引用本文： 苏孝琼, 潘珏, 金建军, 徐侃, 邓至, 陈智鸿. 白细胞介素27滴鼻预防给药通过STAT1信号通路减轻卵白蛋白诱导的哮喘小鼠气道过敏性炎症. 中国呼吸与危重监护杂志, 2015, 14(5): 442-448. doi: 10.7507/1671-6205.2015110 复制
近年来，我国的过敏性疾病如过敏性鼻炎、过敏性皮炎和过敏性哮喘的发病率逐渐升高。根据西方国家早年提出的“卫生学说”，T淋巴细胞的Th1和Th2反应失衡，并偏向Th2免疫反应是其主要的致病机制。初始的CD4+ T淋巴细胞能分化为多种Th细胞亚群，如Th1、Th2及Th17等。虽然激活的Th细胞在不同的环境下表现出一定的可塑性，比如感染，但是已经向某一亚型分化的的Th细胞具有下调其向其他亚型分化潜力的趋势。大量研究表明已经分化的Th1细胞会沉默自身白细胞介素4(IL-4)基因的转录[1]；T-box转录因子(T-bet)是Th1细胞分化的关键性转录因子[2-5]，Th2细胞上异常表达的T-bet不仅可以诱导γ干扰素(IFN-γ)的转录，还可以抑制IL-4基因的转录，而缺乏T-bet的小鼠则因为无法沉默IL-4基因的转录表现出自发性的过敏性气道炎症[6]；IFN-γ受体(-/-)、信号转导与转录激活子4(STAT4)(-/-)及干扰素调节因子1(IRF-1)(-/-)等基因敲除小鼠即使感染了诱导Th1型炎症反应的病原体，最终仍容易发展为Th2型炎症[2, 7]。这些研究结果均表明了促进Th1细胞分化的相关因子可以抑制Th2细胞的分化。
IL-27是2006年新近发现的细胞因子，它主要由活化的树突状细胞(DC)分泌，为白细胞介素12(IL-12)家族的成员之一。大量的体外实验表明IL-27可以通过信号转导与转录激活子1(STAT1)通路促进Th1细胞的分化，从而抑制Th2细胞的分化[8-9]；外源性转入IL-27基因可抑制利氏曼原虫感染诱导的Th2反应[9-10]。但近期报道显示IL-27不能抑制已分化的Th17细胞的再分化过程[11]。且IL-27虽可抑制健康人外周血提取的CD4+ T淋巴细胞的Th2分化，但对哮喘患者CD4+ T淋巴细胞分化的抑制效应几乎消失[12]。为明确IL-27是否能抑制过敏性哮喘气道炎症，我们构建了致敏前小剂量多次给予IL-27预防的小鼠模型及激发最后3 d给予大剂量IL-27治疗的小鼠模型，从活体和细胞水平研究IL-27减轻气道过敏性炎症的机制。
材料与方法
一 材料
1.实验动物：清洁级C57小鼠，雌性，体重20~25 g，6~8周龄，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。实验前1周饲养于复旦大学附属中山医院动物房，清洁级恒温(25℃)环境，标准饲料，自由取水，12 h昼夜。
2.主要试剂：卵白蛋白(OVA)干粉(GradeV，美国Sigma公司), 氢氧化铝(美国Thermo Pierce公司)，鼠IL-27、IL-4、IL-2(美国R&D公司)，抗IFN-γ抗体、抗IL-10抗体、抗IL-4抗体(美国BD公司)，磷酸化STAT1(p-STAT1)抗体、STAT1抗体、HSP70抗体(美国Cell Signaling公司)，抗鼠CD3抗体、抗鼠CD28抗体(美国eBioscience公司)。小鼠IL-4 ELISA试剂盒(上海园创生物技术有限公司)，HE染色套装(南京建成生物制品研究所)。
二 方法
1.实验分组及干预方案
(1)IL-27滴鼻预防对小鼠气道炎症的影响：①哮喘组(OVA组)：于实验开始第0和7 d给予腹腔注射100μL致敏液(OVA 100μg，氢氧化铝2 mg)。第14~18 d为激发阶段，麻醉状态下鼻腔滴入1％OVA溶液50μL，每日1次，连续5 d。末次激发后24 h处死小鼠。②IL-27 50 ng滴鼻预防组(OVA+IL-27 50 ng组)：在实验开始前至实验开始第7 d，小鼠在麻醉状态下(异氟烷吸入性麻醉)鼻腔滴入25 ng IL-27溶液，每日2次，共50 ng，连续14 d，其余方法同哮喘组。③IL-27 100 ng滴鼻预防组(OVA+IL-27 100 ng组)：在实验开始前至实验开始第7d，小鼠在麻醉状态下鼻腔滴入50 ng IL-27溶液，每日2次，共100 ng，连续14 d，其余方法同哮喘组。④对照组(PBS组)：致敏液和激发液均为PBS, 操作时间点同哮喘组，并于末次给药后24 h处死小鼠。鼠肺用4％多聚甲醛固定并石蜡包埋。对照组6只小鼠，其余每组8只小鼠，共30只小鼠。
(2)IL-27滴鼻治疗对小鼠气道炎症的影响：①哮喘组(OVA组)：同上。②IL-27 0.5μg滴鼻治疗组(OVA+IL-27 0.5μg组)：哮喘模型的制备同哮喘组，在第16、17及18 d，小鼠在麻醉状态下鼻腔滴入0.5μg IL-27溶液，每日1次，连续3 d。③IL-27 1μg滴鼻治疗组(OVA+IL-27 1μg组)：哮喘模型的制备同哮喘组，在第16、17及18 d，小鼠在麻醉状态下鼻腔滴入1μg IL-27溶液，每日1次，连续3 d。④对照组(PBS组):同上。并于末次给药后24 h处死小鼠。鼠肺用4％多聚甲醛固定并石蜡包埋。对照组6只小鼠，其余每组8只小鼠，共30只小鼠。
2.肺组织形态观察及炎症病理评分：肺组织切片分别行HE染色，200×光镜下观察肺组织病理学改变。根据Curtis等[13]提出的小鼠肺组织炎症病理评分，对总炎症、血管周围炎症和支气管周围炎症进行评分。
3.脾脏CD4+ T淋巴细胞的分化和培养：用CD4+ T淋巴细胞分离纯化试剂盒从小鼠脾脏单个核细胞中分离得到CD4+ T淋巴细胞，24孔板提前用1μg/mL抗CD3抗体，1μg/mL抗CD28抗体包被过夜。基础培养基包括1640 RPMI，10%胎牛血清，抗IFN-γ抗体。共分5个组：基础培养组(Th2组)，中性培养组(Neu组)，Th2+IL-27组，Th2+IL-27+抗IFN-γ组，Th2+IL-27+抗IL-10组。根据分组情况加入相应的细胞因子或抗体，如Th2+IL-27+抗IFN-γ组：除基础培养基外，另加入15 ng/mL IL-4，10 ng/mL IL-27，10μg/mL抗IFN-γ抗体。中性培养组(Neu组)：除基础培养基外，另加入10μg/mL抗IL-4抗体。不同Th2诱导环境对IL-27抑制作用实验中的Th2(低)、Th2(中)、Th2(高)培养环境中，除基础培养基外，IL-4的浓度分别为1、5和20 ng/mL。
4.ELISA检测IL-4浓度：用含有抗IL-4抗体的包被缓冲液，4℃过夜包被酶标板。每孔加入200μL检测稀释液以中和非特异性抗体，冲洗后每孔分别加入IL-4标准液或样本各100μL，孵育2 h，清洗后每孔加入100μL含有检测抗体的检测液，孵育1 h。最后分别加入底物液和终止液。用450 nm的酶标板读取吸光度值。
5.蛋白免疫印迹法(Western blot)检测p-STAT1和总STAT1水平：采用了4种培养环境，分别为中性培养组(Neu组)、Th2(低)、Th2(中)及Th2(高)。第5 d收集细胞。分为2组，一组用IL-27刺激15 min，收集总蛋白；另一组用PBS作用15 min，收集总蛋白。使用NE-PERTM试剂盒提取CD4+ T淋巴细胞总蛋白。10％SDS PAGE分离总蛋白并电转移至硝酸纤维素膜上，1∶1 000稀释的抗p-STAT1、STAT1抗体分别进行蛋白印迹分析，ECL化学发光试剂盒显像，凝胶图像分析系统分析各蛋白条带灰度值，并以HSP70为内参标化各样品。
三 统计学处理
采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。各组数据以
结果
一 IL-27滴鼻预防对哮喘小鼠气道炎症的影响
结果显示预防性小剂量多次气道局部给予IL-27给药可明显抑制支气管周围炎症细胞的浸润，抑制气道上皮细胞的增殖肥厚、杯状细胞增生和基质层的增生。同时也可轻度抑制血管周围炎症细胞的浸润。对血管周围和支气管周围的炎症病理评分发现，OVA+IL-27 50 ng组、OVA+IL-27 100 ng组与OVA组比较，炎症病理评分显著降低(P＜0.05)，而且小剂量的IL-27即显示明显的效果。结果见图 1和图 2。
图1
27滴鼻预防组小鼠肺组织病理检查像(HE×200) a:PBS组；b:OVA组；c:OVA+IL-27 50 ng滴鼻预防组；d:OVA+IL-27 100 ng滴鼻预防组
图2
IL-27滴鼻预防组小鼠气道炎症病理评分 a.总炎症病理评分；b.支气管旁炎症病理评分；c.血管旁炎症病理评分
与OVA组比较，*
二 IL-27滴鼻治疗对哮喘小鼠气道炎症的影响
结果显示在激发期即使使用了大剂量的IL-27给药，IL-27滴鼻治疗对支气管周围和血管周围炎症细胞的浸润仍无明显抑制作用。对血管周围和支气管周围的炎症病理评分发现OVA+IL-27 0.5μg组、OVA+IL-27 1μg组与OVA组比较，炎症病理评分无显著降低(P＞0.05)。结果见图 3和图 4。
图3
IL-27滴鼻治疗组小鼠肺组织病理检查像(HE×200) a：PBS组；b：OVA组；c：OVA+IL-27 0.5μg滴鼻治疗组；d：OVA+IL-27 1μg滴鼻治疗组
图4
IL-27滴鼻治疗组小鼠气道炎症病理评分 a.总炎症病理评分；b.支气管旁炎症病理评分；c.血管旁炎症病理评分
三 IL-27对初始CD4+ T淋巴细胞的Th2分化的抑制作用
小鼠脾脏单个核细胞中分离纯化CD4+ T淋巴细胞，采用5组进行分化实验。其中，可见Th2组即在培养过程中加入IL-4，在第6 d通过佛波酯(PMA)和离子霉素刺激后可分泌大量的IL-4，说明培养和分化效果较好。但若在培养时加入IL-4和IL-27，即Th2+IL-27组，第6 d用PMA和离子霉素刺激后，IL-4的分泌却受到明显抑制(与Th2组比较，P＜0.05)。另外，如果培养时同时加入IL-4、IL-27、抗IFN-γ抗体，即Th2+IL-27+抗IFN-γ组，可见IL-27仍能明显抑制IL-4的分泌，说明IL-27对CD4+ T淋巴细胞分化的抑制不依赖于IFN-γ。同样的方法也检测了IL-10, 发现IL-27对CD4+ T淋巴细胞分化的抑制也不依赖于IL-10。结果见图 5。
图5
IL-27可抑制初始CD4+ T淋巴细胞的Th2分化且不依赖IFN-γ和IL10
与Th2组比较，*
四 IL-27对CD4+ T淋巴细胞的分化抑制受分化环境的影响
当IL-27用于初始CD4+ T淋巴细胞分化实验时，给予不同的培养环境，并根据培养基中添加IL-4的浓度，分为Th2(低)、Th2(中)和Th2(高)，其中IL-4的浓度依次为1 ng/mL、5 ng/mL和20 ng/mL。研究中发现随着诱导向Th2分化的IL-4浓度的升高，IL-27的抑制作用逐渐减弱。采用初始CD4+ T淋巴细胞和已分化为Th2的CD4+ T淋巴细胞的对比实验，发现IL-27可以抑制初始CD4+ T淋巴细胞的从头分化，但不能逆转已分化的细胞再分化。结果见图 6。
图6
不同的Th2诱导环境对IL-27抑制作用的影响a.IL-27在不同强度IL-4诱导环境下对Th2分化抑制的影响；b.IL-27对初始CD4+ T淋巴细胞向Th2分化有明显的抑制作用；c.IL-27对已分化的Th2-CD4+ T淋巴细胞再分化的抑制效应消失
与Th2组比较，*
五 IL-27对CD4+ T淋巴细胞的分化作用受细胞内信号转导因子STAT1调控
Western blot检测结果显示，在Neu组和Th2(低)组，当细胞用IL-27刺激后，STAT1的磷酸化明显，而在Th2(中)组和Th2(高)组STAT1的磷酸化受阻。但各组总STAT1水平相当。结果见图 7。
图7
不同Th2诱导环境对CD4+ T淋巴细胞STAT1磷酸化的影响a.Western blot检测像；b.p-STAT1相对表达柱状图
讨论
IL-27能在细胞水平抑制Th2或Th17分化，但IL-27是否能在动物水平抑制OVA诱导的气道过敏性炎症尚不得而知。根据已有的研究，IL-27对初始CD4+ T淋巴细胞的特定分化抑制效果较好，而对已分化的CD4+ T淋巴细胞的再分化的抑制存在障碍。而哮喘患者体内可能存在已分化的Th2细胞。
因此，我们设计了两种IL-27干预的动物模型，一种为“IL-27小剂量、多次预防干预”，另一种为“IL-27大剂量、寡次治疗干预”。研究结果显示虽然IL-27治疗可以轻度抑制支气管及血管周围的炎症细胞浸润，但与OVA组相比，差异无统计学意义。而IL-27小剂量、多次预防给药组，可以明显抑制支气管及血管周围的炎症细胞浸润，与OVA组相比，差异有统计学意义。
通过提取小鼠脾脏CD4+ T淋巴细胞，进行体外分化及IL-27处理发现，IL-27能明显抑制初始CD4+ T淋巴细胞向Th2方向分化，且这种作用不依赖于IFN-γ和IL-10。因此推测IL-27在动物水平对OVA诱导的气道炎症的预防作用与IL-27抑制T淋巴细胞的Th2分化能力有关。但如果用高剂量的IL-4诱导Th2分化，或诱导已朝Th2分化的细胞再分化，添加IL-27后，其抑制效应明显减弱。可能的原因是已分化的Th2细胞对IL-27产生耐受。这可以部分解释我们第二种动物模型的结果，即在激发的晚期使用IL-27治疗，对支气管和血管周围的炎症有轻度抑制，但无统计学意义。
Leung等[14]报道了哮喘患者外周血中IFN-γ受体存在缺陷，过高剂量的IL-2或IL-4诱导Th细胞向Th2分化的同时会产生对糖皮质激素的抵抗，且对IL-10和转化生长因子β(TGF-β)耐受，并发现是MAPK通路介导的。细胞因子是通过酪氨酸激酶-信号转导子和转录激活子(Jak-STAT)信号通路传递信号的，STATs家族有1~6个亚型，其中STAT1/T-bet介导了Th1细胞分化[15]。为探究IL-27处理T淋巴细胞后的信号传递，我们采用了IFN-γ(-/-)、T-bet(-/-)、STAT1(-/-)基因敲除鼠，发现仅STAT1敲除可抵消IL-27的效应，而IFN-γ和T-bet敲除对IL-27的效应无影响。说明IL-27是借助STAT1信号通路活化而传递信号。
小鼠抵抗细菌和病毒感染时会启动STAT1[16]，人类如果缺乏STAT1，在幼年很可能死于细菌或病毒感染[17]。STAT1基因突变者(尤其是重症哮喘患者)，则对非典型病原体和病毒易感性增加[18]。已有的研究结果显示IL-27对细菌和病毒感染的抵抗，很可能是通过STAT1信号通路启动从而抑制细胞的Th2分化。因此STAT1可能成为高IL-4诱导的对IL-27效应耐受的靶分子。有报道当人外周血CD4+ T淋巴细胞在诱导向Th2分化的过程中，其细胞内总STAT1转录水平降低。但在我们的研究中当初始CD4+ T淋巴细胞培养于Neu、Th2(低)、Th2(中)及Th2(高)各种环境时，各组的总STAT1的表达水平恒定，但STAT1磷酸化水平不尽相同：Neu组和Th2(低)组STAT1磷酸化水平正常，但当用中、高剂量IL-4诱导时则出现了STAT1磷酸化水平的明显降低。磷酸化是STAT1入核前的活化步骤，未磷酸化的STAT1不发挥信号传递功能。推测哮喘动物体内的T淋巴细胞存在STAT1功能障碍。
哮喘的细胞因子治疗或其他替代治疗一直是哮喘机制及新药研究的热点[19-21]。IL-27是Th1细胞因子家族的成员之一，它犹如一把双刃剑，既具有促进Th1分化，同时又可抑制Th2及Th17分化的作用[22]。在对哮喘动物及细胞水平的研究发现，IL-27抑制初始CD4+ T淋巴细胞向Th2分化的作用非常卓越，但对已朝Th2分化的细胞，其抑制作用明显降低，动物模型也证实IL-27的预防性效果比治疗效果显著。哮喘的本质是气道过敏性炎症，患者多于青年发病，成年后也经常反复发作。因此，推测在气道局部或外周血中业已存在的分化的Th2淋巴细胞是IL-27作用降低的原因。如何克服该效应屏障，发挥出细胞因子在预防及治疗哮喘中的作用，还需要深入探索。
近年来，我国的过敏性疾病如过敏性鼻炎、过敏性皮炎和过敏性哮喘的发病率逐渐升高。根据西方国家早年提出的“卫生学说”，T淋巴细胞的Th1和Th2反应失衡，并偏向Th2免疫反应是其主要的致病机制。初始的CD4+ T淋巴细胞能分化为多种Th细胞亚群，如Th1、Th2及Th17等。虽然激活的Th细胞在不同的环境下表现出一定的可塑性，比如感染，但是已经向某一亚型分化的的Th细胞具有下调其向其他亚型分化潜力的趋势。大量研究表明已经分化的Th1细胞会沉默自身白细胞介素4(IL-4)基因的转录[1]；T-box转录因子(T-bet)是Th1细胞分化的关键性转录因子[2-5]，Th2细胞上异常表达的T-bet不仅可以诱导γ干扰素(IFN-γ)的转录，还可以抑制IL-4基因的转录，而缺乏T-bet的小鼠则因为无法沉默IL-4基因的转录表现出自发性的过敏性气道炎症[6]；IFN-γ受体(-/-)、信号转导与转录激活子4(STAT4)(-/-)及干扰素调节因子1(IRF-1)(-/-)等基因敲除小鼠即使感染了诱导Th1型炎症反应的病原体，最终仍容易发展为Th2型炎症[2, 7]。这些研究结果均表明了促进Th1细胞分化的相关因子可以抑制Th2细胞的分化。
IL-27是2006年新近发现的细胞因子，它主要由活化的树突状细胞(DC)分泌，为白细胞介素12(IL-12)家族的成员之一。大量的体外实验表明IL-27可以通过信号转导与转录激活子1(STAT1)通路促进Th1细胞的分化，从而抑制Th2细胞的分化[8-9]；外源性转入IL-27基因可抑制利氏曼原虫感染诱导的Th2反应[9-10]。但近期报道显示IL-27不能抑制已分化的Th17细胞的再分化过程[11]。且IL-27虽可抑制健康人外周血提取的CD4+ T淋巴细胞的Th2分化，但对哮喘患者CD4+ T淋巴细胞分化的抑制效应几乎消失[12]。为明确IL-27是否能抑制过敏性哮喘气道炎症，我们构建了致敏前小剂量多次给予IL-27预防的小鼠模型及激发最后3 d给予大剂量IL-27治疗的小鼠模型，从活体和细胞水平研究IL-27减轻气道过敏性炎症的机制。
材料与方法
一 材料
1.实验动物：清洁级C57小鼠，雌性，体重20~25 g，6~8周龄，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。实验前1周饲养于复旦大学附属中山医院动物房，清洁级恒温(25℃)环境，标准饲料，自由取水，12 h昼夜。
2.主要试剂：卵白蛋白(OVA)干粉(GradeV，美国Sigma公司), 氢氧化铝(美国Thermo Pierce公司)，鼠IL-27、IL-4、IL-2(美国R&D公司)，抗IFN-γ抗体、抗IL-10抗体、抗IL-4抗体(美国BD公司)，磷酸化STAT1(p-STAT1)抗体、STAT1抗体、HSP70抗体(美国Cell Signaling公司)，抗鼠CD3抗体、抗鼠CD28抗体(美国eBioscience公司)。小鼠IL-4 ELISA试剂盒(上海园创生物技术有限公司)，HE染色套装(南京建成生物制品研究所)。
二 方法
1.实验分组及干预方案
(1)IL-27滴鼻预防对小鼠气道炎症的影响：①哮喘组(OVA组)：于实验开始第0和7 d给予腹腔注射100μL致敏液(OVA 100μg，氢氧化铝2 mg)。第14~18 d为激发阶段，麻醉状态下鼻腔滴入1％OVA溶液50μL，每日1次，连续5 d。末次激发后24 h处死小鼠。②IL-27 50 ng滴鼻预防组(OVA+IL-27 50 ng组)：在实验开始前至实验开始第7 d，小鼠在麻醉状态下(异氟烷吸入性麻醉)鼻腔滴入25 ng IL-27溶液，每日2次，共50 ng，连续14 d，其余方法同哮喘组。③IL-27 100 ng滴鼻预防组(OVA+IL-27 100 ng组)：在实验开始前至实验开始第7d，小鼠在麻醉状态下鼻腔滴入50 ng IL-27溶液，每日2次，共100 ng，连续14 d，其余方法同哮喘组。④对照组(PBS组)：致敏液和激发液均为PBS, 操作时间点同哮喘组，并于末次给药后24 h处死小鼠。鼠肺用4％多聚甲醛固定并石蜡包埋。对照组6只小鼠，其余每组8只小鼠，共30只小鼠。
(2)IL-27滴鼻治疗对小鼠气道炎症的影响：①哮喘组(OVA组)：同上。②IL-27 0.5μg滴鼻治疗组(OVA+IL-27 0.5μg组)：哮喘模型的制备同哮喘组，在第16、17及18 d，小鼠在麻醉状态下鼻腔滴入0.5μg IL-27溶液，每日1次，连续3 d。③IL-27 1μg滴鼻治疗组(OVA+IL-27 1μg组)：哮喘模型的制备同哮喘组，在第16、17及18 d，小鼠在麻醉状态下鼻腔滴入1μg IL-27溶液，每日1次，连续3 d。④对照组(PBS组):同上。并于末次给药后24 h处死小鼠。鼠肺用4％多聚甲醛固定并石蜡包埋。对照组6只小鼠，其余每组8只小鼠，共30只小鼠。
2.肺组织形态观察及炎症病理评分：肺组织切片分别行HE染色，200×光镜下观察肺组织病理学改变。根据Curtis等[13]提出的小鼠肺组织炎症病理评分，对总炎症、血管周围炎症和支气管周围炎症进行评分。
3.脾脏CD4+ T淋巴细胞的分化和培养：用CD4+ T淋巴细胞分离纯化试剂盒从小鼠脾脏单个核细胞中分离得到CD4+ T淋巴细胞，24孔板提前用1μg/mL抗CD3抗体，1μg/mL抗CD28抗体包被过夜。基础培养基包括1640 RPMI，10%胎牛血清，抗IFN-γ抗体。共分5个组：基础培养组(Th2组)，中性培养组(Neu组)，Th2+IL-27组，Th2+IL-27+抗IFN-γ组，Th2+IL-27+抗IL-10组。根据分组情况加入相应的细胞因子或抗体，如Th2+IL-27+抗IFN-γ组：除基础培养基外，另加入15 ng/mL IL-4，10 ng/mL IL-27，10μg/mL抗IFN-γ抗体。中性培养组(Neu组)：除基础培养基外，另加入10μg/mL抗IL-4抗体。不同Th2诱导环境对IL-27抑制作用实验中的Th2(低)、Th2(中)、Th2(高)培养环境中，除基础培养基外，IL-4的浓度分别为1、5和20 ng/mL。
4.ELISA检测IL-4浓度：用含有抗IL-4抗体的包被缓冲液，4℃过夜包被酶标板。每孔加入200μL检测稀释液以中和非特异性抗体，冲洗后每孔分别加入IL-4标准液或样本各100μL，孵育2 h，清洗后每孔加入100μL含有检测抗体的检测液，孵育1 h。最后分别加入底物液和终止液。用450 nm的酶标板读取吸光度值。
5.蛋白免疫印迹法(Western blot)检测p-STAT1和总STAT1水平：采用了4种培养环境，分别为中性培养组(Neu组)、Th2(低)、Th2(中)及Th2(高)。第5 d收集细胞。分为2组，一组用IL-27刺激15 min，收集总蛋白；另一组用PBS作用15 min，收集总蛋白。使用NE-PERTM试剂盒提取CD4+ T淋巴细胞总蛋白。10％SDS PAGE分离总蛋白并电转移至硝酸纤维素膜上，1∶1 000稀释的抗p-STAT1、STAT1抗体分别进行蛋白印迹分析，ECL化学发光试剂盒显像，凝胶图像分析系统分析各蛋白条带灰度值，并以HSP70为内参标化各样品。
三 统计学处理
采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。各组数据以
结果
一 IL-27滴鼻预防对哮喘小鼠气道炎症的影响
结果显示预防性小剂量多次气道局部给予IL-27给药可明显抑制支气管周围炎症细胞的浸润，抑制气道上皮细胞的增殖肥厚、杯状细胞增生和基质层的增生。同时也可轻度抑制血管周围炎症细胞的浸润。对血管周围和支气管周围的炎症病理评分发现，OVA+IL-27 50 ng组、OVA+IL-27 100 ng组与OVA组比较，炎症病理评分显著降低(P＜0.05)，而且小剂量的IL-27即显示明显的效果。结果见图 1和图 2。
图1
27滴鼻预防组小鼠肺组织病理检查像(HE×200) a:PBS组；b:OVA组；c:OVA+IL-27 50 ng滴鼻预防组；d:OVA+IL-27 100 ng滴鼻预防组
图2
IL-27滴鼻预防组小鼠气道炎症病理评分 a.总炎症病理评分；b.支气管旁炎症病理评分；c.血管旁炎症病理评分
与OVA组比较，*
二 IL-27滴鼻治疗对哮喘小鼠气道炎症的影响
结果显示在激发期即使使用了大剂量的IL-27给药，IL-27滴鼻治疗对支气管周围和血管周围炎症细胞的浸润仍无明显抑制作用。对血管周围和支气管周围的炎症病理评分发现OVA+IL-27 0.5μg组、OVA+IL-27 1μg组与OVA组比较，炎症病理评分无显著降低(P＞0.05)。结果见图 3和图 4。
图3
IL-27滴鼻治疗组小鼠肺组织病理检查像(HE×200) a：PBS组；b：OVA组；c：OVA+IL-27 0.5μg滴鼻治疗组；d：OVA+IL-27 1μg滴鼻治疗组
图4
IL-27滴鼻治疗组小鼠气道炎症病理评分 a.总炎症病理评分；b.支气管旁炎症病理评分；c.血管旁炎症病理评分
三 IL-27对初始CD4+ T淋巴细胞的Th2分化的抑制作用
小鼠脾脏单个核细胞中分离纯化CD4+ T淋巴细胞，采用5组进行分化实验。其中，可见Th2组即在培养过程中加入IL-4，在第6 d通过佛波酯(PMA)和离子霉素刺激后可分泌大量的IL-4，说明培养和分化效果较好。但若在培养时加入IL-4和IL-27，即Th2+IL-27组，第6 d用PMA和离子霉素刺激后，IL-4的分泌却受到明显抑制(与Th2组比较，P＜0.05)。另外，如果培养时同时加入IL-4、IL-27、抗IFN-γ抗体，即Th2+IL-27+抗IFN-γ组，可见IL-27仍能明显抑制IL-4的分泌，说明IL-27对CD4+ T淋巴细胞分化的抑制不依赖于IFN-γ。同样的方法也检测了IL-10, 发现IL-27对CD4+ T淋巴细胞分化的抑制也不依赖于IL-10。结果见图 5。
图5
IL-27可抑制初始CD4+ T淋巴细胞的Th2分化且不依赖IFN-γ和IL10
与Th2组比较，*
四 IL-27对CD4+ T淋巴细胞的分化抑制受分化环境的影响
当IL-27用于初始CD4+ T淋巴细胞分化实验时，给予不同的培养环境，并根据培养基中添加IL-4的浓度，分为Th2(低)、Th2(中)和Th2(高)，其中IL-4的浓度依次为1 ng/mL、5 ng/mL和20 ng/mL。研究中发现随着诱导向Th2分化的IL-4浓度的升高，IL-27的抑制作用逐渐减弱。采用初始CD4+ T淋巴细胞和已分化为Th2的CD4+ T淋巴细胞的对比实验，发现IL-27可以抑制初始CD4+ T淋巴细胞的从头分化，但不能逆转已分化的细胞再分化。结果见图 6。
图6
不同的Th2诱导环境对IL-27抑制作用的影响a.IL-27在不同强度IL-4诱导环境下对Th2分化抑制的影响；b.IL-27对初始CD4+ T淋巴细胞向Th2分化有明显的抑制作用；c.IL-27对已分化的Th2-CD4+ T淋巴细胞再分化的抑制效应消失
与Th2组比较，*
五 IL-27对CD4+ T淋巴细胞的分化作用受细胞内信号转导因子STAT1调控
Western blot检测结果显示，在Neu组和Th2(低)组，当细胞用IL-27刺激后，STAT1的磷酸化明显，而在Th2(中)组和Th2(高)组STAT1的磷酸化受阻。但各组总STAT1水平相当。结果见图 7。
图7
不同Th2诱导环境对CD4+ T淋巴细胞STAT1磷酸化的影响a.Western blot检测像；b.p-STAT1相对表达柱状图
讨论
IL-27能在细胞水平抑制Th2或Th17分化，但IL-27是否能在动物水平抑制OVA诱导的气道过敏性炎症尚不得而知。根据已有的研究，IL-27对初始CD4+ T淋巴细胞的特定分化抑制效果较好，而对已分化的CD4+ T淋巴细胞的再分化的抑制存在障碍。而哮喘患者体内可能存在已分化的Th2细胞。
因此，我们设计了两种IL-27干预的动物模型，一种为“IL-27小剂量、多次预防干预”，另一种为“IL-27大剂量、寡次治疗干预”。研究结果显示虽然IL-27治疗可以轻度抑制支气管及血管周围的炎症细胞浸润，但与OVA组相比，差异无统计学意义。而IL-27小剂量、多次预防给药组，可以明显抑制支气管及血管周围的炎症细胞浸润，与OVA组相比，差异有统计学意义。
通过提取小鼠脾脏CD4+ T淋巴细胞，进行体外分化及IL-27处理发现，IL-27能明显抑制初始CD4+ T淋巴细胞向Th2方向分化，且这种作用不依赖于IFN-γ和IL-10。因此推测IL-27在动物水平对OVA诱导的气道炎症的预防作用与IL-27抑制T淋巴细胞的Th2分化能力有关。但如果用高剂量的IL-4诱导Th2分化，或诱导已朝Th2分化的细胞再分化，添加IL-27后，其抑制效应明显减弱。可能的原因是已分化的Th2细胞对IL-27产生耐受。这可以部分解释我们第二种动物模型的结果，即在激发的晚期使用IL-27治疗，对支气管和血管周围的炎症有轻度抑制，但无统计学意义。
Leung等[14]报道了哮喘患者外周血中IFN-γ受体存在缺陷，过高剂量的IL-2或IL-4诱导Th细胞向Th2分化的同时会产生对糖皮质激素的抵抗，且对IL-10和转化生长因子β(TGF-β)耐受，并发现是MAPK通路介导的。细胞因子是通过酪氨酸激酶-信号转导子和转录激活子(Jak-STAT)信号通路传递信号的，STATs家族有1~6个亚型，其中STAT1/T-bet介导了Th1细胞分化[15]。为探究IL-27处理T淋巴细胞后的信号传递，我们采用了IFN-γ(-/-)、T-bet(-/-)、STAT1(-/-)基因敲除鼠，发现仅STAT1敲除可抵消IL-27的效应，而IFN-γ和T-bet敲除对IL-27的效应无影响。说明IL-27是借助STAT1信号通路活化而传递信号。
小鼠抵抗细菌和病毒感染时会启动STAT1[16]，人类如果缺乏STAT1，在幼年很可能死于细菌或病毒感染[17]。STAT1基因突变者(尤其是重症哮喘患者)，则对非典型病原体和病毒易感性增加[18]。已有的研究结果显示IL-27对细菌和病毒感染的抵抗，很可能是通过STAT1信号通路启动从而抑制细胞的Th2分化。因此STAT1可能成为高IL-4诱导的对IL-27效应耐受的靶分子。有报道当人外周血CD4+ T淋巴细胞在诱导向Th2分化的过程中，其细胞内总STAT1转录水平降低。但在我们的研究中当初始CD4+ T淋巴细胞培养于Neu、Th2(低)、Th2(中)及Th2(高)各种环境时，各组的总STAT1的表达水平恒定，但STAT1磷酸化水平不尽相同：Neu组和Th2(低)组STAT1磷酸化水平正常，但当用中、高剂量IL-4诱导时则出现了STAT1磷酸化水平的明显降低。磷酸化是STAT1入核前的活化步骤，未磷酸化的STAT1不发挥信号传递功能。推测哮喘动物体内的T淋巴细胞存在STAT1功能障碍。
哮喘的细胞因子治疗或其他替代治疗一直是哮喘机制及新药研究的热点[19-21]。IL-27是Th1细胞因子家族的成员之一，它犹如一把双刃剑，既具有促进Th1分化，同时又可抑制Th2及Th17分化的作用[22]。在对哮喘动物及细胞水平的研究发现，IL-27抑制初始CD4+ T淋巴细胞向Th2分化的作用非常卓越，但对已朝Th2分化的细胞，其抑制作用明显降低，动物模型也证实IL-27的预防性效果比治疗效果显著。哮喘的本质是气道过敏性炎症，患者多于青年发病，成年后也经常反复发作。因此，推测在气道局部或外周血中业已存在的分化的Th2淋巴细胞是IL-27作用降低的原因。如何克服该效应屏障，发挥出细胞因子在预防及治疗哮喘中的作用，还需要深入探索。
