引用本文： 周吉, 肖军. 抑制桩蛋白磷酸化对机械通气所致肺损伤的效应. 中国呼吸与危重监护杂志, 2015, 14(4): 362-367. doi: 10.7507/1671-6205.2015090 复制
目前，机械通气已经广泛应用于危重病人的救治，但随着呼吸机应用频繁，机械通气相关性肺损伤(ventilation induced lung injury，VILI)发生率也在逐年提高[1]，因此研究VILI的发病机制和防治有着重要的临床意义。来自机械通气的过度机械应力和周期性机械拉伸会增加血管通透性以及发生危及生命的脑水肿和肺水肿的风险[2]。机械通气引起的肺部牵拉增加了血管通透性，激活了炎症因子的释放，启动了细胞凋亡程序。这些过程在生物体内主要表现为肺泡出血，炎症细胞浸润，血氧不足，且常常合并高发病率和高死亡率的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)[3]。肺内皮细胞在循环血液和组织液之间形成一层半通透膜，它受到循环中生物活性分子、血液动力学因素、肺在呼吸周期中膨胀的动态调节[4]。实验研究表明细胞间裂隙的形成受到来自肌动球蛋白细胞骨架产生的两种平衡的相反作用力的调节[5-6]。肌动球蛋白细胞骨架主要通过黏着斑和黏着连接来调节细胞的向心拉力、细胞和细胞间的附着、细胞和基质之间的连接、黏着斑和黏着连接共同调节细胞的形态改变和内皮细胞通透性。黏着斑是由一种称为整联蛋白-胞内蛋白复合物[包括桩蛋白(Paxillin)、踝蛋白、斑联蛋白、黏着斑蛋白(FA)、Src激酶家族、黏着斑激酶(FAK)以及其他一些蛋白]的基质黏着受体联合形成。Paxillin是一种多结构域FA蛋白，它包含了在N端部分的4个LD域以及C端部分的4个LIM域，它的主要功能是作为分子脚手架。虽然Paxillin分子本身可能不具有酶活性，但因为其分子中含有多种结构域能够与一系列的信号蛋白和结构蛋白结合，决定了Paxillin可以作为一种“码头”或“支架”将来自上游的信号整合而高效地向下游传递。通过FAK或者Src家族非酪氨酸激酶受体介导的Paxillin的Tyr31和Tyr118的磷酸化为各种蛋白的连接创造了结合位点[7]。本实验主要讨究抑制Paxillin在Tyr31和Tyr118位点的磷酸化后机械通气所致肺损伤以及对下游相关信号链的影响，从而为VILI的防治提供新的理论机制和治疗策略。
材料与方法
一 材料
SPF级雄性SD大鼠60只，体重220~250 g，由桂林医学院实验动物中心提供。酪氨酸蛋白激酶抑制剂购自MedChem Express公司，Paxillin抗体和Paxillin(phospho-Y118)抗体均购自Bioworld。髓过氧化物酶(MPO)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。肿瘤坏死因子α(TNF-α)的ELISA测定试剂盒购自上海博古生物科技有限公司。TUNEL原位凋亡试剂盒购自Roche公司。
二 方法
1. 动物分组及模型制备：60只雄性SD大鼠随机分成正常对照组、保护性通气组、大潮气量通气组、PP2抑制剂组共4个实验组，每组15只。实验前禁食12 h，自由饮水。腹腔注射10%水合氯醛溶液(3 g/kg)麻醉大鼠，麻醉起效后行气管插管。正常对照组只进行气管切开插管，自然吸气；保护性通气组进行保护性通气2 h；大潮气量通气组进行大潮气量通气2 h；PP2抑制剂组分别为酪氨酸蛋白激酶抑制剂(PP2，5 mg/kg)+大潮气量机械通气2 h，PP2在机械通气前1 h腹腔注射。保护性通气呼吸机设置：潮气量6 mL/kg，频率60次/min，吸呼比1/2，呼气末正压5 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)；大潮气量通气呼吸机设置：潮气量40 mL/kg，频率40次/min，吸呼比1/2，呼气末正压0 cm H2O。每组中各取5只大鼠用于伊文思蓝(EB)检测肺血管通透性。酪氨酸蛋白激酶抑制剂PP2溶解于0.3 mL二甲基亚砜(DMSO)中。正常对照组、保护性通气组和大潮气量通气组试验前1 h腹腔注射0.3 mL不含抑制剂的DMSO溶液。
2. 标本采集：机械通气至预定时间点后于颈动脉放血处死大鼠。打开胸腔，结扎右侧肺门，气管切开，插入0.2 cm硅胶管，以4℃生理盐水2 mL反复灌洗左肺2次，记录每次灌洗液回收量后离心(3 000 r/min)10 min，取上凊－70℃保存备用。右肺上叶组织固定于10%多聚甲醛溶液用于病理切片和原位凋亡实验。右肺中叶用于检测肺湿/干重比值(W/D)。其余肺组织液氮冷冻用于蛋白免疫印迹法(Western blot)检测。
3. 检测指标及方法
(1) 肺组织病理学观察以及肺W/D测定：取右肺上叶组织固定于10%多聚甲醛溶液中，HE染色后光镜下观察组织切片。取右肺中叶称湿重后，60℃恒温箱烤72 h至肺干重恒定，称干重，计算W/D。
(2) 弥漫性肺泡损伤(diffused alveolar damage，DAD)评分[8]：由病理科医师按双盲法根据肺间质内中性粒细胞浸润、肺泡内出血、肺泡内纤维素渗出、肺间质水肿、肺泡内中性粒细胞浸润等5个方面，按照正常、轻、中、重分别评为0、1、2、3分，DAD评分为各项指标之和。
(3) EB法测定肺血管通透性：机械通气后颈外静脉注射1% EB 2 mg/kg，1 h后颈动脉放血处死大鼠，完整取出全肺，吸干表面水分及血液，称量湿重后剪下右肺中叶置于干试管中，按1 mL/100 mg湿肺组织加入甲酰胺。试管置于50℃恒温水浴24 h，浸出液用752型分光光度计(波长620 nm)上定量。左肺称重后剪碎，50℃干烤72 h至恒重，称量干重。以每克肺组织干重含有的EB质量表示。
(4) TUNEL原位细胞凋亡检测：取右肺上叶组织固定于10%多聚甲醛中，石蜡包埋，组织切片，脱蜡水化处理，用TUNEL反应混合物孵育(60 min，37℃)，洗脱样本荧光显微镜分析。
(5) Western blot检测肺组织中磷酸化桩蛋白(p-Paxillin)和Paxillin的表达：每组取100 mg肺组织，提取蛋白BCA法定量。各组取50μg蛋白样本加入上样缓冲液后开水煮沸8 min，SDS-PAGE电泳，采用半干法转膜(恒流100 mA，60 min)，PVDF膜放入5%脱脂牛奶中常温封闭1 h，孵育一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜，室温孵育二抗1 h后，TBST洗膜，发光、显影后拍照并进行图像分析。
(6) 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TNF-α：ELISA法检测各组大鼠肺泡灌洗液中的TNF-α的水平。
(7) 肺组织MPO活性测定：取等质量－80℃冻存的肺组织，在冰浴中制作成10%的肺组织匀浆。组织匀浆后照试剂盒说明测定肺组织中的MPO活性。
三 统计学处理
采用SPSS 18.0统计软件做数据分析，实验数据以
结果
一 大鼠肺组织病理观察、DAD评分、EB渗出量、W/D、肺泡灌洗液中TNF-α浓度以及肺组织MPO活性
正常对照组与保护性通气组比较，DAD评分、EB渗出量、W/D、MPO及TNF-α差异均无统计学意义(P＞0.05)。大潮气量通气组与PP2抑制剂组比较，以上指标差异均有统计学意义(P＜0.05)。肺组织病理观察发现，正常对照组肺组织正常，没有组织学损伤改变；保护性通气组肺泡结构比较完整，有少量炎细胞浸润，肺泡间隔无水肿，肺泡腔无明显渗出物；大潮气量通气组肺泡间隔增厚，肺泡腔内弥漫浸润炎性细胞，肺泡腔大量渗出物，部分肺泡萎陷或破裂；PP2抑制剂组肺损伤明显减轻，肺泡结构完整，少量炎细胞浸润，肺泡腔有少量渗出物。结果见表 1和图 1。
表1
各组大鼠肺DAD评分、EB渗出量、W/D、MPO及TNF-α浓度比较(n=15，
图1
光镜下各组大鼠肺组织病理组织像(HE×200) a. 正常对照组；b. 保护性通气组；c. 大潮气量通气组；d. PP2抑制剂组
二 TUNEL原位细胞凋亡检测
正常对照组与保护性通气组比较，肺组织原位细胞凋亡率差异无统计学意义[(8.21±2.24)%比(9.36±3.31)%，P＞0.05]。大潮气量通气组与PP2抑制剂组比较，凋亡率差异有统计学意义[(63.01±5.21)%比(25.12±4.37)%，P＜0.05]。各组凋亡率从高到低排序为：大潮气量通气组＞PP2抑制剂组＞保护性通气组＞正常对照组。结果见图 2。
图2
各组TUNEL原位细胞凋亡检测像 a. 正常对照组；b. 保护性通气组；c. 大潮气量通气组；d. PP2抑制剂组
三 Western blot检测p-Paxillin和Paxillin表达
大潮气量通气组与PP2抑制剂组比较，p-Paxillin的表达量明显增高，差异有统计学意义(P＜0.05)，Paxillin的表达量差异无统计学意义(P＞0.05)。保护性通气组与正常对照组比较，p-Paxillin和Paxillin表达量均较高，差异有统计学意义(P＜0.05)。正常对照组与保护性通气组、大潮气量通气组、PP2抑制剂组比较，p-Paxillin和Paxillin表达量差异均有统计学意义(P＜0.05)。保护性通气组、大潮气量通气组和PP2抑制剂组间Paxillin的表达量差异无统计学意义(P＞0.05)。结果见图 3和表 2。
图3
各组p-Paxillin和Paxillin表达电泳图
1：正常对照组；2：保护性通气组；3：大潮气量通气组；4：PP2抑制剂组
表2
各组p-Paxillin和Paxillin相对表达量(n=15，讨论
近年来随着机械通气的广泛应用，VILI发生率也逐年提高，关于VILI的研究也日趋深入。最近研究表明，在过度机械应力下出现的细胞及组织损伤是肺生物学一个比较新的、过去被忽略的领域，也是肺损伤发生及发展的主要原因之一[9]。机械应力损伤可造成早期组织间隙水肿，内皮细胞细胞膜水泡以及连接细胞之间的基底膜缺失，长时间的损伤造成细胞内及细胞间裂隙的形成以及广泛细胞破坏后基底膜的裸露[10]。因此，研究内皮细胞屏障受损以及细胞间裂隙的形成机制非常重要。
Paxillin最早是在V-SRC转染的细胞中发现的，后在平滑肌组织中得到了它的纯化蛋白，并确定它是黏着斑蛋白的结合蛋白。Paxillin通过FAK或Src激酶介导的Tyr31和Tyr118位点的磷酸化产生了SH2结合结构域，是一种调节蛋白质相互作用的重要方式。FA特定的蛋白间相互作用和特定的磷酸化位点与内皮细胞在受到机械应力和化学刺激时屏障保护和屏障破坏反应有关[11-12]。
本实验中我们使用SD大鼠复制机械通气肺损伤模型，使用Src酪氨酸蛋白激酶抑制剂PP2活体注射来研究Paxillin的Tyr118和Tyr31磷酸化在机械通气肺损伤过程中的作用。结果发现大潮气量通气组的大鼠肺部病理切片表现出明显的炎症损伤改变，原位细胞凋亡检测、W/D、TNF-α浓度和MPO活性等指标均显示VILI模型复制成功，而小潮气量高PEEP的保护性通气组和PP2抑制剂组的大鼠肺损伤程度较大潮气量通气组明显减轻。由此可见，抑制剂PP2对减轻大鼠呼吸机肺损伤作用明显。Western blot结果显示，在机械通气后Paxillin的表达量在保护性通气组、大潮气量通气组和PP2抑制剂组中基本相同；而p-Paxillin在大潮气量通气组中显著增高，在正常对照组和保护性通气中组p-Paxillin表达量较低，PP2抑制剂组中p-Paxillin表达量很低。以上结果说明PP2对Paxillin Tyr31和Tyr118位点磷酸化产生了明显的抑制效应。综合以上实验数据，我们认为抑制Paxillin磷酸化可明显降低肺毛细血管通透性，减少肺损伤，同时能够抑制炎症因子、炎症细胞的趋化，抑制细胞凋亡，机械通气肺损伤明显减轻。
FAK和Src都能调节Paxillin在Tyr31和Tyr118处的磷酸化，而我们使用了Src激酶抑制PP2来抑制Paxillin磷酸化，Paxillin无法产生SH2结合结构域，没有该结构域提供特异性的结合位点，导致FA的特定的几种蛋白间交互作用无法进行，进而细胞屏障破坏进程被终止，阻止了肺内皮细胞通透性降低。这些变化主要体现在大鼠在机械通气时肺部的炎性改变明显减轻。Petit等[13]在研究中也有类似的发现，胶原蛋白诱导的NBT-II细胞运动伴随着Paxillin的酪氨酸磷酸化，如果把其分子中两个最主要的酪氨酸Y31和Y118突变为苯丙氨酸并在细胞中过表达，则可以有效抑制细胞的迁徙。
生物机械力作用在血管内皮细胞上，刺激引起了一系列的信号级联放大，由MAP激酶(p42/44 MAPK、JNK和p38)、非受体酪氨酸激酶(Src和FAK)、整联蛋白信号、离子通道和Rho家族的GTPases，共同决定了内皮细胞的通透性[14-16]。周期牵拉诱导实验中，Rho-GTPase信号通路的激活可以加剧内皮细胞细胞屏障的破环，而在体内和体外急性肺损伤模型中减弱Rho激酶的活性可以减少肺血管的渗出和促进屏障功能的恢复[11, 17]。结合本实验研究结果，可以推测大潮气量机械通气激活了Src和FAK，使Paxillin Tyr31和Tyr118位点磷酸化，产生SH2结合结构域，其为p42/44 MAPK，JNK、p38、Paxillin之间发生交互作用提供一个反应平台，形成某些特定的复合物，该复合物作为一种信号小体进一步激活下游RHO-GTPase信号通路，加剧细胞屏障破环，肺血管渗出加重，激活炎症因子的释放，启动细胞凋亡程序，进而引发严重的呼吸机相关性肺损伤。
虽然我们的研究发现了抑制Paxillin磷酸化可以明显改善机械通气肺损伤，但Paxillin磷酸化后对下游MAP激酶、整联蛋白等的确切影响以及它们之间相互作用方式仍尚待研究。总而言之，抑制Paxillin磷酸化能够降低肺毛细血管通透性，减少炎性因子释放，抑制细胞凋亡程序的启动。Paxillin的Tyr118和Tyr31磷酸化位点在机械通气肺损伤的病理损伤过程中发挥了重要的功能。对于Paxillin磷酸化后下游信号链的变化及对机械通气肺损伤效应的确切机制仍需更深入的研究。
目前，机械通气已经广泛应用于危重病人的救治，但随着呼吸机应用频繁，机械通气相关性肺损伤(ventilation induced lung injury，VILI)发生率也在逐年提高[1]，因此研究VILI的发病机制和防治有着重要的临床意义。来自机械通气的过度机械应力和周期性机械拉伸会增加血管通透性以及发生危及生命的脑水肿和肺水肿的风险[2]。机械通气引起的肺部牵拉增加了血管通透性，激活了炎症因子的释放，启动了细胞凋亡程序。这些过程在生物体内主要表现为肺泡出血，炎症细胞浸润，血氧不足，且常常合并高发病率和高死亡率的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)[3]。肺内皮细胞在循环血液和组织液之间形成一层半通透膜，它受到循环中生物活性分子、血液动力学因素、肺在呼吸周期中膨胀的动态调节[4]。实验研究表明细胞间裂隙的形成受到来自肌动球蛋白细胞骨架产生的两种平衡的相反作用力的调节[5-6]。肌动球蛋白细胞骨架主要通过黏着斑和黏着连接来调节细胞的向心拉力、细胞和细胞间的附着、细胞和基质之间的连接、黏着斑和黏着连接共同调节细胞的形态改变和内皮细胞通透性。黏着斑是由一种称为整联蛋白-胞内蛋白复合物[包括桩蛋白(Paxillin)、踝蛋白、斑联蛋白、黏着斑蛋白(FA)、Src激酶家族、黏着斑激酶(FAK)以及其他一些蛋白]的基质黏着受体联合形成。Paxillin是一种多结构域FA蛋白，它包含了在N端部分的4个LD域以及C端部分的4个LIM域，它的主要功能是作为分子脚手架。虽然Paxillin分子本身可能不具有酶活性，但因为其分子中含有多种结构域能够与一系列的信号蛋白和结构蛋白结合，决定了Paxillin可以作为一种“码头”或“支架”将来自上游的信号整合而高效地向下游传递。通过FAK或者Src家族非酪氨酸激酶受体介导的Paxillin的Tyr31和Tyr118的磷酸化为各种蛋白的连接创造了结合位点[7]。本实验主要讨究抑制Paxillin在Tyr31和Tyr118位点的磷酸化后机械通气所致肺损伤以及对下游相关信号链的影响，从而为VILI的防治提供新的理论机制和治疗策略。
材料与方法
一 材料
SPF级雄性SD大鼠60只，体重220~250 g，由桂林医学院实验动物中心提供。酪氨酸蛋白激酶抑制剂购自MedChem Express公司，Paxillin抗体和Paxillin(phospho-Y118)抗体均购自Bioworld。髓过氧化物酶(MPO)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。肿瘤坏死因子α(TNF-α)的ELISA测定试剂盒购自上海博古生物科技有限公司。TUNEL原位凋亡试剂盒购自Roche公司。
二 方法
1. 动物分组及模型制备：60只雄性SD大鼠随机分成正常对照组、保护性通气组、大潮气量通气组、PP2抑制剂组共4个实验组，每组15只。实验前禁食12 h，自由饮水。腹腔注射10%水合氯醛溶液(3 g/kg)麻醉大鼠，麻醉起效后行气管插管。正常对照组只进行气管切开插管，自然吸气；保护性通气组进行保护性通气2 h；大潮气量通气组进行大潮气量通气2 h；PP2抑制剂组分别为酪氨酸蛋白激酶抑制剂(PP2，5 mg/kg)+大潮气量机械通气2 h，PP2在机械通气前1 h腹腔注射。保护性通气呼吸机设置：潮气量6 mL/kg，频率60次/min，吸呼比1/2，呼气末正压5 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)；大潮气量通气呼吸机设置：潮气量40 mL/kg，频率40次/min，吸呼比1/2，呼气末正压0 cm H2O。每组中各取5只大鼠用于伊文思蓝(EB)检测肺血管通透性。酪氨酸蛋白激酶抑制剂PP2溶解于0.3 mL二甲基亚砜(DMSO)中。正常对照组、保护性通气组和大潮气量通气组试验前1 h腹腔注射0.3 mL不含抑制剂的DMSO溶液。
2. 标本采集：机械通气至预定时间点后于颈动脉放血处死大鼠。打开胸腔，结扎右侧肺门，气管切开，插入0.2 cm硅胶管，以4℃生理盐水2 mL反复灌洗左肺2次，记录每次灌洗液回收量后离心(3 000 r/min)10 min，取上凊－70℃保存备用。右肺上叶组织固定于10%多聚甲醛溶液用于病理切片和原位凋亡实验。右肺中叶用于检测肺湿/干重比值(W/D)。其余肺组织液氮冷冻用于蛋白免疫印迹法(Western blot)检测。
3. 检测指标及方法
(1) 肺组织病理学观察以及肺W/D测定：取右肺上叶组织固定于10%多聚甲醛溶液中，HE染色后光镜下观察组织切片。取右肺中叶称湿重后，60℃恒温箱烤72 h至肺干重恒定，称干重，计算W/D。
(2) 弥漫性肺泡损伤(diffused alveolar damage，DAD)评分[8]：由病理科医师按双盲法根据肺间质内中性粒细胞浸润、肺泡内出血、肺泡内纤维素渗出、肺间质水肿、肺泡内中性粒细胞浸润等5个方面，按照正常、轻、中、重分别评为0、1、2、3分，DAD评分为各项指标之和。
(3) EB法测定肺血管通透性：机械通气后颈外静脉注射1% EB 2 mg/kg，1 h后颈动脉放血处死大鼠，完整取出全肺，吸干表面水分及血液，称量湿重后剪下右肺中叶置于干试管中，按1 mL/100 mg湿肺组织加入甲酰胺。试管置于50℃恒温水浴24 h，浸出液用752型分光光度计(波长620 nm)上定量。左肺称重后剪碎，50℃干烤72 h至恒重，称量干重。以每克肺组织干重含有的EB质量表示。
(4) TUNEL原位细胞凋亡检测：取右肺上叶组织固定于10%多聚甲醛中，石蜡包埋，组织切片，脱蜡水化处理，用TUNEL反应混合物孵育(60 min，37℃)，洗脱样本荧光显微镜分析。
(5) Western blot检测肺组织中磷酸化桩蛋白(p-Paxillin)和Paxillin的表达：每组取100 mg肺组织，提取蛋白BCA法定量。各组取50μg蛋白样本加入上样缓冲液后开水煮沸8 min，SDS-PAGE电泳，采用半干法转膜(恒流100 mA，60 min)，PVDF膜放入5%脱脂牛奶中常温封闭1 h，孵育一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜，室温孵育二抗1 h后，TBST洗膜，发光、显影后拍照并进行图像分析。
(6) 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TNF-α：ELISA法检测各组大鼠肺泡灌洗液中的TNF-α的水平。
(7) 肺组织MPO活性测定：取等质量－80℃冻存的肺组织，在冰浴中制作成10%的肺组织匀浆。组织匀浆后照试剂盒说明测定肺组织中的MPO活性。
三 统计学处理
采用SPSS 18.0统计软件做数据分析，实验数据以
结果
一 大鼠肺组织病理观察、DAD评分、EB渗出量、W/D、肺泡灌洗液中TNF-α浓度以及肺组织MPO活性
正常对照组与保护性通气组比较，DAD评分、EB渗出量、W/D、MPO及TNF-α差异均无统计学意义(P＞0.05)。大潮气量通气组与PP2抑制剂组比较，以上指标差异均有统计学意义(P＜0.05)。肺组织病理观察发现，正常对照组肺组织正常，没有组织学损伤改变；保护性通气组肺泡结构比较完整，有少量炎细胞浸润，肺泡间隔无水肿，肺泡腔无明显渗出物；大潮气量通气组肺泡间隔增厚，肺泡腔内弥漫浸润炎性细胞，肺泡腔大量渗出物，部分肺泡萎陷或破裂；PP2抑制剂组肺损伤明显减轻，肺泡结构完整，少量炎细胞浸润，肺泡腔有少量渗出物。结果见表 1和图 1。
表1
各组大鼠肺DAD评分、EB渗出量、W/D、MPO及TNF-α浓度比较(n=15，
图1
光镜下各组大鼠肺组织病理组织像(HE×200) a. 正常对照组；b. 保护性通气组；c. 大潮气量通气组；d. PP2抑制剂组
二 TUNEL原位细胞凋亡检测
正常对照组与保护性通气组比较，肺组织原位细胞凋亡率差异无统计学意义[(8.21±2.24)%比(9.36±3.31)%，P＞0.05]。大潮气量通气组与PP2抑制剂组比较，凋亡率差异有统计学意义[(63.01±5.21)%比(25.12±4.37)%，P＜0.05]。各组凋亡率从高到低排序为：大潮气量通气组＞PP2抑制剂组＞保护性通气组＞正常对照组。结果见图 2。
图2
各组TUNEL原位细胞凋亡检测像 a. 正常对照组；b. 保护性通气组；c. 大潮气量通气组；d. PP2抑制剂组
三 Western blot检测p-Paxillin和Paxillin表达
大潮气量通气组与PP2抑制剂组比较，p-Paxillin的表达量明显增高，差异有统计学意义(P＜0.05)，Paxillin的表达量差异无统计学意义(P＞0.05)。保护性通气组与正常对照组比较，p-Paxillin和Paxillin表达量均较高，差异有统计学意义(P＜0.05)。正常对照组与保护性通气组、大潮气量通气组、PP2抑制剂组比较，p-Paxillin和Paxillin表达量差异均有统计学意义(P＜0.05)。保护性通气组、大潮气量通气组和PP2抑制剂组间Paxillin的表达量差异无统计学意义(P＞0.05)。结果见图 3和表 2。
图3
各组p-Paxillin和Paxillin表达电泳图
1：正常对照组；2：保护性通气组；3：大潮气量通气组；4：PP2抑制剂组
表2
各组p-Paxillin和Paxillin相对表达量(n=15，讨论
近年来随着机械通气的广泛应用，VILI发生率也逐年提高，关于VILI的研究也日趋深入。最近研究表明，在过度机械应力下出现的细胞及组织损伤是肺生物学一个比较新的、过去被忽略的领域，也是肺损伤发生及发展的主要原因之一[9]。机械应力损伤可造成早期组织间隙水肿，内皮细胞细胞膜水泡以及连接细胞之间的基底膜缺失，长时间的损伤造成细胞内及细胞间裂隙的形成以及广泛细胞破坏后基底膜的裸露[10]。因此，研究内皮细胞屏障受损以及细胞间裂隙的形成机制非常重要。
Paxillin最早是在V-SRC转染的细胞中发现的，后在平滑肌组织中得到了它的纯化蛋白，并确定它是黏着斑蛋白的结合蛋白。Paxillin通过FAK或Src激酶介导的Tyr31和Tyr118位点的磷酸化产生了SH2结合结构域，是一种调节蛋白质相互作用的重要方式。FA特定的蛋白间相互作用和特定的磷酸化位点与内皮细胞在受到机械应力和化学刺激时屏障保护和屏障破坏反应有关[11-12]。
本实验中我们使用SD大鼠复制机械通气肺损伤模型，使用Src酪氨酸蛋白激酶抑制剂PP2活体注射来研究Paxillin的Tyr118和Tyr31磷酸化在机械通气肺损伤过程中的作用。结果发现大潮气量通气组的大鼠肺部病理切片表现出明显的炎症损伤改变，原位细胞凋亡检测、W/D、TNF-α浓度和MPO活性等指标均显示VILI模型复制成功，而小潮气量高PEEP的保护性通气组和PP2抑制剂组的大鼠肺损伤程度较大潮气量通气组明显减轻。由此可见，抑制剂PP2对减轻大鼠呼吸机肺损伤作用明显。Western blot结果显示，在机械通气后Paxillin的表达量在保护性通气组、大潮气量通气组和PP2抑制剂组中基本相同；而p-Paxillin在大潮气量通气组中显著增高，在正常对照组和保护性通气中组p-Paxillin表达量较低，PP2抑制剂组中p-Paxillin表达量很低。以上结果说明PP2对Paxillin Tyr31和Tyr118位点磷酸化产生了明显的抑制效应。综合以上实验数据，我们认为抑制Paxillin磷酸化可明显降低肺毛细血管通透性，减少肺损伤，同时能够抑制炎症因子、炎症细胞的趋化，抑制细胞凋亡，机械通气肺损伤明显减轻。
FAK和Src都能调节Paxillin在Tyr31和Tyr118处的磷酸化，而我们使用了Src激酶抑制PP2来抑制Paxillin磷酸化，Paxillin无法产生SH2结合结构域，没有该结构域提供特异性的结合位点，导致FA的特定的几种蛋白间交互作用无法进行，进而细胞屏障破坏进程被终止，阻止了肺内皮细胞通透性降低。这些变化主要体现在大鼠在机械通气时肺部的炎性改变明显减轻。Petit等[13]在研究中也有类似的发现，胶原蛋白诱导的NBT-II细胞运动伴随着Paxillin的酪氨酸磷酸化，如果把其分子中两个最主要的酪氨酸Y31和Y118突变为苯丙氨酸并在细胞中过表达，则可以有效抑制细胞的迁徙。
生物机械力作用在血管内皮细胞上，刺激引起了一系列的信号级联放大，由MAP激酶(p42/44 MAPK、JNK和p38)、非受体酪氨酸激酶(Src和FAK)、整联蛋白信号、离子通道和Rho家族的GTPases，共同决定了内皮细胞的通透性[14-16]。周期牵拉诱导实验中，Rho-GTPase信号通路的激活可以加剧内皮细胞细胞屏障的破环，而在体内和体外急性肺损伤模型中减弱Rho激酶的活性可以减少肺血管的渗出和促进屏障功能的恢复[11, 17]。结合本实验研究结果，可以推测大潮气量机械通气激活了Src和FAK，使Paxillin Tyr31和Tyr118位点磷酸化，产生SH2结合结构域，其为p42/44 MAPK，JNK、p38、Paxillin之间发生交互作用提供一个反应平台，形成某些特定的复合物，该复合物作为一种信号小体进一步激活下游RHO-GTPase信号通路，加剧细胞屏障破环，肺血管渗出加重，激活炎症因子的释放，启动细胞凋亡程序，进而引发严重的呼吸机相关性肺损伤。
虽然我们的研究发现了抑制Paxillin磷酸化可以明显改善机械通气肺损伤，但Paxillin磷酸化后对下游MAP激酶、整联蛋白等的确切影响以及它们之间相互作用方式仍尚待研究。总而言之，抑制Paxillin磷酸化能够降低肺毛细血管通透性，减少炎性因子释放，抑制细胞凋亡程序的启动。Paxillin的Tyr118和Tyr31磷酸化位点在机械通气肺损伤的病理损伤过程中发挥了重要的功能。对于Paxillin磷酸化后下游信号链的变化及对机械通气肺损伤效应的确切机制仍需更深入的研究。
