引用本文： 杨永超, 杨东鹏, 杨博, 林曦, 董文鹏, 王晓武. 野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠心肺组织变化研究. 中国呼吸与危重监护杂志, 2015, 14(4): 380-384. doi: 10.7507/1671-6205.2015094 复制
肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一种发病率不高但极具破坏性的疾病，其特点是肺血管中膜进行性增厚和内膜纤维化，导致肺小动脉和微小阻力血管闭塞，最终形成血管丛状增生改变，肺动脉内皮细胞程序性凋亡和功能障碍，在PAH早期发病机制中起重要作用[1]。目前除肺移植外尚没有对PAH真正行之有效的治疗手段。美国和英国大规模登记调查显示，PAH患者的5年生存率仅在20%~57%之间[2-3]。野百合碱(monocrotaline，MCT)是一种从豆科植物猪屎豆种子中提取出的双苄基异喹啉类生物碱，机体摄入MCT后会引起一种类似PAH的综合表现[4]，因而被广泛用于PAH造模。尽管应用广泛，但目前国内外对MCT模型病理指标的观察研究不够系统全面。本实验旨在通过对MCT诱导的PAH大鼠模型病理改变及相关指标进行观察测量，观察分析模型产生的病理机制，为科研选择造模方式提供参考。
材料与方法
一 材料
由广东医学实验动物中心提供SPF级健康雄性SD大鼠24只，体重(250±20)g，日龄60~80 d，动物合格证号No.44007200007336；饲养于广州军区广州总医院实验动物中心SPF级实验动物中心。16通道生理信号记录分析系统(MP100，美国BIOPAC公司)；电子分析天平(AE-100，瑞士Mettler公司)；MCT(37024，美国Sigma公司)；正置荧光显微镜(BX51，日本OLYMPUS公司)；透射电子显微镜(H-7650，日本HITACHI公司)。
二 方法
1. 实验分组及模型建立：大鼠分笼饲养(5~6只/笼)，常规饲料喂养，室温22~24℃，相对湿度60%左右，早8点至晚8点自动照明。动物购置后适应性饲养1周。所有实验动物称重，随机分为实验组和对照组。实验组予MCT溶液(无水乙醇与生理盐水按1∶4混合溶解)60 mg/kg腹腔注射[4]，对照组给予无水乙醇与生理盐水1∶4混合溶液等体积腹腔注射，正常饲养21 d。
2. 检测指标：21 d后大鼠称重，水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，胸前小切口开胸测量平均肺动脉压(mean pulmonary artery pressure，mPAP)；放血处死大鼠，灭菌生理盐水冲洗大鼠肺组织，切取右肺第2叶，放入4%多聚甲醛溶液中保存24 h，制作石蜡切块用于HE染色和Masson染色，观察肺组织中小动脉病理变化。切取左肺门组织6块，每块大小1 mm×1 mm×1 mm，放入3%戊二醛溶液保存，电子显微镜观察肺中小动脉超微结构变化。切取大鼠完整心脏，完整分离右心室(right ventricle，RV)、左心室和室间隔(left ventricle and interventricular septum，LV+S)，电子分析天平分别称重，计算右心室肥厚指数RV/(LV+S)。光镜(×200)下观察HE染色、Masson染色切片，应用Image-pro图像分析系统，选择直径100~200μm的肺中小动脉，测量其外径(external diameter，ED)、内径(internal diameter，ID)、中膜厚度(media thickness of pulmonary arterioles，PAMT，PAWT=2×medial wall thickness/external diameter)，计算其中膜面积(wall area，WA)、血管总面积(total area，TA)、血管腔面积(lumen area，LA)、膜厚度与动脉外径比值[WT%，WT%=2×PAMT/ED×100%]、中膜面积与血管总面积比值[WA%，WA%=(TA－LA)/TA×100%]作为肺血管重建的指标。每只大鼠各测量10根血管，并求其均值。计数肺中小动脉中膜平滑肌细胞核密度(smooth muscle cell nuclei density，SMC，以100μm×100μm大小范围内细胞核数目表示)。测量心肌细胞直径(cardiomyocyte diameter，CD)，计数心肌细胞核密度(myocardial nuclear density，MND，每100μm×100μm大小范围内细胞核数)，作为右心室重塑的指标。
三 统计学处理
全部数据经SPSS 19.0统计软件进行分析，实验数据以
结果
一 大鼠一般状态和大体病理
对照组大鼠从实验开始至3周后终止未出现明显异常改变，体重正常增长，全程无死亡。实验组大鼠MCT腹腔注射1周内未出现明显特征性改变。第2周开始逐渐出现活动减少，蜷卧闭眼，反应迟钝，呼吸急促，进食进水明显下降，毛发变黄，干枯杂乱，鼻部、唇周、趾端等处出现发绀，鼻周分泌物明显增多，皮下脂肪明显减少，体重下降。其中2只大鼠出现腹部膨隆，触之有明显波动感，并分别于第18 d和第20 d死亡，考虑为重度PAH导致右心衰竭所致。2只死亡大鼠解剖开胸后见明显胸腔积液，心脏增大明显，右心室游离壁明显增厚，右心室腔扩大，腹腔大量积液，均约10 mL左右。后期解剖时见对照组大鼠肺组织表面光滑，粉红色，富有弹性，心脏解剖未见异常。实验组大鼠肺表面大量瘀斑瘀点，变硬，颜色紫暗，短轴横切心脏可见右心室游离壁明显增厚，右心室腔扩大。实验开始前两组体重无统计学差异，实验结束后实验组较对照组体重明显下降(P＜0.01)，结果见表 1。
表1
两组体重比较(n=12，g，二 心肺组织镜下改变
1. 心肌组织HE染色比较：与对照组比较，实验组大鼠心肌细胞排列明显紊乱，心肌细胞间隙变窄，心肌细胞肥大。结果见图 1。
图1
心肌病理组织像(HE×100) a. 对照组；b. 实验组 图 2 肺病理组织像示肺中小动脉(HE×200) a. 对照组；b. 实验组
2. 肺组织HE染色、MASSON染色比较：与对照组比较，实验组大鼠肺组织中小动脉血管壁明显增厚，管腔明显狭窄甚至堵塞，肺泡结构明显萎缩变形，间质中大量炎症细胞浸润；肺组织胶原纤维大量增生，血管周围处增生更加明显。结果见图 2和图 3。
图3
肺病理组织像示肺中小动脉(Masson×200) a. 对照组；b. 实验组 图 4 肺小动脉血管内皮细胞电子显微镜像(×30 000) a. 对照组；b. 实验组
3. 肺血管内皮细胞电镜观察：正常对照组大鼠肺动脉内皮细胞单层扁平排列，核缘光滑，染色质较少，细胞器数量正常。与对照组比较，实验组大鼠肺动脉内皮细胞数量增多，形态肿胀并向管腔内突出，细胞核形态不规则，胞浆内空泡增多，细胞器明显增多；弹力纤维增生且排列杂乱；间质内大量炎症细胞浸润。结果见图 4。
4. 测量指标比较：与对照组比较，实验组大鼠mPAP和RV/(LV+S)显著升高(P＜0.01)，心肺组织检测并计算的指标SMC、PAMT、WT%、WA%、AD、MND差异均有统计学意义(P＜0.05)。结果见表 2和表 3。
表2
两组mPAP、RV/(LV+S)、AD和MND比较(
表3
两组SMC、PAMT、WT%和WA%比较(讨论
PAH造模方式有多种，主要分为单因素病理损伤模型、多因素病理损伤模型、基因敲除模型、基因过表达模型四大类，其中单因素病理损伤模型因作用机制明确、模型生成稳定、操作简便且价格相对便宜而应用最广，尤其MCT模型和慢性缺氧模型[5]。任何单因素模型不能完全复制复杂的临床疾病[6]，因此应运而生出现多因素病理损伤模型。多因素病理损伤模型是两种或两种以上单因素病理损伤的叠加，如MCT+左肺切除等[7]，更加接近临床PAH患者的发病情况，但因需要处理和涉及的变量较多，发病机制较为复杂，不便于操作以及后期对模型治疗效果进行分析研究，故应用偏少。基因敲除模型，如敲除大鼠内皮素受体B基因等，同样可诱发PAH形成，模型稳定性高、可重复性好，但实际操作中技术要求高且操作难度大，实验费用昂贵，限制了其在科研中的应用。基因过表达模型，如血管生成素1等基因的过表达，其造模效果目前尚存在争议[5]。
MCT在大鼠肝脏内经P450单氧化酶转化后，可形成具有生物活性的脱氢产物MCT吡咯，后者在血流通过肺脏时，可沉积于肺小动脉壁及肺毛细血管，选择性地引起肺动脉血管内皮细胞不可逆性损伤，诱导肺动脉血管壁重建并引起PAH[8]。从本实验结果来看，MCT能够显著升高大鼠肺动脉压力，引起右心室肥大，其中肺部血管重塑较为明显，内皮细胞破坏甚至出现丛状增生，结构完整性遭到破坏，亚细胞结构可见细胞核形态不规则改变，细胞质基质增多，细胞器数量增加形态改变，如内质网扩张、高尔基体增生和空泡增多等；内皮细胞连续性遭到破坏后引起平滑肌细胞暴露，受到各种刺激因素作用而出现大量增生，引起血管管腔明显狭窄，增加肺血管阻力；纤维结构染色可见血管壁及其周围纤维组织大量增生，排列杂乱，间质内炎症细胞大量增生，引起血管过度收缩而加重PAH。心肌肥厚明显，心肌细胞大量增生，细胞直径增加，细胞间隙变窄，引起右心室重塑。因此，我们认为MCT可成功诱导形成稳定的PAH、右心室肥厚模型，其成因可能与大鼠肺血管内皮细胞丛状增生、平滑肌细胞增生、胶原纤维大量增生引起血管腔严重狭窄甚至闭塞，心肌细胞代偿性肥大、增生等变化有关。
对PAH的研究已经持续了百余年，但尚未能完全明确其发病机制。传统对PAH发病的分子生物学机制的研究包括低氧诱导因子1、5-羟色胺、弹性蛋白酶活性、超氧化物歧化酶、钙离子和钾离子通道等，主要集中在个别信号分子及相关信号通路的研究。近几年来随着基因技术的快速发展，人们正在努力在基因水平上重新定义PAH。对细胞信号传导、细胞转化、细胞与细胞间相互作用、miRNA的加工、线粒体和离子通道的功能改变等机制的深入研究，极大帮助我们认识了PAH发病机制中基因水平的改变，深入解释了血管细胞异常反应所带来的损伤作用[9]。亚裔人口中最常见的骨形态发生蛋白型受体Ⅱ基因(BMPR2)突变已被确认可导致遗传性肺动脉高压(HPAH)[10]。而有可能引起PAH的基因突变还有SMAD、TBX4和TSP1等[11-13]。全基因组关联研究(GWAS)提出了CBLN2轨迹与PAH的发生相关联[14]。转化生长因子β1和BMPR2信号之间的不平衡可能会刺激炎症细胞因子的表达和白细胞外渗，引起肺血管重塑[15]。因此，深入研究PAH基因水平的发病机制，并同传统信号分子研究相结合将是未来治疗和研究PAH的重要方向。
肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一种发病率不高但极具破坏性的疾病，其特点是肺血管中膜进行性增厚和内膜纤维化，导致肺小动脉和微小阻力血管闭塞，最终形成血管丛状增生改变，肺动脉内皮细胞程序性凋亡和功能障碍，在PAH早期发病机制中起重要作用[1]。目前除肺移植外尚没有对PAH真正行之有效的治疗手段。美国和英国大规模登记调查显示，PAH患者的5年生存率仅在20%~57%之间[2-3]。野百合碱(monocrotaline，MCT)是一种从豆科植物猪屎豆种子中提取出的双苄基异喹啉类生物碱，机体摄入MCT后会引起一种类似PAH的综合表现[4]，因而被广泛用于PAH造模。尽管应用广泛，但目前国内外对MCT模型病理指标的观察研究不够系统全面。本实验旨在通过对MCT诱导的PAH大鼠模型病理改变及相关指标进行观察测量，观察分析模型产生的病理机制，为科研选择造模方式提供参考。
材料与方法
一 材料
由广东医学实验动物中心提供SPF级健康雄性SD大鼠24只，体重(250±20)g，日龄60~80 d，动物合格证号No.44007200007336；饲养于广州军区广州总医院实验动物中心SPF级实验动物中心。16通道生理信号记录分析系统(MP100，美国BIOPAC公司)；电子分析天平(AE-100，瑞士Mettler公司)；MCT(37024，美国Sigma公司)；正置荧光显微镜(BX51，日本OLYMPUS公司)；透射电子显微镜(H-7650，日本HITACHI公司)。
二 方法
1. 实验分组及模型建立：大鼠分笼饲养(5~6只/笼)，常规饲料喂养，室温22~24℃，相对湿度60%左右，早8点至晚8点自动照明。动物购置后适应性饲养1周。所有实验动物称重，随机分为实验组和对照组。实验组予MCT溶液(无水乙醇与生理盐水按1∶4混合溶解)60 mg/kg腹腔注射[4]，对照组给予无水乙醇与生理盐水1∶4混合溶液等体积腹腔注射，正常饲养21 d。
2. 检测指标：21 d后大鼠称重，水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，胸前小切口开胸测量平均肺动脉压(mean pulmonary artery pressure，mPAP)；放血处死大鼠，灭菌生理盐水冲洗大鼠肺组织，切取右肺第2叶，放入4%多聚甲醛溶液中保存24 h，制作石蜡切块用于HE染色和Masson染色，观察肺组织中小动脉病理变化。切取左肺门组织6块，每块大小1 mm×1 mm×1 mm，放入3%戊二醛溶液保存，电子显微镜观察肺中小动脉超微结构变化。切取大鼠完整心脏，完整分离右心室(right ventricle，RV)、左心室和室间隔(left ventricle and interventricular septum，LV+S)，电子分析天平分别称重，计算右心室肥厚指数RV/(LV+S)。光镜(×200)下观察HE染色、Masson染色切片，应用Image-pro图像分析系统，选择直径100~200μm的肺中小动脉，测量其外径(external diameter，ED)、内径(internal diameter，ID)、中膜厚度(media thickness of pulmonary arterioles，PAMT，PAWT=2×medial wall thickness/external diameter)，计算其中膜面积(wall area，WA)、血管总面积(total area，TA)、血管腔面积(lumen area，LA)、膜厚度与动脉外径比值[WT%，WT%=2×PAMT/ED×100%]、中膜面积与血管总面积比值[WA%，WA%=(TA－LA)/TA×100%]作为肺血管重建的指标。每只大鼠各测量10根血管，并求其均值。计数肺中小动脉中膜平滑肌细胞核密度(smooth muscle cell nuclei density，SMC，以100μm×100μm大小范围内细胞核数目表示)。测量心肌细胞直径(cardiomyocyte diameter，CD)，计数心肌细胞核密度(myocardial nuclear density，MND，每100μm×100μm大小范围内细胞核数)，作为右心室重塑的指标。
三 统计学处理
全部数据经SPSS 19.0统计软件进行分析，实验数据以
结果
一 大鼠一般状态和大体病理
对照组大鼠从实验开始至3周后终止未出现明显异常改变，体重正常增长，全程无死亡。实验组大鼠MCT腹腔注射1周内未出现明显特征性改变。第2周开始逐渐出现活动减少，蜷卧闭眼，反应迟钝，呼吸急促，进食进水明显下降，毛发变黄，干枯杂乱，鼻部、唇周、趾端等处出现发绀，鼻周分泌物明显增多，皮下脂肪明显减少，体重下降。其中2只大鼠出现腹部膨隆，触之有明显波动感，并分别于第18 d和第20 d死亡，考虑为重度PAH导致右心衰竭所致。2只死亡大鼠解剖开胸后见明显胸腔积液，心脏增大明显，右心室游离壁明显增厚，右心室腔扩大，腹腔大量积液，均约10 mL左右。后期解剖时见对照组大鼠肺组织表面光滑，粉红色，富有弹性，心脏解剖未见异常。实验组大鼠肺表面大量瘀斑瘀点，变硬，颜色紫暗，短轴横切心脏可见右心室游离壁明显增厚，右心室腔扩大。实验开始前两组体重无统计学差异，实验结束后实验组较对照组体重明显下降(P＜0.01)，结果见表 1。
表1
两组体重比较(n=12，g，二 心肺组织镜下改变
1. 心肌组织HE染色比较：与对照组比较，实验组大鼠心肌细胞排列明显紊乱，心肌细胞间隙变窄，心肌细胞肥大。结果见图 1。
图1
心肌病理组织像(HE×100) a. 对照组；b. 实验组 图 2 肺病理组织像示肺中小动脉(HE×200) a. 对照组；b. 实验组
2. 肺组织HE染色、MASSON染色比较：与对照组比较，实验组大鼠肺组织中小动脉血管壁明显增厚，管腔明显狭窄甚至堵塞，肺泡结构明显萎缩变形，间质中大量炎症细胞浸润；肺组织胶原纤维大量增生，血管周围处增生更加明显。结果见图 2和图 3。
图3
肺病理组织像示肺中小动脉(Masson×200) a. 对照组；b. 实验组 图 4 肺小动脉血管内皮细胞电子显微镜像(×30 000) a. 对照组；b. 实验组
3. 肺血管内皮细胞电镜观察：正常对照组大鼠肺动脉内皮细胞单层扁平排列，核缘光滑，染色质较少，细胞器数量正常。与对照组比较，实验组大鼠肺动脉内皮细胞数量增多，形态肿胀并向管腔内突出，细胞核形态不规则，胞浆内空泡增多，细胞器明显增多；弹力纤维增生且排列杂乱；间质内大量炎症细胞浸润。结果见图 4。
4. 测量指标比较：与对照组比较，实验组大鼠mPAP和RV/(LV+S)显著升高(P＜0.01)，心肺组织检测并计算的指标SMC、PAMT、WT%、WA%、AD、MND差异均有统计学意义(P＜0.05)。结果见表 2和表 3。
表2
两组mPAP、RV/(LV+S)、AD和MND比较(
表3
两组SMC、PAMT、WT%和WA%比较(讨论
PAH造模方式有多种，主要分为单因素病理损伤模型、多因素病理损伤模型、基因敲除模型、基因过表达模型四大类，其中单因素病理损伤模型因作用机制明确、模型生成稳定、操作简便且价格相对便宜而应用最广，尤其MCT模型和慢性缺氧模型[5]。任何单因素模型不能完全复制复杂的临床疾病[6]，因此应运而生出现多因素病理损伤模型。多因素病理损伤模型是两种或两种以上单因素病理损伤的叠加，如MCT+左肺切除等[7]，更加接近临床PAH患者的发病情况，但因需要处理和涉及的变量较多，发病机制较为复杂，不便于操作以及后期对模型治疗效果进行分析研究，故应用偏少。基因敲除模型，如敲除大鼠内皮素受体B基因等，同样可诱发PAH形成，模型稳定性高、可重复性好，但实际操作中技术要求高且操作难度大，实验费用昂贵，限制了其在科研中的应用。基因过表达模型，如血管生成素1等基因的过表达，其造模效果目前尚存在争议[5]。
MCT在大鼠肝脏内经P450单氧化酶转化后，可形成具有生物活性的脱氢产物MCT吡咯，后者在血流通过肺脏时，可沉积于肺小动脉壁及肺毛细血管，选择性地引起肺动脉血管内皮细胞不可逆性损伤，诱导肺动脉血管壁重建并引起PAH[8]。从本实验结果来看，MCT能够显著升高大鼠肺动脉压力，引起右心室肥大，其中肺部血管重塑较为明显，内皮细胞破坏甚至出现丛状增生，结构完整性遭到破坏，亚细胞结构可见细胞核形态不规则改变，细胞质基质增多，细胞器数量增加形态改变，如内质网扩张、高尔基体增生和空泡增多等；内皮细胞连续性遭到破坏后引起平滑肌细胞暴露，受到各种刺激因素作用而出现大量增生，引起血管管腔明显狭窄，增加肺血管阻力；纤维结构染色可见血管壁及其周围纤维组织大量增生，排列杂乱，间质内炎症细胞大量增生，引起血管过度收缩而加重PAH。心肌肥厚明显，心肌细胞大量增生，细胞直径增加，细胞间隙变窄，引起右心室重塑。因此，我们认为MCT可成功诱导形成稳定的PAH、右心室肥厚模型，其成因可能与大鼠肺血管内皮细胞丛状增生、平滑肌细胞增生、胶原纤维大量增生引起血管腔严重狭窄甚至闭塞，心肌细胞代偿性肥大、增生等变化有关。
对PAH的研究已经持续了百余年，但尚未能完全明确其发病机制。传统对PAH发病的分子生物学机制的研究包括低氧诱导因子1、5-羟色胺、弹性蛋白酶活性、超氧化物歧化酶、钙离子和钾离子通道等，主要集中在个别信号分子及相关信号通路的研究。近几年来随着基因技术的快速发展，人们正在努力在基因水平上重新定义PAH。对细胞信号传导、细胞转化、细胞与细胞间相互作用、miRNA的加工、线粒体和离子通道的功能改变等机制的深入研究，极大帮助我们认识了PAH发病机制中基因水平的改变，深入解释了血管细胞异常反应所带来的损伤作用[9]。亚裔人口中最常见的骨形态发生蛋白型受体Ⅱ基因(BMPR2)突变已被确认可导致遗传性肺动脉高压(HPAH)[10]。而有可能引起PAH的基因突变还有SMAD、TBX4和TSP1等[11-13]。全基因组关联研究(GWAS)提出了CBLN2轨迹与PAH的发生相关联[14]。转化生长因子β1和BMPR2信号之间的不平衡可能会刺激炎症细胞因子的表达和白细胞外渗，引起肺血管重塑[15]。因此，深入研究PAH基因水平的发病机制，并同传统信号分子研究相结合将是未来治疗和研究PAH的重要方向。
