引用本文： 王帝, 崔志磊, 郭雪君. 姜黄素mPEG-PLGA纳米粒对香烟提取物刺激巨噬细胞RAW264.7所致激素抵抗现象逆转作用的研究. 中国呼吸与危重监护杂志, 2016, 15(1): 68-74. doi: 10.7507/1671-6205.2016017 复制
慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)是以不完全可逆、呈进行性发展的慢性气流受限为特征的疾病，相对于其他的气道慢性疾病，慢阻肺的死亡率和致残率都较高，而对激素药物不敏感是导致慢阻肺治疗效果不佳的主要的原因[1]。姜黄素(curcumin，CUR)是从姜黄(curcuma longa)中分离出来的一种低分子质量多酚类化合物。研究发现，CUR能够提高组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase，HDAC2)的活性，合用可以提高激素的抗炎活性[2]。但是CUR难溶于水，碱性环境下易降解，生物体内易发生转化，利用率极低，限制了其在科研和临床中的应用[3]。近年来，基于聚合物材料的纳米技术正逐渐成为药剂学研究的热点，此技术能改善难溶性药物的溶解度和溶出速度，将CUR制成纳米制剂可在一定程度上提高其水溶性，增强其稳定性，同时在CUR释放前，细胞即可以内吞的方式摄入纳米颗粒，从而提高了CUR的蓄积量。本实验利用mPEG2000-PLGA作为载体，采用溶剂挥发法制备载CUR-mPEG2000-PLGA纳米粒(CUR-NPs)，香烟提取物(cigarette smoke extract，CSE)暴露诱导激素抵抗细胞模型，探讨CUR和CUR-NPs对激素抵抗的逆转作用，比较CUR和CUR-NPs的生物学作用差异。
材料与方法
一 材料
1．细胞和试剂：巨噬细胞RAW264.7(上海合生园生物科技发展有限公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，大前门香烟(尼古丁含量0.9 mg，焦油含量12 mg，烟气碱含量14 mg，上海烟草公司)，姜黄素(Sigma公司)，聚乙二醇-聚乳酸乙酸酯[mPEG-PLGA，mPEG相对分子质量2 000，mPEG 4%，LA/GA(55 :45)，济南岱罡生物科技有限公司]，布地奈德(budesonide，BUD)(阿斯利康公司)，抗大鼠HDAC2抗体(美国Abcam公司)，逆转录试剂盒[TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司]，实时荧光定量PCR(Real-time PCR)试剂盒[TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司]，大鼠白细胞介素8(IL-8)酶联免疫吸附法试剂盒(美国R & D公司)。
2．仪器：紫外可见光分光光度计(上海迪诺力泰仪器设备有限公司)，恒温磁力搅拌器(德国IKA集团)，冷冻超速离心机(Thermo Electron公司)，H-7650透射电子显微镜(日本Hitachi公司)，Zetasizer Nano ZS90激光粒度测定仪(英国Marlven公司)，共聚焦显微镜(德国Leica)。
二 方法
1．CUR-NPs的制备：采用乳化溶剂挥发法制备CUR-mPEG-PLGA纳米粒[4]。室温下将30 mg的mPEG2000-PLGA和1 mg的CUR溶于3 mL丙酮-乙醇混合溶液(丙酮与乙醇体积比为1 :1)中形成有机相。在磁力搅拌(300 r/min)下将此溶液缓慢滴入3%的PVA溶液，形成CUR及mPEG2000-PLGA纳米粒子悬液，有机相滴加完成后继续磁力搅拌5 min停止。将所得纳米粒溶液置入真空旋转蒸发仪，于40℃水浴中，以100 r/min减压蒸发40 min，除去残留的丙酮和乙醇。而后将纳米粒溶液放入低温离心机内以2 000 r/min离心20 min去除团聚的大粒子，再以12 000 r/min离心30 min沉淀纳米粒，弃去上清液，去除残留的PVA和mPEG2000-PLGA，双蒸水重新悬起纳米粒子，重复洗涤3次。将得到的纳米粒溶液冻干后保存。用紫外-可见分光光度法测吸光度(A)，绘制浓度与吸光度的线性曲线，高速离心法测定CUR-NPs的载药量和包封率。
2．CUR-NPs的表征：采用激光粒度测定仪测定CUR-NPs的粒径大小，透射电子显微镜观察CUR-NPs的形貌。
3．CSE的制备：参考文献[5]报道的方法进行制备。1支香烟燃烧的烟雾在负压吸引下在2 min内溶于10 mL的培养基中。经0.22μm滤膜过滤除菌后作为100% CSE原液使用，制备后30 min内使用完成。
4．细胞分组及药物干预：ELISA法检测巨噬细胞RAW264.7所分泌的IL-8。取对数生长期巨噬细胞RAW264.7，以2×104个/孔接种于6孔板，待细胞贴壁良好后，弃掉旧培养基，以含1%FBS的培养基饥饿培养细胞12 h，BUD(10-10~10-5 mol/L)干预15 min后，加入脂多糖(LPS)(0.1μg/mL)，细胞孵育24 h后，收集细胞上清。按上述方法培养巨噬细胞RAW264.7，各组药物CUR(10-10~10-5 mol/L)、BUD(10-10~10-5 mol/L)、CUR(10-7 mol/L)+ BUD(10-9~10-5 mol/L)、CUR(10-9~10-5 mol/L)+ BUD(10-7 mol/L)、CUR-NPs(10-9~10-5 mol/L)+BUD(10-7 mol/L)干预15 min后，CSE(10%)刺激4 h，然后加入LPS(0.1μg/mL)，细胞孵育24 h后，收集细胞上清。将上述细胞上清按照ELISA试剂盒厂家提供的操作指南进行IL-8的检测，将样品和不同浓度的标准品加入相应孔中，37℃孵育120 min，洗板。依次加入HRP工作液、标准色液、终止液，30 min内用自动酶标仪处读OD值。根据标准曲线计算待测样品的含量。计算BUD对IL-8分泌的抑制率及半数抑制浓度(IC50)。
5．Real-time PCR检测细胞中HDAC2 mRNA的表达：上述方法孵育巨噬细胞RAW264.7，BUD(10-7 mol/L)、CUR(10-7、10-6 mol/L)和CUR-NPs(10-7、10-6 mol/L)干预15 min后，CSE(10%)刺激，孵育24 h后，收集细胞。Trizol提取各组细胞的RNA，在分光光度计下测定RNA的浓度和OD260/280比值。各样本均按1μg RNA相应的体积(nμL)根据逆转录试剂盒说明进行逆转录，每样本转录体系为20μL体系，混合好的液体放置在PCR仪中，反应条件为37℃15 min，85℃5 s。将得到cDNA根据Real-time PCR说明书进行半定量PCR，反应条件为95℃30 s预变性，然后进行40个循环，95℃5 s，60℃34 s两步法进行PCR。以GAPDH为内参。引物序列：HDAC2上游引物5′-GGGCTGCTTCAACCTAACTG-3′，下游引物5′-TTCA CAATCAAGGGCAACTG-3′，扩增片段长度142 bp；GAPDH上游引物5′-GCAAGTTCAACGGCACAG-3′，下游引物5′-GCAAGTAGACTCCACGACAT-3′，扩增片段长度143 bp。Real-time PCR得到的相应的Ct值用2-ΔΔCt法进行分析。
6．Western blot测定细胞中HDAC2的蛋白表达：上述方法孵育巨噬细胞RAW264.7，BUD(10-7 mol/L)、CUR(10-7、10-6 mol/L)和CUR-NPs(10-7、10-6 mol/L)干预15 min后，CSE(10%)刺激，孵育24 h后，收集细胞。用RIPA裂解液提取各组分细胞，然后用BCA测定蛋白浓度试剂盒测定各组分细胞样品总蛋白浓度。将所提取总蛋白样品与上样缓冲液按比例混合，煮沸5 min，聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1~2 h，然后放入含有适量一抗(HDAC2 1 :2 000，β-actin 1 :1 000稀释)的一抗稀释液中，4℃振荡过夜。洗涤。然后放入含有适量二抗(1 :1 000稀释)的TBST液中，室温振荡120 min，洗涤，最终显色成像。结果经Image LabTM软件进行灰度值分析。
7．细胞对CUR和CUR-NPs摄取量的检测：采用共聚焦显微成像系统检测巨噬细胞RAW264.7对CUR和CUR-NPs内CUR的摄取量。实验的激发波长为488 nm，发射波长为520 nm。细胞以1.0×104个/皿接种于共焦皿中，放置于培养箱孵育24 h后，换以CUR(10-7 mol/L)溶液及CUR-NP(10-7 mol/L)溶液继续孵育。然后取各时间点进行共焦显微成像﹙物镜采用100×oil)。
三 统计学处理
采用SPSS 17.0进行统计分析，数据用
结果
一 包封率、载药量的测定及CUR-NPs的表征
高速离心法测定结果显示CUR-NPs载药量为(78.33±2.52)%，包封率为(10.86±2.90)%。粒度测定仪测得结果显示CUR-NPs平均粒径(356.4±146.6) nm，粒度分布均匀，呈单峰分布，结果见图 1。CUR-NPs的形态为类球形，表面较光滑，大小较均匀，结果见图 2。
图1
CUR-NPs的粒径分布
图2
CUR-NPs的形态
二 不同浓度梯度的BUD对IL-8分泌的抑制作用及IC50计算
与LPS刺激相比，LPS+CSE共刺激时BUD(10-10~10-5 mol/L)对IL-8分泌的最大抑制率显著降低(P < 0.05)，IC50显著增高(P < 0.05)。LPS+CSE共刺激时，与BUD(10-10~10-5 mol/L)组相比，CUR(10-7 mol/L)+BUD(10-9~10-5 mol/L)组BUD对IL-8分泌的最大抑制率显著增高(P < 0.05)，IC50显著降低(P < 0.05)。结果见图 3和表 1。
图3
药物对IL-8分泌的抑制作用
a．LPS刺激，BUD(10-10~10-5 mol/L)干预；b．LPS+CSE共刺激，BUD(10-10~10-5 mol/L)组及CUR(10-7 mol/L)+BUD(10-9~10-5 mol/L)组干预；c．LPS+CSE刺激，CUR(10-10~10-5 mol/L)干预
表1
药物对IL-8分泌的最大抑制率及IC50
三 CUR及CUR-NPs生物学作用比较
LPS+CSE共刺激时，CUR和CUR-NPs浓度梯度为10-9、10-8、10-7 mol/L时，CUR-NPs+BUD(10-7 mol/L)组对IL-8分泌的抑制率显著高于CUR+BUD(10-7 mol/L)组(P < 0.05)。结果见图 4和表 2。
图4
CUR及CUR-NPs的生物学作用比较
与CUR+BUD(10-7 mol/L)组比较，*
表2
两组药物不同浓度梯度下对IL-8分泌的抑制率
四 细胞中HDAC2 mRNA的表达水平检测
CSE刺激后细胞中HDAC2的mRNA表达量显著降低(0.42±0.30比2.10±0.53，P < 0.05)。CUR(10-7、10-6 mol/L)组及CUR-NPs(10-7、10-6 mol/L)组细胞中HDAC2的mRNA表达量较CSE组显著增高(1.08±0.30、1.7±0.38、1.74±0.24和1.96±0.34比0.42±0.30，P < 0.05)。浓度梯度同为10-7 mol/L时，CUR-NPs组细胞中HDAC2的mRNA表达量显著高于CUR组(1.74±0.24比1.08±0.30，P < 0.05)。结果见图 5。
图5
细胞中HDAC2 mRNA的表达水平
与对照组比较，△
五 细胞中HDAC2的蛋白表达水平检测
CSE刺激后细胞中HDAC2的蛋白表达量显著降低(31.33±11.59比95.67±3.51，P < 0.05)。CUR(10-7、10-6 mol/L)组及CUR-NPs(10-7、10-6 mol/L)组细胞中HDAC2的蛋白表达量较CSE组显著增高(51.67±3.21、75.67±7.02、77.33±8.62和86.67±4.04比31.33±11.59，P < 0.05)。浓度梯度同为10-7 mol/L时，CUR-NPs组细胞中HDAC2的蛋白表达量高于CUR组(77.33±8.62比51.67±3.21，P < 0.05)。结果见图 6。
图6
细胞中HDAC2的蛋白表达水平
与无刺激对照组比较，△
六 细胞对CUR及CUR-NPs内CUR摄取量检测
共聚焦显微镜观察细胞对CUR和CUR-NPs中CUR的摄取量(图 7)，经CUR孵育的细胞的荧光强度值轻微上升，2 h左右达最大值。经CUR-NPs孵育的细胞荧光强度大幅度上升，大概在4 h左右细胞荧光强度达最大。CUR-NPs组荧光强度最高值明显大于CUR组荧光强度最高值[(318.63±22.19)AU比(133.70±5.69)AU，P < 0.05]，24 h后CUR-NPs组荧光强度明显大于CUR组荧光强度[(63.76±15.50)AU比(29.67±6.03)AU，P < 0.05]。定量计算结果显示，CUR-NPs组荧光强度-时间曲线面积显著大于CUR组[(4 714.56±351.68)AU比(2 078.33±55.30)AU，P < 0.05]。
图7
细胞对CUR及CUR-NPs内CUR摄取量的检测
讨论
糖皮质激素抵抗是近年来慢阻肺治疗领域的研究热点。目前研究表明，与糖皮质激素抵抗有关的机制包括HDAC2活性下降、糖皮质激素受体异常、核因子κB(NF-κB)激活通路缺乏等，其中HDAC2活性降低是导致糖皮质激素抵抗的重要原因[6-7]。本实验结果显示，与LPS刺激相比，LPS+CSE共刺激时，BUD对IL-8的抑制作用明显减弱；在巨噬细胞RAW264.7中，与对照组比较，CSE组HDAC2 mRNA相对量和蛋白表达都明显降低。这说明CSE诱导细胞中HDAC2活性和表达的下调，CSE暴露可以造成细胞对BUD抗炎作用产生抵抗。
在细胞水平上，CUR可以上调HDAC2活性，增加激素敏感性，逆转激素抵抗，这使其在慢阻肺抗炎治疗的研究领域引起了足够的关注[8-9]。本课题组前期的研究结果表明，在动物水平上，CUR和BUD合用可明显升高慢阻肺大鼠肺组织中HDAC2的表达，降低IL-8、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达量，说明CUR可能通过增加HDAC2的表达和活性提高糖皮质激素对慢阻肺大鼠的抗炎作用[10]。本实验结果显示，LPS与CSE共刺激巨噬细胞RAW264.7时，CUR与BUD合用时BUD对IL-8的最大抑制率升高，同时IC50降低，说明CUR可以逆转CSE诱导的激素抵抗；同时，CUR可以上调HDAC2 mRNA和蛋白的表达。上述实验结果说明CUR具有逆转激素抵抗的作用，对于慢阻肺等激素抵抗型疾病，CUR具有潜在的治疗价值。
尽管在改善激素抵抗方面具有确切的效果，但是CUR难溶于水，在体内易转化其他的代谢产物，生物利用率较低。研究显示，在大量的口服CUR后(如10~12 g/d)，人体血浆中CUR浓度也仅为毫微克级别[11]。因此，CUR虽具有极高的科研和临床应用价值，但是其药代学特点限制了其在呼吸系统疾病治疗方面的研究。
将CUR制成纳米制剂可在一定程度上改善其自身的理化性质及生物活性，该方面的研究已引起广泛关注[12]。mPEG-PLGA是美国食品药品管理局认可的用于人体的两种可降解生物材料，mPEG和PLGA两者形成的嵌段共聚物常被作为药物载体材料而用于纳米粒子的制备。Anand等[13]研究显示，mPEG-PLGA包被的CUR-NPs能够提高CUR在细胞中的蓄积量，在诱导肿瘤细胞凋亡方面，CUR-NPs的生物学活性是普通CUR的2倍。Khalil等[14]研究发现，在大鼠体内口服条件下，与普通CUR相比，mPEG-PLGA包被的CUR-NPs的最大血浆浓度增加7.4倍，半衰期增加6 h，分布容量降低4.6倍，最终其生物活性可以增加55.4倍。
本实验的共聚焦显微镜结果显示CUR-NPs能够提高CUR在细胞中的蓄积量，有利于延长CUR在细胞内的滞留时间。实验结果也显示在CUR和CUR-NPs处于低浓度梯度时，CUR-NPs+BUD组对IL-8的抑制率均高于CUR+BUD组，同时CUR-NPs对HDAC2的表达的上调作用也高于CUR组。这表明在逆转激素抵抗方面CUR-NPs具有更强的生物学活性，亦表明纳米包被技术是改善CUR难溶性和不稳定性的重要途径，值得在动物水平上进行更深入的研究。
慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)是以不完全可逆、呈进行性发展的慢性气流受限为特征的疾病，相对于其他的气道慢性疾病，慢阻肺的死亡率和致残率都较高，而对激素药物不敏感是导致慢阻肺治疗效果不佳的主要的原因[1]。姜黄素(curcumin，CUR)是从姜黄(curcuma longa)中分离出来的一种低分子质量多酚类化合物。研究发现，CUR能够提高组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase，HDAC2)的活性，合用可以提高激素的抗炎活性[2]。但是CUR难溶于水，碱性环境下易降解，生物体内易发生转化，利用率极低，限制了其在科研和临床中的应用[3]。近年来，基于聚合物材料的纳米技术正逐渐成为药剂学研究的热点，此技术能改善难溶性药物的溶解度和溶出速度，将CUR制成纳米制剂可在一定程度上提高其水溶性，增强其稳定性，同时在CUR释放前，细胞即可以内吞的方式摄入纳米颗粒，从而提高了CUR的蓄积量。本实验利用mPEG2000-PLGA作为载体，采用溶剂挥发法制备载CUR-mPEG2000-PLGA纳米粒(CUR-NPs)，香烟提取物(cigarette smoke extract，CSE)暴露诱导激素抵抗细胞模型，探讨CUR和CUR-NPs对激素抵抗的逆转作用，比较CUR和CUR-NPs的生物学作用差异。
材料与方法
一 材料
1．细胞和试剂：巨噬细胞RAW264.7(上海合生园生物科技发展有限公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，大前门香烟(尼古丁含量0.9 mg，焦油含量12 mg，烟气碱含量14 mg，上海烟草公司)，姜黄素(Sigma公司)，聚乙二醇-聚乳酸乙酸酯[mPEG-PLGA，mPEG相对分子质量2 000，mPEG 4%，LA/GA(55 :45)，济南岱罡生物科技有限公司]，布地奈德(budesonide，BUD)(阿斯利康公司)，抗大鼠HDAC2抗体(美国Abcam公司)，逆转录试剂盒[TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司]，实时荧光定量PCR(Real-time PCR)试剂盒[TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司]，大鼠白细胞介素8(IL-8)酶联免疫吸附法试剂盒(美国R & D公司)。
2．仪器：紫外可见光分光光度计(上海迪诺力泰仪器设备有限公司)，恒温磁力搅拌器(德国IKA集团)，冷冻超速离心机(Thermo Electron公司)，H-7650透射电子显微镜(日本Hitachi公司)，Zetasizer Nano ZS90激光粒度测定仪(英国Marlven公司)，共聚焦显微镜(德国Leica)。
二 方法
1．CUR-NPs的制备：采用乳化溶剂挥发法制备CUR-mPEG-PLGA纳米粒[4]。室温下将30 mg的mPEG2000-PLGA和1 mg的CUR溶于3 mL丙酮-乙醇混合溶液(丙酮与乙醇体积比为1 :1)中形成有机相。在磁力搅拌(300 r/min)下将此溶液缓慢滴入3%的PVA溶液，形成CUR及mPEG2000-PLGA纳米粒子悬液，有机相滴加完成后继续磁力搅拌5 min停止。将所得纳米粒溶液置入真空旋转蒸发仪，于40℃水浴中，以100 r/min减压蒸发40 min，除去残留的丙酮和乙醇。而后将纳米粒溶液放入低温离心机内以2 000 r/min离心20 min去除团聚的大粒子，再以12 000 r/min离心30 min沉淀纳米粒，弃去上清液，去除残留的PVA和mPEG2000-PLGA，双蒸水重新悬起纳米粒子，重复洗涤3次。将得到的纳米粒溶液冻干后保存。用紫外-可见分光光度法测吸光度(A)，绘制浓度与吸光度的线性曲线，高速离心法测定CUR-NPs的载药量和包封率。
2．CUR-NPs的表征：采用激光粒度测定仪测定CUR-NPs的粒径大小，透射电子显微镜观察CUR-NPs的形貌。
3．CSE的制备：参考文献[5]报道的方法进行制备。1支香烟燃烧的烟雾在负压吸引下在2 min内溶于10 mL的培养基中。经0.22μm滤膜过滤除菌后作为100% CSE原液使用，制备后30 min内使用完成。
4．细胞分组及药物干预：ELISA法检测巨噬细胞RAW264.7所分泌的IL-8。取对数生长期巨噬细胞RAW264.7，以2×104个/孔接种于6孔板，待细胞贴壁良好后，弃掉旧培养基，以含1%FBS的培养基饥饿培养细胞12 h，BUD(10-10~10-5 mol/L)干预15 min后，加入脂多糖(LPS)(0.1μg/mL)，细胞孵育24 h后，收集细胞上清。按上述方法培养巨噬细胞RAW264.7，各组药物CUR(10-10~10-5 mol/L)、BUD(10-10~10-5 mol/L)、CUR(10-7 mol/L)+ BUD(10-9~10-5 mol/L)、CUR(10-9~10-5 mol/L)+ BUD(10-7 mol/L)、CUR-NPs(10-9~10-5 mol/L)+BUD(10-7 mol/L)干预15 min后，CSE(10%)刺激4 h，然后加入LPS(0.1μg/mL)，细胞孵育24 h后，收集细胞上清。将上述细胞上清按照ELISA试剂盒厂家提供的操作指南进行IL-8的检测，将样品和不同浓度的标准品加入相应孔中，37℃孵育120 min，洗板。依次加入HRP工作液、标准色液、终止液，30 min内用自动酶标仪处读OD值。根据标准曲线计算待测样品的含量。计算BUD对IL-8分泌的抑制率及半数抑制浓度(IC50)。
5．Real-time PCR检测细胞中HDAC2 mRNA的表达：上述方法孵育巨噬细胞RAW264.7，BUD(10-7 mol/L)、CUR(10-7、10-6 mol/L)和CUR-NPs(10-7、10-6 mol/L)干预15 min后，CSE(10%)刺激，孵育24 h后，收集细胞。Trizol提取各组细胞的RNA，在分光光度计下测定RNA的浓度和OD260/280比值。各样本均按1μg RNA相应的体积(nμL)根据逆转录试剂盒说明进行逆转录，每样本转录体系为20μL体系，混合好的液体放置在PCR仪中，反应条件为37℃15 min，85℃5 s。将得到cDNA根据Real-time PCR说明书进行半定量PCR，反应条件为95℃30 s预变性，然后进行40个循环，95℃5 s，60℃34 s两步法进行PCR。以GAPDH为内参。引物序列：HDAC2上游引物5′-GGGCTGCTTCAACCTAACTG-3′，下游引物5′-TTCA CAATCAAGGGCAACTG-3′，扩增片段长度142 bp；GAPDH上游引物5′-GCAAGTTCAACGGCACAG-3′，下游引物5′-GCAAGTAGACTCCACGACAT-3′，扩增片段长度143 bp。Real-time PCR得到的相应的Ct值用2-ΔΔCt法进行分析。
6．Western blot测定细胞中HDAC2的蛋白表达：上述方法孵育巨噬细胞RAW264.7，BUD(10-7 mol/L)、CUR(10-7、10-6 mol/L)和CUR-NPs(10-7、10-6 mol/L)干预15 min后，CSE(10%)刺激，孵育24 h后，收集细胞。用RIPA裂解液提取各组分细胞，然后用BCA测定蛋白浓度试剂盒测定各组分细胞样品总蛋白浓度。将所提取总蛋白样品与上样缓冲液按比例混合，煮沸5 min，聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1~2 h，然后放入含有适量一抗(HDAC2 1 :2 000，β-actin 1 :1 000稀释)的一抗稀释液中，4℃振荡过夜。洗涤。然后放入含有适量二抗(1 :1 000稀释)的TBST液中，室温振荡120 min，洗涤，最终显色成像。结果经Image LabTM软件进行灰度值分析。
7．细胞对CUR和CUR-NPs摄取量的检测：采用共聚焦显微成像系统检测巨噬细胞RAW264.7对CUR和CUR-NPs内CUR的摄取量。实验的激发波长为488 nm，发射波长为520 nm。细胞以1.0×104个/皿接种于共焦皿中，放置于培养箱孵育24 h后，换以CUR(10-7 mol/L)溶液及CUR-NP(10-7 mol/L)溶液继续孵育。然后取各时间点进行共焦显微成像﹙物镜采用100×oil)。
三 统计学处理
采用SPSS 17.0进行统计分析，数据用
结果
一 包封率、载药量的测定及CUR-NPs的表征
高速离心法测定结果显示CUR-NPs载药量为(78.33±2.52)%，包封率为(10.86±2.90)%。粒度测定仪测得结果显示CUR-NPs平均粒径(356.4±146.6) nm，粒度分布均匀，呈单峰分布，结果见图 1。CUR-NPs的形态为类球形，表面较光滑，大小较均匀，结果见图 2。
图1
CUR-NPs的粒径分布
图2
CUR-NPs的形态
二 不同浓度梯度的BUD对IL-8分泌的抑制作用及IC50计算
与LPS刺激相比，LPS+CSE共刺激时BUD(10-10~10-5 mol/L)对IL-8分泌的最大抑制率显著降低(P < 0.05)，IC50显著增高(P < 0.05)。LPS+CSE共刺激时，与BUD(10-10~10-5 mol/L)组相比，CUR(10-7 mol/L)+BUD(10-9~10-5 mol/L)组BUD对IL-8分泌的最大抑制率显著增高(P < 0.05)，IC50显著降低(P < 0.05)。结果见图 3和表 1。
图3
药物对IL-8分泌的抑制作用
a．LPS刺激，BUD(10-10~10-5 mol/L)干预；b．LPS+CSE共刺激，BUD(10-10~10-5 mol/L)组及CUR(10-7 mol/L)+BUD(10-9~10-5 mol/L)组干预；c．LPS+CSE刺激，CUR(10-10~10-5 mol/L)干预
表1
药物对IL-8分泌的最大抑制率及IC50
三 CUR及CUR-NPs生物学作用比较
LPS+CSE共刺激时，CUR和CUR-NPs浓度梯度为10-9、10-8、10-7 mol/L时，CUR-NPs+BUD(10-7 mol/L)组对IL-8分泌的抑制率显著高于CUR+BUD(10-7 mol/L)组(P < 0.05)。结果见图 4和表 2。
图4
CUR及CUR-NPs的生物学作用比较
与CUR+BUD(10-7 mol/L)组比较，*
表2
两组药物不同浓度梯度下对IL-8分泌的抑制率
四 细胞中HDAC2 mRNA的表达水平检测
CSE刺激后细胞中HDAC2的mRNA表达量显著降低(0.42±0.30比2.10±0.53，P < 0.05)。CUR(10-7、10-6 mol/L)组及CUR-NPs(10-7、10-6 mol/L)组细胞中HDAC2的mRNA表达量较CSE组显著增高(1.08±0.30、1.7±0.38、1.74±0.24和1.96±0.34比0.42±0.30，P < 0.05)。浓度梯度同为10-7 mol/L时，CUR-NPs组细胞中HDAC2的mRNA表达量显著高于CUR组(1.74±0.24比1.08±0.30，P < 0.05)。结果见图 5。
图5
细胞中HDAC2 mRNA的表达水平
与对照组比较，△
五 细胞中HDAC2的蛋白表达水平检测
CSE刺激后细胞中HDAC2的蛋白表达量显著降低(31.33±11.59比95.67±3.51，P < 0.05)。CUR(10-7、10-6 mol/L)组及CUR-NPs(10-7、10-6 mol/L)组细胞中HDAC2的蛋白表达量较CSE组显著增高(51.67±3.21、75.67±7.02、77.33±8.62和86.67±4.04比31.33±11.59，P < 0.05)。浓度梯度同为10-7 mol/L时，CUR-NPs组细胞中HDAC2的蛋白表达量高于CUR组(77.33±8.62比51.67±3.21，P < 0.05)。结果见图 6。
图6
细胞中HDAC2的蛋白表达水平
与无刺激对照组比较，△
六 细胞对CUR及CUR-NPs内CUR摄取量检测
共聚焦显微镜观察细胞对CUR和CUR-NPs中CUR的摄取量(图 7)，经CUR孵育的细胞的荧光强度值轻微上升，2 h左右达最大值。经CUR-NPs孵育的细胞荧光强度大幅度上升，大概在4 h左右细胞荧光强度达最大。CUR-NPs组荧光强度最高值明显大于CUR组荧光强度最高值[(318.63±22.19)AU比(133.70±5.69)AU，P < 0.05]，24 h后CUR-NPs组荧光强度明显大于CUR组荧光强度[(63.76±15.50)AU比(29.67±6.03)AU，P < 0.05]。定量计算结果显示，CUR-NPs组荧光强度-时间曲线面积显著大于CUR组[(4 714.56±351.68)AU比(2 078.33±55.30)AU，P < 0.05]。
图7
细胞对CUR及CUR-NPs内CUR摄取量的检测
讨论
糖皮质激素抵抗是近年来慢阻肺治疗领域的研究热点。目前研究表明，与糖皮质激素抵抗有关的机制包括HDAC2活性下降、糖皮质激素受体异常、核因子κB(NF-κB)激活通路缺乏等，其中HDAC2活性降低是导致糖皮质激素抵抗的重要原因[6-7]。本实验结果显示，与LPS刺激相比，LPS+CSE共刺激时，BUD对IL-8的抑制作用明显减弱；在巨噬细胞RAW264.7中，与对照组比较，CSE组HDAC2 mRNA相对量和蛋白表达都明显降低。这说明CSE诱导细胞中HDAC2活性和表达的下调，CSE暴露可以造成细胞对BUD抗炎作用产生抵抗。
在细胞水平上，CUR可以上调HDAC2活性，增加激素敏感性，逆转激素抵抗，这使其在慢阻肺抗炎治疗的研究领域引起了足够的关注[8-9]。本课题组前期的研究结果表明，在动物水平上，CUR和BUD合用可明显升高慢阻肺大鼠肺组织中HDAC2的表达，降低IL-8、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达量，说明CUR可能通过增加HDAC2的表达和活性提高糖皮质激素对慢阻肺大鼠的抗炎作用[10]。本实验结果显示，LPS与CSE共刺激巨噬细胞RAW264.7时，CUR与BUD合用时BUD对IL-8的最大抑制率升高，同时IC50降低，说明CUR可以逆转CSE诱导的激素抵抗；同时，CUR可以上调HDAC2 mRNA和蛋白的表达。上述实验结果说明CUR具有逆转激素抵抗的作用，对于慢阻肺等激素抵抗型疾病，CUR具有潜在的治疗价值。
尽管在改善激素抵抗方面具有确切的效果，但是CUR难溶于水，在体内易转化其他的代谢产物，生物利用率较低。研究显示，在大量的口服CUR后(如10~12 g/d)，人体血浆中CUR浓度也仅为毫微克级别[11]。因此，CUR虽具有极高的科研和临床应用价值，但是其药代学特点限制了其在呼吸系统疾病治疗方面的研究。
将CUR制成纳米制剂可在一定程度上改善其自身的理化性质及生物活性，该方面的研究已引起广泛关注[12]。mPEG-PLGA是美国食品药品管理局认可的用于人体的两种可降解生物材料，mPEG和PLGA两者形成的嵌段共聚物常被作为药物载体材料而用于纳米粒子的制备。Anand等[13]研究显示，mPEG-PLGA包被的CUR-NPs能够提高CUR在细胞中的蓄积量，在诱导肿瘤细胞凋亡方面，CUR-NPs的生物学活性是普通CUR的2倍。Khalil等[14]研究发现，在大鼠体内口服条件下，与普通CUR相比，mPEG-PLGA包被的CUR-NPs的最大血浆浓度增加7.4倍，半衰期增加6 h，分布容量降低4.6倍，最终其生物活性可以增加55.4倍。
本实验的共聚焦显微镜结果显示CUR-NPs能够提高CUR在细胞中的蓄积量，有利于延长CUR在细胞内的滞留时间。实验结果也显示在CUR和CUR-NPs处于低浓度梯度时，CUR-NPs+BUD组对IL-8的抑制率均高于CUR+BUD组，同时CUR-NPs对HDAC2的表达的上调作用也高于CUR组。这表明在逆转激素抵抗方面CUR-NPs具有更强的生物学活性，亦表明纳米包被技术是改善CUR难溶性和不稳定性的重要途径，值得在动物水平上进行更深入的研究。
