引用本文： 赵振宇, 王德明, 肖继. miR-33s通过靶向p38 MAPK负性调节LPS诱导的炎症反应. 中国呼吸与危重监护杂志, 2015, 14(2): 157-160. doi: 10.7507/1671-6205.2015040 复制
microRNA(miRNA,miR)是一类进化上高度保守的内源性非编码RNA分子，由21～25个核苷酸组成[1]。miRNA通过特异的碱基配对方式结合到靶基因mRNA的3′末端非编码区，从而诱导靶基因mRNA的降解或抑制其翻译，在转录后水平调节靶基因的表达[2]。miRNA在调节固有免疫和适应性免疫细胞的成熟、增殖、分化和活化发挥着重要作用[3]。先前的研究表明，miR-33a可以通过靶向结合ABCA1，沉默其表达，抑制载脂蛋白A1介导的胆固醇流出[4-5]。在调控炎症反应这方面，miR-33s也可能起着关键的作用[5-6]。通过生物信息学分析，我们发现p38 MAPK 是miR-33s的一个潜在靶点。本实验将miR-33s拟似物(mimic)和miR-33s抑制剂(inhibitor)分别导入THP-1细胞内，人为上调或下调细胞内miR-33的表达水平，进而观察细胞p38 MAPK蛋白表达及细胞炎症因子分泌的变化来探讨其调控机制，以阐明miR-33s这种抑制作用主要是通过它的“seed suquence”作用于p38 MAPK 的 3′-URT来阻断p38 MAPK级联从而减轻炎症反应。目前相关miR-33的研究主要以调控脂质代谢为主[5]，而在调控炎症方面的研究较少，本实验为负性调控巨噬细胞提供新靶点,以及治疗脓毒症提供新思路。
材料与方法
一 材料
细胞系人单核细胞系细胞株THP-1购自中科院上海细胞生物所细胞中心。实验试剂脂多糖[LPS(from Escherichia coli 055:B5)]购自美国Sigma公司，RPMI-1640培养基DMEM培养基Opti-MEM培养基胎牛血清-巯基乙醇购自美国Gibco公司。miR-33s拟似物mimic和miR-33s inhibitor购自上海吉玛制药技术有限公司。TransIT-X2® Dynamic Delivery System转染试剂购自Miru公司。磷酸化的p38 MAPK 抗体、β-actin抗体购自Cell Signaling Technology,Inc。辣根过氧化物酶标记的二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6) ELISA试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司。
二 方法
1．THP-1-单核细胞培养及传代方法：将THP-1-单核细胞置于含10%胎血清的RPMI-1640培养基中，于37 ℃ 5% CO2培养箱静置培养。在培养液中加入10 mmol/L 的羟乙基哌秦乙硫磺酸(HEPES)和青霉素、链霉素各1.0×105 U/L。将THP-1单核细胞复苏后，按照悬浮细胞培养的方法传至3~6代后用于实验。
2．LPS诱导：THP-1-单核细胞分别以工作浓度为10.0 ng/mL的LPS诱导THP-1-单核细胞，用溶解LPS的磷酸盐缓冲液 (0 ng/mL LPS) 诱导THP-1细胞作空白对照，LPS诱导作用的时间为24 h。
3．过表达miR-33s实验分组及处理：①空白组: 采用等量磷酸盐缓冲液处理THP-1-单核细胞;②NC组: 转染mimic双链RNA至THP-1-单核细胞24 h;③miR-33s mimic组: 转染miR-33s mimic至THP-1-单核细胞24 h。
4．抑制miR-33s表达的实验分组及处理：①INC组: 转染inhibitor单链RNA至THP-1-单核细胞24 h; ②miR-33s inhibitor 组: 转染miR-33s至THP-1-单核细胞24 h。再以浓度为10.0 ng/mL的LPS诱导以上两组细胞24 h。
5．寡核苷酸序列设计与合成：miR-33s成熟体双链mimic是根据has-miR-33s家族成员的成熟体序列合成。miR-33s inhibitor则采用miR-33s家族成员成熟体的反向互补序列，并对所有碱基都进行了2′甲氧修饰。负对照双链RNA序列由上海吉玛生物公司合成，与所有哺乳动物的基因组没有同源性; 负对照单链RNA序列来自线虫，不与任何已知哺乳动物miRNA序列相匹配。
6．细胞转染取对数生长期细胞进行细胞转染：使用miRNA转染试剂TransIT-X2® Dynamic Delivery System转染细胞。将细胞密度为(8~10)×105 个/孔的THP-1-单核细胞细胞接种于含有2 mLRPMI-1640完全培养基的6板中，并置于37 ℃ 5% CO2培养箱过夜。将6.8 μL浓度为10 μmol/L的miRNA稀释于250 μL Opti-MEMI无血清培养基中，并加入7.5 μL TransIT-X2® Dynamic Delivery System转染试剂，轻柔混匀，室温孵育20 min。将miRNA TransIT-X2® Dynamic Delivery System混合液加入含有细胞以及培养液的6孔板各孔中，并将培养板置于37 ℃的CO2培养箱中培养24 h。各板孔培养基中的miRNA终浓度为25 nmol/L。
7．RFQ-PCR 检测细胞中 miR-33s的表达：收集未转染的THP-1-单核细胞以及转染miR-33s mimic和miR-33s inhibitor 24 h 后的THP-1-单核细胞，按TRIzol试剂盒说明书提取细胞总RNA，并按Invitrogen逆转录反应试剂盒说明书合成cDNA，反应产物置于－20 ℃保存备用或立即进行PCR扩增; cDNA 合成过程中采用miR-33s RT特异性物构建反转录体系,miR-33s RT引物序列为: 5′-GTC GTA TCC AGT GCG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TGC ACT GGA TAC GAC UUC ACG-3′; 内参照U6 RT=引物序列为: 5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3′。PCR过程按Invitrogen的M-MLVPlatinum 定量PCRSuperMix-UDG 试剂盒说明书在ABI7500荧光定量PCR仪上进行，使用U6作为内参照同时进行PCR。miR-33s正向引物序列5′-GGT TAG ATC TTG CTC CAG CGG TTT G-3′，反引物序列5′-GTA AAG CTT GCC CTC CTG TTT CCT G-3′，内参照U 6 正向引物序列为: 5′-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAAT-3′,反向引物序列为: 5′-CGC TTC ACG AAT TT GCG TGT CAT-3′。获得Ct 值后，应用比较Ct 法进行相对定量，目标基因的相对定量用2－ΔΔCt计算。
8．Western blot法检测转染后细胞p38MAPK 蛋白表达的改变：收集转染后 72 h 后的细胞,PBS洗涤 2次; 加 150 μL细胞裂解液于4 ℃裂解30 min 后,12 000 g 离心10 min,取上清液,采用 Bradford 法测定蛋白质的浓度。以β-actin的水平作为等量蛋白质上样对照(空白对照组),每个样本至少重复3遍。取60 μg蛋白质样品进行 SDS-PAGE 电泳,转至硝酸纤维膜上;室温封闭 2 h 后,用含0.05 %Tween-20的 TBS 缓冲液漂洗3次,每次10 min; 加入相应的p38 MAPK 单克隆抗体(1∶800),4 ℃孵育过夜,TBST 漂洗 3次后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗 (1∶5 000),37 ℃摇床温育 2 h,ECL 显色系统显色。最后经 ECL 系统曝光显影,通过凝胶分析系统分析蛋白的表达。
9．ELISA法检测细胞培养液中IL-1β释放量：收集经前述处理后的细胞悬液，1 500 r/min离心20 min，收集细胞培养液上清液，按照ELISA试剂盒说明书步骤，检测细胞培养液中IL-1β、TNF-α、IL-6的释放量。
三 统计学处理
应用 SPSS 16.0 统计软件进行统计分析,计量数据以
结果
一 miR-33s在细胞中的表达变化
RFQ-PCR检测结果显示,空白组miR-33s的相对表达量是352.00±85.56，miR-33s mimic转染组miR-33s的相对表达量是215 896.64±16 785.36,NC组miR-33s的相对表达量是420.68±78.43,miR-33s inhibitor组miR-33s的相对表达量是10.38±1.58,INC组miR-33s的相对表达量是287.97±16.05。各组的差异有统计学意义(P<0.05)，提示转染成功。
二 Western blot检测细胞 p38 MAPK 的蛋白表达
以空白对照组的灰度值为1,miR-33s mimic组、NC组、miR-33s inhibitor组、INC组的灰度值分别是0.330±0.021、0.890±0.017、3.128±0.069、0.920±0.026。与对照组和miR-33s inhibitor转染组组相比,miR-33s mimic转染组能明显降低p38 MAPK 蛋白表达水平 (P<0.005)。
图1
各组细胞的 Western blot分析
A:miR-33s mimic组; B:NC组; C:miR-33s inhibitor组;D: INC组;E:空白组
三 miR-33s对THP-1细胞释放炎症因子的影响
miR-33 mimic转染组细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β的释放量降低，与NC组比较差异有统计学意义(P<0.05)。miR-33s inhibitor组转染组细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β的释放量明显升高，与INC组相比有显著性差异(P<0.05)。NC组，INC组中TNF-α、IL-6、IL-1β释放量较空白组相比差异无统计学意义(P>0.05)。
表2
各组THP-1细胞炎症因子释放量比较(pg/mL)
讨论
脓毒症是由感染引起的全身炎症反应，与全身炎症反应综合征(SIRS)密切相关[7]。正常的机体炎症反应是一种对损伤因子的防御性反应，它可以防止组织损伤扩大，促进组织修复，是机体修复和生存所必需的。而过度的炎症反应会形成炎症瀑布效应，甚至使炎症反应失去控制，最终导致以细胞自身性破坏为特征的全身性炎症反应[8]。在各种炎症反应中，单核细胞的作用显著，在炎症早期，革兰阴性细菌胞壁成分之一LPS能刺激单核-巨噬细胞产生大量的炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)，促进脓毒症的发展[9]。
P-p38 MAPK是丝裂原活化蛋白激酶家族中的成员之一，在炎症反应中具有重要作用[10]。p38信号通路与炎症关系密切，它通过非磷酸化转化为磷酸化状态促进下游底物的磷酸化，从而活化下游底物转录因子ATF2、MEF2C,后两者的激活引起前炎症因子TNF-α、IL-1β释放增加[11]。LPS 是促进p38 MAPK 激活、产生炎症介质的强激活物，它通过与结合蛋白 (LP SBP) 相结合,形成 LPS-LPS BP 复合体,再与单核巨噬细面的 CD14 分子结合,激活p38信号通路，从而促发炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β) 的大量产生。
近年来研究发现miRNA可以在免疫细胞分化、免疫细胞信号转导、固有免疫应答和适应性免疫应答等多个层面对免疫反应进行调控[12-13]。Ho等[14]研究发现，miR-33可以靶向沉默RIP140抑制IL-1β和TNF-α等炎症因子的释放。RIP140作为一种转录辅抑制因子，可激活核因子κB (NF-κB)信号通路，调控炎症因子的表达[15]。一个miRNA可能有多个靶基因，因此我们推测miR-33在调节炎症因子的表达存在多个多个靶基因。通过生物信息学分析，我们发现p38 MAPK也是其中一个潜在的靶基因，这提示miR-33也可以通过靶向沉默p38 MAPK来调控炎症因子的释放。
本实验通过转染miR-33s的拟似物mimic 24 h后，使THP-1细胞过表达miR-33s，然后检测细胞p38MAPK浓度及炎症因子释放量，结果显示，其p38MAPK蛋白表达以及TNF-α、IL-6和IL-1β的释放量均较NC组明显降低(P<0.05)，提示过表达miR-33s可以通过抑制单核巨噬细胞p38信号通路，从而抑制炎症因子的释放。本实验还通过转染miR-33s inhibitor抑制miR-33s的表达，模拟miR-33s功能缺失实验，来观察抑制miR-33s的表达对炎症的作用。结果显示，抑制miR-33s的表达，其细胞的p38 MAPK蛋白表达以及TNF-α、IL-6和IL-1β的释放量均较INC组明显升高(P<0.05)。抑制miR-33s的表达对LPS诱导的炎症因子释放存在促进作用。我们从正反两方面论证了miR-33可能是通过靶向沉默P38MAPK，抑制炎症因子信号通路，负性调控THP-1细胞炎症因子的分泌。
本实验结果表明，过表达单核细胞内miR-33抑制炎症因子表达，抑制miR-33的表达则会促进炎症因子的表达，其可能的作用机制是通过调控p38MAPK信号转导通路来实现的。尽管脂质代谢中miR-33的调控功能已经得到证实[5, 16]，但是在调控炎症方面的研究很少。miR-33在调控单核细胞炎症反应中是否还存在其它的调控通路，还有待进一步研究。随着人们对miR-33与炎症调控关系的进一步研究，这将为脓毒血症的预防和治疗提供一个新的途径。
microRNA(miRNA,miR)是一类进化上高度保守的内源性非编码RNA分子，由21～25个核苷酸组成[1]。miRNA通过特异的碱基配对方式结合到靶基因mRNA的3′末端非编码区，从而诱导靶基因mRNA的降解或抑制其翻译，在转录后水平调节靶基因的表达[2]。miRNA在调节固有免疫和适应性免疫细胞的成熟、增殖、分化和活化发挥着重要作用[3]。先前的研究表明，miR-33a可以通过靶向结合ABCA1，沉默其表达，抑制载脂蛋白A1介导的胆固醇流出[4-5]。在调控炎症反应这方面，miR-33s也可能起着关键的作用[5-6]。通过生物信息学分析，我们发现p38 MAPK 是miR-33s的一个潜在靶点。本实验将miR-33s拟似物(mimic)和miR-33s抑制剂(inhibitor)分别导入THP-1细胞内，人为上调或下调细胞内miR-33的表达水平，进而观察细胞p38 MAPK蛋白表达及细胞炎症因子分泌的变化来探讨其调控机制，以阐明miR-33s这种抑制作用主要是通过它的“seed suquence”作用于p38 MAPK 的 3′-URT来阻断p38 MAPK级联从而减轻炎症反应。目前相关miR-33的研究主要以调控脂质代谢为主[5]，而在调控炎症方面的研究较少，本实验为负性调控巨噬细胞提供新靶点,以及治疗脓毒症提供新思路。
材料与方法
一 材料
细胞系人单核细胞系细胞株THP-1购自中科院上海细胞生物所细胞中心。实验试剂脂多糖[LPS(from Escherichia coli 055:B5)]购自美国Sigma公司，RPMI-1640培养基DMEM培养基Opti-MEM培养基胎牛血清-巯基乙醇购自美国Gibco公司。miR-33s拟似物mimic和miR-33s inhibitor购自上海吉玛制药技术有限公司。TransIT-X2® Dynamic Delivery System转染试剂购自Miru公司。磷酸化的p38 MAPK 抗体、β-actin抗体购自Cell Signaling Technology,Inc。辣根过氧化物酶标记的二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6) ELISA试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司。
二 方法
1．THP-1-单核细胞培养及传代方法：将THP-1-单核细胞置于含10%胎血清的RPMI-1640培养基中，于37 ℃ 5% CO2培养箱静置培养。在培养液中加入10 mmol/L 的羟乙基哌秦乙硫磺酸(HEPES)和青霉素、链霉素各1.0×105 U/L。将THP-1单核细胞复苏后，按照悬浮细胞培养的方法传至3~6代后用于实验。
2．LPS诱导：THP-1-单核细胞分别以工作浓度为10.0 ng/mL的LPS诱导THP-1-单核细胞，用溶解LPS的磷酸盐缓冲液 (0 ng/mL LPS) 诱导THP-1细胞作空白对照，LPS诱导作用的时间为24 h。
3．过表达miR-33s实验分组及处理：①空白组: 采用等量磷酸盐缓冲液处理THP-1-单核细胞;②NC组: 转染mimic双链RNA至THP-1-单核细胞24 h;③miR-33s mimic组: 转染miR-33s mimic至THP-1-单核细胞24 h。
4．抑制miR-33s表达的实验分组及处理：①INC组: 转染inhibitor单链RNA至THP-1-单核细胞24 h; ②miR-33s inhibitor 组: 转染miR-33s至THP-1-单核细胞24 h。再以浓度为10.0 ng/mL的LPS诱导以上两组细胞24 h。
5．寡核苷酸序列设计与合成：miR-33s成熟体双链mimic是根据has-miR-33s家族成员的成熟体序列合成。miR-33s inhibitor则采用miR-33s家族成员成熟体的反向互补序列，并对所有碱基都进行了2′甲氧修饰。负对照双链RNA序列由上海吉玛生物公司合成，与所有哺乳动物的基因组没有同源性; 负对照单链RNA序列来自线虫，不与任何已知哺乳动物miRNA序列相匹配。
6．细胞转染取对数生长期细胞进行细胞转染：使用miRNA转染试剂TransIT-X2® Dynamic Delivery System转染细胞。将细胞密度为(8~10)×105 个/孔的THP-1-单核细胞细胞接种于含有2 mLRPMI-1640完全培养基的6板中，并置于37 ℃ 5% CO2培养箱过夜。将6.8 μL浓度为10 μmol/L的miRNA稀释于250 μL Opti-MEMI无血清培养基中，并加入7.5 μL TransIT-X2® Dynamic Delivery System转染试剂，轻柔混匀，室温孵育20 min。将miRNA TransIT-X2® Dynamic Delivery System混合液加入含有细胞以及培养液的6孔板各孔中，并将培养板置于37 ℃的CO2培养箱中培养24 h。各板孔培养基中的miRNA终浓度为25 nmol/L。
7．RFQ-PCR 检测细胞中 miR-33s的表达：收集未转染的THP-1-单核细胞以及转染miR-33s mimic和miR-33s inhibitor 24 h 后的THP-1-单核细胞，按TRIzol试剂盒说明书提取细胞总RNA，并按Invitrogen逆转录反应试剂盒说明书合成cDNA，反应产物置于－20 ℃保存备用或立即进行PCR扩增; cDNA 合成过程中采用miR-33s RT特异性物构建反转录体系,miR-33s RT引物序列为: 5′-GTC GTA TCC AGT GCG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TGC ACT GGA TAC GAC UUC ACG-3′; 内参照U6 RT=引物序列为: 5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3′。PCR过程按Invitrogen的M-MLVPlatinum 定量PCRSuperMix-UDG 试剂盒说明书在ABI7500荧光定量PCR仪上进行，使用U6作为内参照同时进行PCR。miR-33s正向引物序列5′-GGT TAG ATC TTG CTC CAG CGG TTT G-3′，反引物序列5′-GTA AAG CTT GCC CTC CTG TTT CCT G-3′，内参照U 6 正向引物序列为: 5′-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAAT-3′,反向引物序列为: 5′-CGC TTC ACG AAT TT GCG TGT CAT-3′。获得Ct 值后，应用比较Ct 法进行相对定量，目标基因的相对定量用2－ΔΔCt计算。
8．Western blot法检测转染后细胞p38MAPK 蛋白表达的改变：收集转染后 72 h 后的细胞,PBS洗涤 2次; 加 150 μL细胞裂解液于4 ℃裂解30 min 后,12 000 g 离心10 min,取上清液,采用 Bradford 法测定蛋白质的浓度。以β-actin的水平作为等量蛋白质上样对照(空白对照组),每个样本至少重复3遍。取60 μg蛋白质样品进行 SDS-PAGE 电泳,转至硝酸纤维膜上;室温封闭 2 h 后,用含0.05 %Tween-20的 TBS 缓冲液漂洗3次,每次10 min; 加入相应的p38 MAPK 单克隆抗体(1∶800),4 ℃孵育过夜,TBST 漂洗 3次后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗 (1∶5 000),37 ℃摇床温育 2 h,ECL 显色系统显色。最后经 ECL 系统曝光显影,通过凝胶分析系统分析蛋白的表达。
9．ELISA法检测细胞培养液中IL-1β释放量：收集经前述处理后的细胞悬液，1 500 r/min离心20 min，收集细胞培养液上清液，按照ELISA试剂盒说明书步骤，检测细胞培养液中IL-1β、TNF-α、IL-6的释放量。
三 统计学处理
应用 SPSS 16.0 统计软件进行统计分析,计量数据以
结果
一 miR-33s在细胞中的表达变化
RFQ-PCR检测结果显示,空白组miR-33s的相对表达量是352.00±85.56，miR-33s mimic转染组miR-33s的相对表达量是215 896.64±16 785.36,NC组miR-33s的相对表达量是420.68±78.43,miR-33s inhibitor组miR-33s的相对表达量是10.38±1.58,INC组miR-33s的相对表达量是287.97±16.05。各组的差异有统计学意义(P<0.05)，提示转染成功。
二 Western blot检测细胞 p38 MAPK 的蛋白表达
以空白对照组的灰度值为1,miR-33s mimic组、NC组、miR-33s inhibitor组、INC组的灰度值分别是0.330±0.021、0.890±0.017、3.128±0.069、0.920±0.026。与对照组和miR-33s inhibitor转染组组相比,miR-33s mimic转染组能明显降低p38 MAPK 蛋白表达水平 (P<0.005)。
图1
各组细胞的 Western blot分析
A:miR-33s mimic组; B:NC组; C:miR-33s inhibitor组;D: INC组;E:空白组
三 miR-33s对THP-1细胞释放炎症因子的影响
miR-33 mimic转染组细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β的释放量降低，与NC组比较差异有统计学意义(P<0.05)。miR-33s inhibitor组转染组细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β的释放量明显升高，与INC组相比有显著性差异(P<0.05)。NC组，INC组中TNF-α、IL-6、IL-1β释放量较空白组相比差异无统计学意义(P>0.05)。
表2
各组THP-1细胞炎症因子释放量比较(pg/mL)
讨论
脓毒症是由感染引起的全身炎症反应，与全身炎症反应综合征(SIRS)密切相关[7]。正常的机体炎症反应是一种对损伤因子的防御性反应，它可以防止组织损伤扩大，促进组织修复，是机体修复和生存所必需的。而过度的炎症反应会形成炎症瀑布效应，甚至使炎症反应失去控制，最终导致以细胞自身性破坏为特征的全身性炎症反应[8]。在各种炎症反应中，单核细胞的作用显著，在炎症早期，革兰阴性细菌胞壁成分之一LPS能刺激单核-巨噬细胞产生大量的炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)，促进脓毒症的发展[9]。
P-p38 MAPK是丝裂原活化蛋白激酶家族中的成员之一，在炎症反应中具有重要作用[10]。p38信号通路与炎症关系密切，它通过非磷酸化转化为磷酸化状态促进下游底物的磷酸化，从而活化下游底物转录因子ATF2、MEF2C,后两者的激活引起前炎症因子TNF-α、IL-1β释放增加[11]。LPS 是促进p38 MAPK 激活、产生炎症介质的强激活物，它通过与结合蛋白 (LP SBP) 相结合,形成 LPS-LPS BP 复合体,再与单核巨噬细面的 CD14 分子结合,激活p38信号通路，从而促发炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β) 的大量产生。
近年来研究发现miRNA可以在免疫细胞分化、免疫细胞信号转导、固有免疫应答和适应性免疫应答等多个层面对免疫反应进行调控[12-13]。Ho等[14]研究发现，miR-33可以靶向沉默RIP140抑制IL-1β和TNF-α等炎症因子的释放。RIP140作为一种转录辅抑制因子，可激活核因子κB (NF-κB)信号通路，调控炎症因子的表达[15]。一个miRNA可能有多个靶基因，因此我们推测miR-33在调节炎症因子的表达存在多个多个靶基因。通过生物信息学分析，我们发现p38 MAPK也是其中一个潜在的靶基因，这提示miR-33也可以通过靶向沉默p38 MAPK来调控炎症因子的释放。
本实验通过转染miR-33s的拟似物mimic 24 h后，使THP-1细胞过表达miR-33s，然后检测细胞p38MAPK浓度及炎症因子释放量，结果显示，其p38MAPK蛋白表达以及TNF-α、IL-6和IL-1β的释放量均较NC组明显降低(P<0.05)，提示过表达miR-33s可以通过抑制单核巨噬细胞p38信号通路，从而抑制炎症因子的释放。本实验还通过转染miR-33s inhibitor抑制miR-33s的表达，模拟miR-33s功能缺失实验，来观察抑制miR-33s的表达对炎症的作用。结果显示，抑制miR-33s的表达，其细胞的p38 MAPK蛋白表达以及TNF-α、IL-6和IL-1β的释放量均较INC组明显升高(P<0.05)。抑制miR-33s的表达对LPS诱导的炎症因子释放存在促进作用。我们从正反两方面论证了miR-33可能是通过靶向沉默P38MAPK，抑制炎症因子信号通路，负性调控THP-1细胞炎症因子的分泌。
本实验结果表明，过表达单核细胞内miR-33抑制炎症因子表达，抑制miR-33的表达则会促进炎症因子的表达，其可能的作用机制是通过调控p38MAPK信号转导通路来实现的。尽管脂质代谢中miR-33的调控功能已经得到证实[5, 16]，但是在调控炎症方面的研究很少。miR-33在调控单核细胞炎症反应中是否还存在其它的调控通路，还有待进一步研究。随着人们对miR-33与炎症调控关系的进一步研究，这将为脓毒血症的预防和治疗提供一个新的途径。
