕黄色为较强阳性定为2分，深棕色为强阳性定为3分；每张片子共计数20个支气管分别给予评分，然后得出该样本的总评分。
三 统计学处理
采用SPSS 11.5软件包进行统计学处理，数据以
结果
一 肺损伤严重程度评价结果
在暴露于高氧环境48 h后，小鼠均发生严重的肺损伤。暴露于高氧72 h后PBS处理组小鼠肺湿重/干重比值较r-OPN处理组小鼠肺显著增加(q=2.83，P＜0.05)；各高氧组小鼠胸水较对照组均明显增加，其中暴露于高氧72 h 后PBS处理组胸水增加较多，与相对应r-OPN处理组比较，差异有统计学意义(q=3.45，P＜0.01)。在暴露于高浓度氧48 h和72 h后，PBS处理组和r-OPN处理组BALF蛋白浓度均较各自对照组明显增加(P＜0.1)；暴露于高氧48 h和72 h时，r-OPN处理组BALF蛋白浓度均明显低于PBS处理组(P＜0.01)。结果见表 1。光镜下观察HE染色肺组织切片，发现暴露于高氧72 h后PBS处理组小鼠的肺组织呈现出较r-OPN处理组小鼠肺组织更为严重的结构毁损、肺泡塌陷及肺间质水肿(图 1)。
表1
各组小鼠急性肺损伤各指标的比较(n=12，
图1
高氧72 h小鼠肺组织病理学变化(HE ×100) a．r-OPN处理组；b．PBS处理组
二 小鼠肺组织中NF-κB、MMPs和TIMPs mRNA的表达
RT-PCR结果见图 2。PBS处理组小鼠在暴露于高氧48 h和72 h后，NF-κB mRNA表达较对照组显著增加，与r-OPN处理组比较表达亦明显增高(q值分别为2.96和2.87，均P＜0.05)。PBS处理组和r-OPN处理组小鼠肺组织MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表达在暴露于高氧后较各自对照组均显著增加，但PBS处理组和r-OPN处理组各时间点差异均无统计学意义；r-OPN处理组小鼠肺组织TIMP-1 mRNA的表达在暴露于高氧72 h后较相对应的PBS处理组小鼠明显增加(q=3.05，P＜0.05)。r-OPN处理组小鼠肺组织TIMP-2 mRNA的表达在暴露于高氧48 h和72 h后较相对应的PBS处理组小鼠明显增加(q值分别为2.87和3.16，均P＜0.05)。结果见表 2。
图2
NF-κB、MMPs和TIMPs mRNA在肺组织中的表达
表2
各组小鼠肺组织NF-κB、MMPs和TIMPs mRNA表达的比较(n=12,三 小鼠肺组织中NF-κB蛋白的表达
免疫组化结果显示，对照组中仅有个别气道上皮细胞于胞浆中出现NF-κB蛋白弱阳性染色，当暴露于高氧环境下染色明显增强，NF-κB蛋白表达于气道上皮细胞、肺泡上皮细胞和巨噬细胞的胞浆及细胞核中，PBS处理组胞核明显阳性染色，胞浆亦可见阳性染色；r-OPN组肺组织可见胞浆胞核染色较同时段PBS组明显降低。PBS处理组小鼠气道上皮NF-κB蛋白表达量在暴露于高氧72 h后明显高于r-OPN处理组小鼠 (53.26±4.70比32.52±7.28，q=3.21，P＜0.05)。结果见图 3和图 4。
图3
高氧72 h小鼠肺组织中NF-κB蛋白的表达(SABC ×200) a．PBS处理组；b．r-OPN处理组
图4
各组小鼠肺组织NF-κB蛋白表达的比较
与r-OPN处理组比较，*
讨论
急性肺损伤(ALI)往往由重症肺炎、严重的脓毒症、严重的非胸部创伤、胃内容物误吸及其他情况所引起，起病急，发病凶险，可迅速导致急性呼吸衰竭，严重时可引起急性呼吸窘迫综合症(ARDS)和/或多器官功能障碍综合征。近年来，对ALI/ARDS认识逐步发展致对炎症发生、调控的认识，大量研究证实以多形核中性粒细胞为主的炎性细胞与多种细胞因子在其发病过程中起着重要作用。除中性粒细胞外，巨噬细胞及血管内皮细胞可分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和蛋白酶类等炎性介质，对启动早期炎症反应与维持炎症反应起重要作用[8-9]。
基质金属蛋白酶2和9(MMP-2和MMP-9)是在炎症反应、细胞外基质重建方面都起到重要作用的一类蛋白酶。ALI过程中，巨噬细胞和中性粒细胞在各种细胞因子、炎症因子等作用下激活并释放MMP-2和MMP-9，表达增多的MMP-2和MMP-9作用于肺泡-毛细胞血管基底膜，降解基底膜，水解细胞外基质等，破坏肺内呼吸屏障，从而直接影响肺的气体交换，造成低氧血症，肺功能下降，引起严重的肺泡-毛细血管弥散障碍，导致顽固性低氧血症[10]。TIMP-1、TIMP-2分别与MMP-9、MMP-2具有高度亲和性，不但可以抑制MMP-2、MMP-9的活化，还可以与活性化的MMP-2、MMP-9相结合导致其失去降解功能。在ALI时，TIMP-1、TIMP-2的表达也相应增加，生理条件下维持细胞外基质结构完整和细胞功能正常的动态平衡作用被破坏，间接参与了ALI的发生和发展[11]。
NF-κB信号通路激活在高氧ALI中发挥重要作用。静息状态下，NF-κB与其抑制蛋白(inhibitor κB，IκB)相结合，以非活化形式存在于细胞质内。当细胞受到多种细胞内/外信号刺激时，IκB特异丝氨酸残基被IκB激酶(IKK)磷酸化，引起IκB分子的多泛素化，进而被蛋白酶体降解，使NF-κB从与IκB复合物中解离出来，NF-κB迅速移位到胞核，与基因上的κB位点特异性结合，促进有关基因的转录，促使机体释放过多的炎症介质和细胞因子，如炎前细胞因子(TNF-α和IL-lβ等)，造成了由炎症细胞和介质构成的瀑布式级联炎症反应。调节NF-κB的活性可以减少粒细胞浸润与ALI炎性因子产生。因此，如果能够抑制NF-κB活化将有利于肺保护，减轻肺部炎性反应[12]。活性氧能激活IκB激酶，使NF-κB迅速移位到胞核，与MMP-2、MMP-9基因上的κB位点特异性结合，促进MMP-2和MMP-9基因的转录和酶的释放。多项研究证实激活NF-κB可促进MMP-2和MMP-9的分泌和活化，反之阻止NF-κB的激活则能抑制MMP-2和MMP-9的分泌和激活[13-15]。
OPN能调节NF-κB的生物活性。许多研究证实OPN能抑制NF-κB的活性，能预防经IL-1β和内毒素处理的非肿瘤细胞NF-κB的激活和一氧化氮的合成[16]。吸入突变的OPN能通过抑制NF-κB活性，从而抑制K-ras突变小鼠肺癌的发生[17]；对肾透明细胞癌的研究发现OPN和NF-κB的表达呈负相关[18]。在高氧所致ALI中，OPN是否通过影响转录因子NF-κB信号通路进而抑制炎性细胞因子的产生并减轻肺损伤目前尚不明确，既然多项研究证实OPN在其他组织中能抑制NF-κB的激活和表达，而高氧通过激活NF-κB通路加重肺损伤，OPN能减轻高氧所致ALI，那么我们假设在高氧所致ALI的上述病理生理过程中，OPN是否通过抑制NF-κB信号通路的激活进而抑制炎前细胞因子的产生来减轻高氧所致ALI？这是本研究拟探讨的主要问题。
本研究证实持续吸入PBS处理组小鼠暴露于高氧可导致明显增加的肺湿重/干重比值，出现较多胸腔积液和较高的BALF蛋白浓度为特征的肺损伤。组织学研究亦发现肺组织呈现严重的结构毁损、肺泡塌陷及间质水肿。肺损伤在暴露于高氧24 h后开始出现，并随暴露时间的延长而逐渐加重。而r-OPN处理组以上指标明显降低，光镜下肺组织结构破坏及肺泡渗出较PBS处理组亦明显减轻。在高氧引起的ALI中，肺组织NF-κB、MMP-2、MMP-9及其抑制剂表达均明显增加。PBS处理组肺组织NF-κB、MMPs和TIMPs mRNA表达在暴露于高氧后均明显增加，r-OPN处理组小鼠肺组织TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表达在暴露于高氧72 h后较相对应的PBS处理组小鼠明显增加，而MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表达在暴露于高氧72 h后与PBS组比较无明显差异。提示MMPs和TIMPs二者的比例失衡在氧化剂所致的肺损伤中可能是导致肺组织结构毁损、上皮通透性增加及肺间质水肿的重要致病因素，r-OPN处理后肺损伤较轻，可能与维持MMPs和TIMPs二者的比例平衡相关。免疫组化研究结果发现PBS处理后高氧组肺组织气道上皮细胞NF-κB表达较同时段r-OPN组明显增强，它的表达升高在氧化剂所致的肺损伤中可能是导致肺组织结构毁损、上皮通透性增加及肺间质水肿的重要致病因素，同时炎性细胞尤其肺泡巨噬细胞和中性粒细胞亦通过表达MMPs和其他介质，从而在肺损伤和修复过程中发挥重要作用。
综上所述，长时间吸入高氧能引起ALI伴NF-κB、MMP-2和MMP-9的表达增高，MMPs表达增高及与其抑制剂平衡失调通过降解细胞外基质在高氧所致的ALI过程中发挥重要作用。r-OPN吸入能抑制NF-κB、MMP-2和MMP-9的表达，促进MMP-2、MMP-9及其抑制剂间的平衡，从而减轻高氧所致ALI。我们以前使用OPN基因敲除的高氧所致ALI小鼠动物模型研究，发现OPN蛋白的表达能减轻高氧所致的ALI[19-20]，分析机理可能是OPN通过促进TIMPs的表达来抑制MMPs的释放和激活，从而减轻高氧所致的ALI。本实验的结果从另一方面证实了OPN对高氧ALI具有保护作用。
临床上往往通过氧疗来纠正呼吸衰竭，有时必须吸入较高浓度的氧才能维持适当的动脉血氧分压和血氧饱和度，然而长时间吸入高浓度的氧(＞60%)可导致肺损伤。急性肺损伤的发生机制尚未完全阐明，除了氧自由基对肺泡膜的直接损伤外，更重要的是多种炎症细胞(巨噬细胞、中性粒细胞、血小板)及其释放的炎性介质和蛋白酶类如明胶酶介导的肺部炎症反应，通过降解细胞基底膜的主要组分Ⅳ型胶原，从而在细胞外基底膜的转复中发挥重要作用[1-2]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的组织抑制酶类--基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)是主要抑制该类酶的物质，它们之间的平衡对于维持细胞外基质的结构完整及功能正常具有重要作用[3]。核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是普遍存在于真核细胞中的一个转录因子，在炎症反应的细胞因子网络调节中起关键作用。高氧作为一种刺激因素，可激活中性粒细胞或肺组织中的NF-κB，肺组织中NF-κB被激活的同时，伴有IL-1β、TNF-α及明胶酶等mRNA表达增高，且这些mRNA均受NF-κB控制。因此，如果能够抑制NF-κB活化将有利于肺保护，减轻肺部炎性反应[4]。骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是一种包含精氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸整合素结合区域的糖基化的磷蛋白。OPN能调节NF-κB的生物活性，许多研究证实OPN能抑制NF-κB的活性。最近多篇研究都报道了在蛛网膜下腔出血后出现的脑损伤中，外源性OPN可通过抑制NF-κB的活性，保持脑微血管基底膜的完整性，从而减轻脑损伤[5-6]。在高氧所致急性肺损伤中，OPN是否通过影响转录因子NF-κB信号通路进而抑制炎性细胞因子的产生减轻肺损伤目前尚不明确。本研究观察了外源性重组骨桥蛋白(recombinant OPN，r-OPN)对于高氧所致急性肺损伤时NF-κB和MMP-2和MMP-9表达的影响及其对肺损伤的防治作用。
对象与方法
一 材料
实验用清洁级雄性昆明小鼠96只，体重18~20 g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，按随机数字表法分为8小组，每小组12只。其中PBS处理组分为4小组，分别为对照组(N组)、高氧24 h组(O1组)、高氧48 h组(O3组)、高氧72 h组(O5组)；r-OPN处理组同样分为4小组，分别为对照组(n组)、高氧24 h组(O2组)、高氧48 h组(O4组)、高氧72 h组(O6组)。OPN蛋白由Invitrogen公司(Carlsbad，CA，USA)合成，然后溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，配制成0.1 μg/μL的溶液。
二 方法
1．动物处理：实验组动物被置于Plexiglas氧气室，内置氧浓度仪持续监测室内氧浓度，保证氧浓度＞95%，于暴露时间终末时取出动物。对照组小鼠置于室内空气中。1 μL r-OPN蛋白和对照的PBS经鼻腔滴入，24 h后暴露于高氧制备不同时段(24 h，48 h，72 h)制备急性肺损伤的动物模型。
2．肺损伤严重程度根据以下结果判定：(1)测定肺湿重/干重比值；(2)收集胸腔积液；(3)支气管肺泡灌洗液(BALF)蛋白浓度测定：小鼠处死后立即行气管插管，用1 mL PBS行支气管肺泡灌洗，共3次，离心灌洗液并测定上清液蛋白浓度。
3．肺组织切片的制备：通过气管插管用10%中性甲醛以20 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)压力灌注鼠肺，持续20 min后摘除置于10%中性甲醛固定12 h，常规脱水石蜡包埋，制成5 μm组织切片，苏木精-伊红(HE)染色部分切片。
4．逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定肺组织NF-κB、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表达：取每只小鼠50 mg肺组织，Trizol(Gibco)提取总RNA，逆转录为相应的cDNA。NF-κB引物序列：上游引物5′-TGTCAGAGCCCTTGTAACTG-3′，下游引物5′-CTGTGGGTAGGATTTCTTGT-3′；产物为296 bp的cDNA片段；MMP-2引物序列：上游引物5′-CACCATCGCCCATCATCAAGT-3′，下游引物5′-TGGATTCGAGAAAAGCGCAGCGG-3′，产物为399 bp的cDNA片段；MMP-9引物序列：上游引物5′-GCTTTCGGCTGCAGCTCTGCTG-3′，下游引物5′-GAGGCCTTTGAAGGTTTGGAAT-3′，产物为305 bp的cDNA片段；TIMP-1引物序列：上游引物5′-GCTAAAAGGATTCAAGGCTGTGGG-3′，下游引物5′-AAAGCTCTTTGCTGAGCAGGGC-3′，产物为210 bp的cDNA片段。TIMP-2引物序列：上游引物5′-TGCGGGGTCTCGCTGGACGTT-3′，下游引物5′-CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGG-3′，产物为150 bp的cDNA片段。β-actin引物序列：上游引物5′-GTGGGCCGCTCTAGGCACCA-3′，下游引物5′-CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGG-3′，产物为244 bp的cDNA片段。
PCR反应体系为25 μL，包括5 μL反转录产物，2.5 μL 10×PCR反应缓冲液(Mg2+终浓度为1.5 mmol/L)，0.5 U Tfl DNA聚合酶，1 mmol/L的引物。循环参数为：96 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环，最后72 ℃ 10 min(NF-κB，MMP-2和MMP-9)；94 ℃ 60 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，32个循环，(TIMP-1和TIMP-2)。取10 μL PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳并用凝胶成像分析系统(Alpha Image)作密度扫描分析测定扩增条带积分光密度值，用内参照β-actin修正比较各组表达水平的差异。
5．链酶亲和素-生物素-过氧化物酶法(SABC)检测肺组织NF-κB蛋白的表达：鼠抗人NF-κB多克隆抗体工作液浓度为1∶100，购自美国Santa Cruz公司。滴加一抗后4 ℃过夜，同时用PBS代替一抗而其他条件均相同做阴性对照，联苯二胺(DAB)显色，苏木素复染、封片。结果按Barbera等[7]确定的标准判定：阳性染色为胞浆或胞核中的棕褐色颗粒并按颜色强度分为4级：无棕色染色为阴性定为0分，浅棕色为弱阳性定为1分，棕黄色为较强阳性定为2分，深棕色为强阳性定为3分；每张片子共计数20个支气管分别给予评分，然后得出该样本的总评分。
三 统计学处理
采用SPSS 11.5软件包进行统计学处理，数据以
结果
一 肺损伤严重程度评价结果
在暴露于高氧环境48 h后，小鼠均发生严重的肺损伤。暴露于高氧72 h后PBS处理组小鼠肺湿重/干重比值较r-OPN处理组小鼠肺显著增加(q=2.83，P＜0.05)；各高氧组小鼠胸水较对照组均明显增加，其中暴露于高氧72 h 后PBS处理组胸水增加较多，与相对应r-OPN处理组比较，差异有统计学意义(q=3.45，P＜0.01)。在暴露于高浓度氧48 h和72 h后，PBS处理组和r-OPN处理组BALF蛋白浓度均较各自对照组明显增加(P＜0.1)；暴露于高氧48 h和72 h时，r-OPN处理组BALF蛋白浓度均明显低于PBS处理组(P＜0.01)。结果见表 1。光镜下观察HE染色肺组织切片，发现暴露于高氧72 h后PBS处理组小鼠的肺组织呈现出较r-OPN处理组小鼠肺组织更为严重的结构毁损、肺泡塌陷及肺间质水肿(图 1)。
表1
各组小鼠急性肺损伤各指标的比较(n=12，
图1
高氧72 h小鼠肺组织病理学变化(HE ×100) a．r-OPN处理组；b．PBS处理组
二 小鼠肺组织中NF-κB、MMPs和TIMPs mRNA的表达
RT-PCR结果见图 2。PBS处理组小鼠在暴露于高氧48 h和72 h后，NF-κB mRNA表达较对照组显著增加，与r-OPN处理组比较表达亦明显增高(q值分别为2.96和2.87，均P＜0.05)。PBS处理组和r-OPN处理组小鼠肺组织MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表达在暴露于高氧后较各自对照组均显著增加，但PBS处理组和r-OPN处理组各时间点差异均无统计学意义；r-OPN处理组小鼠肺组织TIMP-1 mRNA的表达在暴露于高氧72 h后较相对应的PBS处理组小鼠明显增加(q=3.05，P＜0.05)。r-OPN处理组小鼠肺组织TIMP-2 mRNA的表达在暴露于高氧48 h和72 h后较相对应的PBS处理组小鼠明显增加(q值分别为2.87和3.16，均P＜0.05)。结果见表 2。
图2
NF-κB、MMPs和TIMPs mRNA在肺组织中的表达
表2
各组小鼠肺组织NF-κB、MMPs和TIMPs mRNA表达的比较(n=12,三 小鼠肺组织中NF-κB蛋白的表达
免疫组化结果显示，对照组中仅有个别气道上皮细胞于胞浆中出现NF-κB蛋白弱阳性染色，当暴露于高氧环境下染色明显增强，NF-κB蛋白表达于气道上皮细胞、肺泡上皮细胞和巨噬细胞的胞浆及细胞核中，PBS处理组胞核明显阳性染色，胞浆亦可见阳性染色；r-OPN组肺组织可见胞浆胞核染色较同时段PBS组明显降低。PBS处理组小鼠气道上皮NF-κB蛋白表达量在暴露于高氧72 h后明显高于r-OPN处理组小鼠 (53.26±4.70比32.52±7.28，q=3.21，P＜0.05)。结果见图 3和图 4。
图3
高氧72 h小鼠肺组织中NF-κB蛋白的表达(SABC ×200) a．PBS处理组；b．r-OPN处理组
图4
各组小鼠肺组织NF-κB蛋白表达的比较
与r-OPN处理组比较，*
讨论
急性肺损伤(ALI)往往由重症肺炎、严重的脓毒症、严重的非胸部创伤、胃内容物误吸及其他情况所引起，起病急，发病凶险，可迅速导致急性呼吸衰竭，严重时可引起急性呼吸窘迫综合症(ARDS)和/或多器官功能障碍综合征。近年来，对ALI/ARDS认识逐步发展致对炎症发生、调控的认识，大量研究证实以多形核中性粒细胞为主的炎性细胞与多种细胞因子在其发病过程中起着重要作用。除中性粒细胞外，巨噬细胞及血管内皮细胞可分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和蛋白酶类等炎性介质，对启动早期炎症反应与维持炎症反应起重要作用[8-9]。
基质金属蛋白酶2和9(MMP-2和MMP-9)是在炎症反应、细胞外基质重建方面都起到重要作用的一类蛋白酶。ALI过程中，巨噬细胞和中性粒细胞在各种细胞因子、炎症因子等作用下激活并释放MMP-2和MMP-9，表达增多的MMP-2和MMP-9作用于肺泡-毛细胞血管基底膜，降解基底膜，水解细胞外基质等，破坏肺内呼吸屏障，从而直接影响肺的气体交换，造成低氧血症，肺功能下降，引起严重的肺泡-毛细血管弥散障碍，导致顽固性低氧血症[10]。TIMP-1、TIMP-2分别与MMP-9、MMP-2具有高度亲和性，不但可以抑制MMP-2、MMP-9的活化，还可以与活性化的MMP-2、MMP-9相结合导致其失去降解功能。在ALI时，TIMP-1、TIMP-2的表达也相应增加，生理条件下维持细胞外基质结构完整和细胞功能正常的动态平衡作用被破坏，间接参与了ALI的发生和发展[11]。
NF-κB信号通路激活在高氧ALI中发挥重要作用。静息状态下，NF-κB与其抑制蛋白(inhibitor κB，IκB)相结合，以非活化形式存在于细胞质内。当细胞受到多种细胞内/外信号刺激时，IκB特异丝氨酸残基被IκB激酶(IKK)磷酸化，引起IκB分子的多泛素化，进而被蛋白酶体降解，使NF-κB从与IκB复合物中解离出来，NF-κB迅速移位到胞核，与基因上的κB位点特异性结合，促进有关基因的转录，促使机体释放过多的炎症介质和细胞因子，如炎前细胞因子(TNF-α和IL-lβ等)，造成了由炎症细胞和介质构成的瀑布式级联炎症反应。调节NF-κB的活性可以减少粒细胞浸润与ALI炎性因子产生。因此，如果能够抑制NF-κB活化将有利于肺保护，减轻肺部炎性反应[12]。活性氧能激活IκB激酶，使NF-κB迅速移位到胞核，与MMP-2、MMP-9基因上的κB位点特异性结合，促进MMP-2和MMP-9基因的转录和酶的释放。多项研究证实激活NF-κB可促进MMP-2和MMP-9的分泌和活化，反之阻止NF-κB的激活则能抑制MMP-2和MMP-9的分泌和激活[13-15]。
OPN能调节NF-κB的生物活性。许多研究证实OPN能抑制NF-κB的活性，能预防经IL-1β和内毒素处理的非肿瘤细胞NF-κB的激活和一氧化氮的合成[16]。吸入突变的OPN能通过抑制NF-κB活性，从而抑制K-ras突变小鼠肺癌的发生[17]；对肾透明细胞癌的研究发现OPN和NF-κB的表达呈负相关[18]。在高氧所致ALI中，OPN是否通过影响转录因子NF-κB信号通路进而抑制炎性细胞因子的产生并减轻肺损伤目前尚不明确，既然多项研究证实OPN在其他组织中能抑制NF-κB的激活和表达，而高氧通过激活NF-κB通路加重肺损伤，OPN能减轻高氧所致ALI，那么我们假设在高氧所致ALI的上述病理生理过程中，OPN是否通过抑制NF-κB信号通路的激活进而抑制炎前细胞因子的产生来减轻高氧所致ALI？这是本研究拟探讨的主要问题。
本研究证实持续吸入PBS处理组小鼠暴露于高氧可导致明显增加的肺湿重/干重比值，出现较多胸腔积液和较高的BALF蛋白浓度为特征的肺损伤。组织学研究亦发现肺组织呈现严重的结构毁损、肺泡塌陷及间质水肿。肺损伤在暴露于高氧24 h后开始出现，并随暴露时间的延长而逐渐加重。而r-OPN处理组以上指标明显降低，光镜下肺组织结构破坏及肺泡渗出较PBS处理组亦明显减轻。在高氧引起的ALI中，肺组织NF-κB、MMP-2、MMP-9及其抑制剂表达均明显增加。PBS处理组肺组织NF-κB、MMPs和TIMPs mRNA表达在暴露于高氧后均明显增加，r-OPN处理组小鼠肺组织TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表达在暴露于高氧72 h后较相对应的PBS处理组小鼠明显增加，而MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表达在暴露于高氧72 h后与PBS组比较无明显差异。提示MMPs和TIMPs二者的比例失衡在氧化剂所致的肺损伤中可能是导致肺组织结构毁损、上皮通透性增加及肺间质水肿的重要致病因素，r-OPN处理后肺损伤较轻，可能与维持MMPs和TIMPs二者的比例平衡相关。免疫组化研究结果发现PBS处理后高氧组肺组织气道上皮细胞NF-κB表达较同时段r-OPN组明显增强，它的表达升高在氧化剂所致的肺损伤中可能是导致肺组织结构毁损、上皮通透性增加及肺间质水肿的重要致病因素，同时炎性细胞尤其肺泡巨噬细胞和中性粒细胞亦通过表达MMPs和其他介质，从而在肺损伤和修复过程中发挥重要作用。
综上所述，长时间吸入高氧能引起ALI伴NF-κB、MMP-2和MMP-9的表达增高，MMPs表达增高及与其抑制剂平衡失调通过降解细胞外基质在高氧所致的ALI过程中发挥重要作用。r-OPN吸入能抑制NF-κB、MMP-2和MMP-9的表达，促进MMP-2、MMP-9及其抑制剂间的平衡，从而减轻高氧所致ALI。我们以前使用OPN基因敲除的高氧所致ALI小鼠动物模型研究，发现OPN蛋白的表达能减轻高氧所致的ALI[19-20]，分析机理可能是OPN通过促进TIMPs的表达来抑制MMPs的释放和激活，从而减轻高氧所致的ALI。本实验的结果从另一方面证实了OPN对高氧ALI具有保护作用。
