引用本文： 赵巍, 王小平, 周勇安, 闫小龙, 倪云峰, 田丰. 单免疫球蛋白白细胞介素1受体相关蛋白对香烟烟雾提取物刺激A549细胞后产生效应的影响. 中国呼吸与危重监护杂志, 2015, 14(1): 60-63. doi: 10.7507/1671-6205.2015014 复制
吸烟是多种呼吸道疾病的重要致病因素之一。长期大量吸烟可导致气道、肺实质和肺血管的慢性炎症。长期吸烟/炎症刺激还可使肺部病变向肺癌转化，严重危害生命健康[1]。因此，针对炎症反应的机制进行有效的抑制是预防/治疗吸烟导致的相关疾病并防止其向肺癌进一步转化的关键。然而，目前临床治疗中尚缺乏针对此类炎症反应特异性的阻断靶点。研究表明香烟烟雾接触可加速活性氧(ROS)的生成，导致气道炎症反应[1]。香烟烟雾导致的ROS升高是通过TLR4/MyD88/TRAF6/c-Src/NADPH氧化酶通路介导的，接着引起丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)及核因子κB(NF-κB)的激活，活化的NF-κB聚集于环氧化酶2(COX-2)的启动子区引起COX-2表达的增加，COX-2表达增加又进一步导致前列腺素E2(PGE2)与白细胞介素6(IL-6)释放增加，最终导致COX-2/PGE2/IL-6依赖的呼吸道炎症反应[2]。单一免疫球蛋白白细胞介素1受体相关蛋白(SIGIRR或TIR8)是Toll-IL-1受体(TIR)超家族的成员之一，可以负性调节诸多Toll样受体(TLRs)介导的固有免疫应答。研究发现SIGIRR对于脂多糖(LPS，香烟烟雾的主要成分)诱导的TLR4信号通路有抑制作用，因此推测SIGIRR对香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract，CSE)诱导的炎症反应有抑制作用[3-5]。本课题以小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞来源的A549细胞为研究对象，应用基因转染的方法使SIGIRR在A549细胞中过表达，并利用报告基因系统、ELISA等方法，研究SIGIRR对CSE诱导的肺泡上皮细胞炎症反应的影响和可能的机制。
材料与方法
一 材料
A549细胞为本实验室保存细胞株，SIGIRR质粒[pcDNA3.1(+)-SIGIRR]由本室成功构建[6]，全蛋白提取试剂盒及蛋白定量试剂盒(BCA法)购自西安沃尔森生物技术公司。山羊抗人SIGIRR抗体购自安迪生物科技(上海)有限公司，总RNA提取试剂TRIzol、Lipofectamine2000购自英杰生命科技有限公司，反转录试剂盒购自上海根生生物科技有限公司，Taq酶、PCR buffer、dNTP购自康为世纪生物科技公司，双荧光素酶报告系统试剂盒购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，人IL-6 ELISA试剂盒购自北京科盈美科技公司。
二 方法
1．CSE的制备：参照Lin等[1]的方法制备CSE。将10支去过滤嘴香烟与一个注射器驱动装置连接抽吸而燃着，10 min燃完，吸入的烟雾经另一个出口通入50 mL无血清培养液中制成悬液。悬液用1 mol/L NaOH调至pH 7.4，经0.22μm微孔滤膜过滤备用。制备的CSE在30 min之内用于实验。
2．细胞培养与转染：A549细胞维持在含10%胎牛血清、10 000 U/mL青霉素和链霉素(Sigma)的高糖DMEM培养基(GIBCO)，37℃、5%CO2孵育箱中。将pcDNA3.1(+)-SIGIRR质粒转染A549细胞。转染前4 h将培养液更换为无双抗培养液，转染前再更换为无血清培养液。6孔板每孔加入4μg质粒与10μL Lipofectamine 2000，24孔板每孔加入800 ng质粒与2μL Lipofectamine 2000。操作按照Lipofectamine 2000说明书步骤进行。转染后6 h移去无血清培养液，更换为无双抗培养液。转染24 h后收集细胞，以未转染的细胞为对照，通过Real-time PCR及Western blot检测细胞中SIGIRR表达。
3．A549细胞中SIGIRR的mRNA和蛋白表达水平的检测：具体检测方法按文献[5]进行。收集细胞，使用TRIzol试剂提取A549细胞中总RNA，以其为模板，按照上海根生生物科技有限公司的反转录试剂盒说明书进行操作，得到A549细胞cDNA。设计SIGIRR、β-actin引物并由北京奥科生物公司合成。以反转录所得cDNA为模板进行PCR反应。使用RIPA裂解液冰上裂解细胞后，离心后收取上清液。使用蛋白定量试剂盒(BCA法)测定蛋白浓度。上样前将蛋白放入沸水中煮5 min，使之变性。采用SDS-PAGE法(电压100 V)蛋白电泳后，恒流200 mA，湿转，将蛋白从凝胶转移到硝酸纤维素膜上。转移时间为2 h。封闭液为TBST加4%脱脂牛奶配制，室温封闭2 h。用TSB稀释的1:1 000山羊抗人SIGIRR抗体4℃孵育过夜，TSBT清洗后荧光二抗室温孵育1 h。Odyssey红外扫描仪分析结果。
4．A549培养液上清中IL-6、COX-2和ROS水平检测：ELISA法检测IL-6的浓度，双荧光素酶报告系统检测COX-2活性，化学发光法检测ROS的水平。将A549细胞分为过表达SIGIRR组(通过基因转染技术使A549细胞中SIGIRR过表达)和对照组(正常A549细胞)，使用制备的CSE加入细胞培养液中(总浓度50μg/mL)，培养24 h后，检测各组中IL-6水平、COX-2活性和ROS水平。每个样本设置3个复孔，检测结果取平均值。
三 统计学处理
应用SPSS 16.0软件对数据进行处理。计量数据均以
结果
一 SIGIRR在A549细胞及转染SIGIRR表达质粒后A549细胞中的表达
RT-PCR检测可见在A549细胞中SIGIRR mRNA的表达较弱，转染SIGIRR表达质粒后SIGIRR mRNA表达量明显上升(图 1)。Western blot检测结果与RT-PCR结果一致，A549细胞中有SIGIRR蛋白的表达，转染SIGIRR表达质粒后SIGIRR蛋白水平也明显上升(图 2)。
图1
A549细胞中SIGIRR mRNA表达
图2
A549细胞中SIGIRR蛋白表达
1：A549；2：转染SIGIRR表达质粒的A549
二 SIGIRR对CSE诱导A549细胞释放ROS的抑制作用
化学发光法检测结果发现，PBS处理过表达SIGIRR组A549细胞培养液上清中ROS的释放水平低于对照组，但差异无统计学意义(P > 0.05)。经CSE刺激24 h后，过表达SIGIRR组A549细胞培养液上清中ROS的释放水平明显升高，但显著低于对照组(P < 0.05)。提示CSE可以刺激肺泡上皮细胞释放ROS，而转染SIGIRR质粒可以降低肺泡上皮细胞ROS的释放。结果见图 3和表 1。
图3
转染SIGIRR表达质粒对A549细胞经CSE刺激后ROS释放的影响
与对照组比较，*
表1
转染SIGIRR表达质粒对A549细胞经CSE刺激后ROS、COX-2、IL-6表达的影响(n=3，三 SIGIRR对CSE诱导A549细胞COX-2表达的抑制作用
双荧光素酶报告系统检测结果发现，PBS处理过表达SIGIRR组A549细胞培养液上清中COX-2表达水平明显低于对照组(P < 0.05)。经CSE刺激24 h后，过表达SIGIRR组A549细培养液上清中COX-2表达水平升高，但显著低于对照组(P < 0.05)。说明CSE可以刺激肺泡上皮细胞COX-2表达，而转染SIGIRR质粒可以抑制肺泡上皮细胞COX-2表达。结果见图 4和表 1。
图4
转染SIGIRR表达质粒对A549细胞经CSE刺激后COX-2表达的影响
与对照组比较，*
四 SIGIRR对CSE诱导A549细胞产生IL-6的抑制作用
ELISA实验结果显示，PBS处理过表达SIGIRR组A549细胞培养液上清中IL-6释放水平低于对照组(P < 0.05)。经CSE刺激24 h后，过表达SIGIRR组A549细胞培养液上清IL-6释放水平明显升高，但显著低于对照组(P < 0.05)。说明CSE可以刺激肺泡上皮细胞产生炎症反应，促进IL-6释放，而转染SIGIRR质粒可以抑制肺泡上皮细胞IL-6表达，从而使肺泡上皮细胞在炎症环境下得到保护。结果见表 1。
讨论
香烟烟雾是呼吸道慢性炎症发生的重要诱导因素之一[5]，长期大量吸烟可导致呼吸道ROS释放增加、COX-2高表达，从而导致氧化应激、介导炎性反应[4-6]。香烟烟雾已被证实在多种炎症过程相关基因的表达调节中起重要作用[7]，其中在肺内炎症反应的调节是通过TLR4/MyD88以及IL-1R1/MyD88依赖的信号通路来完成的[8]，这一过程表现为TLR4依赖性[9]，并需要两种转接蛋白MyD88和TRAF6的参与[10]。另外，香烟烟雾可以上调呼吸道上皮细胞中TLR4的表达[11]，而呼吸道COX-2的高表达是通过TLR4依赖的MyD88/TRAF6/c-Src/NADPH oxidase/MAPK/NF-κB通路介导的，香烟烟雾活化TLR4通路引起炎症反应，同时伴有ROS、PGE2以及IL-6的生成[2]，当大量的ROS或自由基生成超过机体抗氧化能力的时候，氧化应激发生[12]。由于TLR4依赖的MyD88/TRAF6/c-Src/NADPH oxidase/MAPK/NF-κB通路是香烟烟雾诱发气道炎症的关键因素，那么有效地抑制这一通路也许就可以有效阻止或缓解这一炎症反应。SIGIRR归属于TIR超家族(也被称为TIR8)[13]，广泛表达于各种上皮来源的细胞，包括肺泡上皮来源的A549细胞[14]。而SIGIRR与其他TIR家族的大多数成员不同，其细胞外Ig结构域含有单一的Ig，SIGIRR的细胞内结构域为高度保守的TIR域，但与IL-1R1相比缺乏两个信号传导必需的氨基酸Ser447和Tyr536。正因为这些结构上的差别，SIGIRR不能与IL-1结合并使其信号向下传递，反而会抑制包括IL-1、LPS等多种致炎因子触发的信号转导，其TIR结构域正是与TLR4相互作用以及抑制LPS信号所必须的。因此，SIGIRR可能在炎性反应疾病中发挥抑制作用[15]。
本研究通过RT-PCR、Western blot验证了SIGIRR在A549细胞中的表达，提示SIGIRR在A549细胞中起作用。而过表达SIGIRR的A549细胞经CSE刺激后的ROS释放水平、COX-2表达水平及IL-6释放水平均显著降低，证明SIGIRR能够抑制CSE诱导的炎症反应，这可能与SIGIRR可与TLR4、MyD88、IRAK及TRAF6分子形成复合物，从而抑制TLR4/MyD88/TRAF6/NF-κB通路信号转导，来调节肺内炎症反应有关[16]。
综上所述，我们的研究在细胞水平初步说明在CSE导致的炎症环境下，SIGIRR表达上调可以抑制CSE诱导的A549细胞ROS、COX-2及IL-6释放和表达水平增加。这提示SIGIRR表达上调可以对吸烟所致呼吸道炎症起到延缓、抑制的作用，为今后研究对CSE持续刺激引起的呼吸道慢性炎症，在活体水平SIGIRR是否能起到减缓的作用提供新思路。
吸烟是多种呼吸道疾病的重要致病因素之一。长期大量吸烟可导致气道、肺实质和肺血管的慢性炎症。长期吸烟/炎症刺激还可使肺部病变向肺癌转化，严重危害生命健康[1]。因此，针对炎症反应的机制进行有效的抑制是预防/治疗吸烟导致的相关疾病并防止其向肺癌进一步转化的关键。然而，目前临床治疗中尚缺乏针对此类炎症反应特异性的阻断靶点。研究表明香烟烟雾接触可加速活性氧(ROS)的生成，导致气道炎症反应[1]。香烟烟雾导致的ROS升高是通过TLR4/MyD88/TRAF6/c-Src/NADPH氧化酶通路介导的，接着引起丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)及核因子κB(NF-κB)的激活，活化的NF-κB聚集于环氧化酶2(COX-2)的启动子区引起COX-2表达的增加，COX-2表达增加又进一步导致前列腺素E2(PGE2)与白细胞介素6(IL-6)释放增加，最终导致COX-2/PGE2/IL-6依赖的呼吸道炎症反应[2]。单一免疫球蛋白白细胞介素1受体相关蛋白(SIGIRR或TIR8)是Toll-IL-1受体(TIR)超家族的成员之一，可以负性调节诸多Toll样受体(TLRs)介导的固有免疫应答。研究发现SIGIRR对于脂多糖(LPS，香烟烟雾的主要成分)诱导的TLR4信号通路有抑制作用，因此推测SIGIRR对香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract，CSE)诱导的炎症反应有抑制作用[3-5]。本课题以小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞来源的A549细胞为研究对象，应用基因转染的方法使SIGIRR在A549细胞中过表达，并利用报告基因系统、ELISA等方法，研究SIGIRR对CSE诱导的肺泡上皮细胞炎症反应的影响和可能的机制。
材料与方法
一 材料
A549细胞为本实验室保存细胞株，SIGIRR质粒[pcDNA3.1(+)-SIGIRR]由本室成功构建[6]，全蛋白提取试剂盒及蛋白定量试剂盒(BCA法)购自西安沃尔森生物技术公司。山羊抗人SIGIRR抗体购自安迪生物科技(上海)有限公司，总RNA提取试剂TRIzol、Lipofectamine2000购自英杰生命科技有限公司，反转录试剂盒购自上海根生生物科技有限公司，Taq酶、PCR buffer、dNTP购自康为世纪生物科技公司，双荧光素酶报告系统试剂盒购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，人IL-6 ELISA试剂盒购自北京科盈美科技公司。
二 方法
1．CSE的制备：参照Lin等[1]的方法制备CSE。将10支去过滤嘴香烟与一个注射器驱动装置连接抽吸而燃着，10 min燃完，吸入的烟雾经另一个出口通入50 mL无血清培养液中制成悬液。悬液用1 mol/L NaOH调至pH 7.4，经0.22μm微孔滤膜过滤备用。制备的CSE在30 min之内用于实验。
2．细胞培养与转染：A549细胞维持在含10%胎牛血清、10 000 U/mL青霉素和链霉素(Sigma)的高糖DMEM培养基(GIBCO)，37℃、5%CO2孵育箱中。将pcDNA3.1(+)-SIGIRR质粒转染A549细胞。转染前4 h将培养液更换为无双抗培养液，转染前再更换为无血清培养液。6孔板每孔加入4μg质粒与10μL Lipofectamine 2000，24孔板每孔加入800 ng质粒与2μL Lipofectamine 2000。操作按照Lipofectamine 2000说明书步骤进行。转染后6 h移去无血清培养液，更换为无双抗培养液。转染24 h后收集细胞，以未转染的细胞为对照，通过Real-time PCR及Western blot检测细胞中SIGIRR表达。
3．A549细胞中SIGIRR的mRNA和蛋白表达水平的检测：具体检测方法按文献[5]进行。收集细胞，使用TRIzol试剂提取A549细胞中总RNA，以其为模板，按照上海根生生物科技有限公司的反转录试剂盒说明书进行操作，得到A549细胞cDNA。设计SIGIRR、β-actin引物并由北京奥科生物公司合成。以反转录所得cDNA为模板进行PCR反应。使用RIPA裂解液冰上裂解细胞后，离心后收取上清液。使用蛋白定量试剂盒(BCA法)测定蛋白浓度。上样前将蛋白放入沸水中煮5 min，使之变性。采用SDS-PAGE法(电压100 V)蛋白电泳后，恒流200 mA，湿转，将蛋白从凝胶转移到硝酸纤维素膜上。转移时间为2 h。封闭液为TBST加4%脱脂牛奶配制，室温封闭2 h。用TSB稀释的1:1 000山羊抗人SIGIRR抗体4℃孵育过夜，TSBT清洗后荧光二抗室温孵育1 h。Odyssey红外扫描仪分析结果。
4．A549培养液上清中IL-6、COX-2和ROS水平检测：ELISA法检测IL-6的浓度，双荧光素酶报告系统检测COX-2活性，化学发光法检测ROS的水平。将A549细胞分为过表达SIGIRR组(通过基因转染技术使A549细胞中SIGIRR过表达)和对照组(正常A549细胞)，使用制备的CSE加入细胞培养液中(总浓度50μg/mL)，培养24 h后，检测各组中IL-6水平、COX-2活性和ROS水平。每个样本设置3个复孔，检测结果取平均值。
三 统计学处理
应用SPSS 16.0软件对数据进行处理。计量数据均以
结果
一 SIGIRR在A549细胞及转染SIGIRR表达质粒后A549细胞中的表达
RT-PCR检测可见在A549细胞中SIGIRR mRNA的表达较弱，转染SIGIRR表达质粒后SIGIRR mRNA表达量明显上升(图 1)。Western blot检测结果与RT-PCR结果一致，A549细胞中有SIGIRR蛋白的表达，转染SIGIRR表达质粒后SIGIRR蛋白水平也明显上升(图 2)。
图1
A549细胞中SIGIRR mRNA表达
图2
A549细胞中SIGIRR蛋白表达
1：A549；2：转染SIGIRR表达质粒的A549
二 SIGIRR对CSE诱导A549细胞释放ROS的抑制作用
化学发光法检测结果发现，PBS处理过表达SIGIRR组A549细胞培养液上清中ROS的释放水平低于对照组，但差异无统计学意义(P > 0.05)。经CSE刺激24 h后，过表达SIGIRR组A549细胞培养液上清中ROS的释放水平明显升高，但显著低于对照组(P < 0.05)。提示CSE可以刺激肺泡上皮细胞释放ROS，而转染SIGIRR质粒可以降低肺泡上皮细胞ROS的释放。结果见图 3和表 1。
图3
转染SIGIRR表达质粒对A549细胞经CSE刺激后ROS释放的影响
与对照组比较，*
表1
转染SIGIRR表达质粒对A549细胞经CSE刺激后ROS、COX-2、IL-6表达的影响(n=3，三 SIGIRR对CSE诱导A549细胞COX-2表达的抑制作用
双荧光素酶报告系统检测结果发现，PBS处理过表达SIGIRR组A549细胞培养液上清中COX-2表达水平明显低于对照组(P < 0.05)。经CSE刺激24 h后，过表达SIGIRR组A549细培养液上清中COX-2表达水平升高，但显著低于对照组(P < 0.05)。说明CSE可以刺激肺泡上皮细胞COX-2表达，而转染SIGIRR质粒可以抑制肺泡上皮细胞COX-2表达。结果见图 4和表 1。
图4
转染SIGIRR表达质粒对A549细胞经CSE刺激后COX-2表达的影响
与对照组比较，*
四 SIGIRR对CSE诱导A549细胞产生IL-6的抑制作用
ELISA实验结果显示，PBS处理过表达SIGIRR组A549细胞培养液上清中IL-6释放水平低于对照组(P < 0.05)。经CSE刺激24 h后，过表达SIGIRR组A549细胞培养液上清IL-6释放水平明显升高，但显著低于对照组(P < 0.05)。说明CSE可以刺激肺泡上皮细胞产生炎症反应，促进IL-6释放，而转染SIGIRR质粒可以抑制肺泡上皮细胞IL-6表达，从而使肺泡上皮细胞在炎症环境下得到保护。结果见表 1。
讨论
香烟烟雾是呼吸道慢性炎症发生的重要诱导因素之一[5]，长期大量吸烟可导致呼吸道ROS释放增加、COX-2高表达，从而导致氧化应激、介导炎性反应[4-6]。香烟烟雾已被证实在多种炎症过程相关基因的表达调节中起重要作用[7]，其中在肺内炎症反应的调节是通过TLR4/MyD88以及IL-1R1/MyD88依赖的信号通路来完成的[8]，这一过程表现为TLR4依赖性[9]，并需要两种转接蛋白MyD88和TRAF6的参与[10]。另外，香烟烟雾可以上调呼吸道上皮细胞中TLR4的表达[11]，而呼吸道COX-2的高表达是通过TLR4依赖的MyD88/TRAF6/c-Src/NADPH oxidase/MAPK/NF-κB通路介导的，香烟烟雾活化TLR4通路引起炎症反应，同时伴有ROS、PGE2以及IL-6的生成[2]，当大量的ROS或自由基生成超过机体抗氧化能力的时候，氧化应激发生[12]。由于TLR4依赖的MyD88/TRAF6/c-Src/NADPH oxidase/MAPK/NF-κB通路是香烟烟雾诱发气道炎症的关键因素，那么有效地抑制这一通路也许就可以有效阻止或缓解这一炎症反应。SIGIRR归属于TIR超家族(也被称为TIR8)[13]，广泛表达于各种上皮来源的细胞，包括肺泡上皮来源的A549细胞[14]。而SIGIRR与其他TIR家族的大多数成员不同，其细胞外Ig结构域含有单一的Ig，SIGIRR的细胞内结构域为高度保守的TIR域，但与IL-1R1相比缺乏两个信号传导必需的氨基酸Ser447和Tyr536。正因为这些结构上的差别，SIGIRR不能与IL-1结合并使其信号向下传递，反而会抑制包括IL-1、LPS等多种致炎因子触发的信号转导，其TIR结构域正是与TLR4相互作用以及抑制LPS信号所必须的。因此，SIGIRR可能在炎性反应疾病中发挥抑制作用[15]。
本研究通过RT-PCR、Western blot验证了SIGIRR在A549细胞中的表达，提示SIGIRR在A549细胞中起作用。而过表达SIGIRR的A549细胞经CSE刺激后的ROS释放水平、COX-2表达水平及IL-6释放水平均显著降低，证明SIGIRR能够抑制CSE诱导的炎症反应，这可能与SIGIRR可与TLR4、MyD88、IRAK及TRAF6分子形成复合物，从而抑制TLR4/MyD88/TRAF6/NF-κB通路信号转导，来调节肺内炎症反应有关[16]。
综上所述，我们的研究在细胞水平初步说明在CSE导致的炎症环境下，SIGIRR表达上调可以抑制CSE诱导的A549细胞ROS、COX-2及IL-6释放和表达水平增加。这提示SIGIRR表达上调可以对吸烟所致呼吸道炎症起到延缓、抑制的作用，为今后研究对CSE持续刺激引起的呼吸道慢性炎症，在活体水平SIGIRR是否能起到减缓的作用提供新思路。
