引用本文： 陈文琼, 胡瑞成, 戴爱国. 泛素连接酶Hrd1与呼吸系统疾病. 中国呼吸与危重监护杂志, 2016, 15(1): 99-101. doi: 10.7507/1671-6205.2016025 复制
肺部的细胞在受到缺氧、烟雾等外界刺激时会发生内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，而ERS参与多种肺部疾病的发生发展[1]。羟甲基戊二酰辅酶A还原酶降解蛋白1(Hmg-CoA reductase degradation 1，Hrd1)为一个六次跨膜的内质网膜蛋白，其生物学功能是作为E3泛素连接酶参与内质网相关性降解(ER-associated degradation，ERAD)[2]。ERAD作为细胞保护机制能缓解过强的ERS所致的细胞凋亡，从而参与疾病的发生发展并影响肺部疾病的预后[3]。现就ERAD的核心蛋白Hrd1与肺部相关疾病做一综述。
一 HRD的发现及其结构
1996年Hampton等[2]在酵母中鉴定出了羟甲基戊二酰辅酶A还原酶降解蛋白基因(HMG-CoA reductase degradation，HRD)，包括HRD1、HRD2、HRD3。1998年Bordallo等[4]在研究酵母突变羧肽酶(carboxypeptidase yscY，CPY)的降解中发现了基因DER3，并证实其与HRD1为相同基因，命名相关蛋白为Hrd1p/Der3p。2001年Deak等[5]发现Hrd1p/Der3p为一个6次跨膜的内质网膜蛋白，N末端为横跨内质网膜的疏水端，C末端为含RING结构域的亲水端。随后发现在人体组织中Hrd1p的同源物为Hrd1，其相关基因定位在人11号染色体的11q13区域，多肽链由617个氨基酸组成，约为85 kDa，在人体肝脏、脑、肺、肾脏、脾脏、心脏等都有表达，同时证实酵母的Hrd1p进化到人的Hrd1，其功能上有高度保守性[6]。Omura等[7]探讨了Hrd1各结构域的作用，其中RING尾端结构域是Hrd1发挥E3泛素连接酶作用最重要的结构域，其作用为将泛素从泛素结合酶E2转移到底物蛋白上，从而使底物泛素化；跨膜结构域起逆向转移作用，将底物蛋白从内质网腔内逆向转移到胞质内，另外该结构域对Hrd1的稳定性也起着重要作用；富含脯氨酸的结构域证实与底物蛋白被蛋白酶体降解密切相关。2003年Amano等[8]在大鼠的类风湿性关节炎的滑膜细胞中鉴定和克隆出了滑膜蛋白(synoviolin，SYVN1)，同时证实其与Hrd1p同源，并在类风湿性关节炎滑膜组织中高表达，参与了该病的发生发展。
二 Hrd1的生物学功能
当细胞受到缺氧、炎症等刺激时，内质网的功能将受阻，导致错误折叠或未折叠蛋白增加，即内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[9]。未折叠蛋白在内质网腔内的累积超过了内质网的承受能力，机体将启动细胞保护机制未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)及ERAD[10]。ERAD主要包括底物蛋白(未折叠或错误折叠蛋白)识别、底物泛素化与转运、降解三个过程[11]。通过泛素-蛋白酶体途径实现，即底物蛋白通过泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)的泛素化及转运，最后转运至胞质中与26蛋白酶体结合完成降解[12]。在ERAD中，底物泛素化与转运为最关键的一步，Hrd1作为内质网膜上的跨膜蛋白起着“门控通道”的作用，将底物蛋白泛素化后从内质网腔内转运至胞质中完成降解[13]。因此，Hrd1为ERAD的核心蛋白，起着关键性作用[14]。
ERAD作为细胞的保护机制，可以减轻甚至阻断过强的ERS所致的内质网应激诱导性凋亡(endoplasmic reticulum stress induced apoptosis，ERSIA)，所以Hrd1作为其核心蛋白具有抗细胞凋亡的作用[15]。Yagishita等[16]发现敲除了HRD1基因的小鼠子宫内胚胎不能正常发育，最终死亡，其机制主要为胎肝容易发生ERS，敲除了HRD1基因的胚胎肝脏细胞凋亡增加，导致最终不能发育成形。之后的研究发现在类风湿性关节炎患者的滑膜组织中Hrd1高表达，并参与了该病的发生发展，分析其机制发现Hrd1主要通过两条抗凋亡途径使滑膜细胞过度增殖从而最终导致增生性的关节病变，其中一条途径是Hrd1通过ERAD阻止滑膜细胞过度的ERS引起细胞发生ERSIA；另一条途径为滑膜细胞中高表达的Hrd1能与胞质中的肿瘤抑制因子p53结合，抑制p53的促细胞凋亡作用[17]。
三 Hrd1与肺部疾病
1.慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)：慢阻肺是一种长期的慢性炎症导致的呼吸系统疾病，主要表现为慢性支气管炎和肺气肿。α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，AAT)是丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor，serpin)超家族的成员之一，AAT缺陷(α1-antitrypsin deficiency，AATD)是一种常染色体隐性遗传性疾病，以Z突变表现最为典型，已被证实参与了慢阻肺的发生发展[18]。Wang等[19]发现内质网腔内的AAT突变体(Z variant of AAT，ATZ)的降解是通过内质网相关性降解来完成的，并且依赖于E3泛素连接酶Hrd1，所以可以通过该机制促进ATZ的降解，增加血清内AAT的水平，减缓疾病的发展。
2.肺癌：Wan等[20]和Swinson等[21]证实在低氧环境下，缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在肺组织中高表达并参与了肺癌的发生发展。凝集素蛋白(lectin proteinosteosarcoma amplified-9，OS-9)在ERAD中对未折叠蛋白的识别和招募中起重要作用[13]。Kim等[22]发现在低氧条件下，OS-9与其他E3泛素连接酶共同作用使HIF-1α泛素化随后降解。而作为ERAD的自我调节机制，Hrd1能降解0S-9来防止ERAD的过度激活，所以可以推测Hrd1能通过0S-9间接影响肿瘤细胞的发生发展[23]。此外，p53为肿瘤抑制基因，有促进细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、阻滞细胞周期等功能。Yamasaki等[24]于2007年发现当细胞发生ERS后Hrd1能与胞质中的p53结合并将其泛素化随后降解。利用该机制可抑制p53的降解，从而促进肿瘤细胞的凋亡[25]。研究发现抑制Hrd1的表达可增强ERS，增加人肺腺癌耐顺铂低敏细胞株A549/DDP细胞的凋亡，提高耐药细胞对顺铂的敏感性[26]。其机制可能是Hrd1被抑制后，ERAD途径被阻断，底物在内质网上不能及时清除，从而加重ERS，超过内质网负荷而最终导致细胞凋亡[26]。
3.囊性纤维化：囊性纤维化是由跨膜调节因子基因(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)的突变引起的常染色体隐形遗传性疾病。CFTR的重要结构域为ATP依赖的氯(Cl-)通道，定位于气道上皮细胞维持上皮细胞的水盐平衡。CFTR最常见的缺陷是在该蛋白的第508位苯丙氨酸残基缺失，即△F508-CFTR，△F508-CFTR仍保留了ATP依赖的Cl-通道结构域，但△F508-CFTR不能正常折叠从而激活内质网的ERAD系统，使△F508-CFTR降解[27]。E3泛素连接酶gp78在△F508-CFTR的降解中起着决定性的作用，Ballar等[28]发现Hrd1在gp78的自我降解中起着关键作用，从而负相调节了gp78对△F508-CFTR的降解。气道上皮细胞CFTR的缺失会导致气道上皮细胞的离子转运受阻，继而引起气道内的黏液堆积以及慢性炎症的产生，最终导致肺囊性纤维化和慢阻肺[29]。因此，可以利用Hrd1介导的ERAD来抑制△F508-CFTR的降解，从而改善肺囊性纤维化的相关症状。
4.间质性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)：ILD是以弥漫性肺实质、肺泡炎和间质纤维化为基本病理改变的肺部疾病。表面活性蛋白C(surfactant protein C，SP-C)是一个疏水性肺表面活性剂蛋白质组件，特异性表达在肺泡Ⅱ型上皮细胞，以往的研究证实，SP-C的突变促进了ILD的发生发展[30]。2014年Nakajima等[31]发现Hrd1在SP-C的突变体所致的ILD中起着重要作用，其主要机制是4号外显子缺失的SP-C突变蛋白SP-CΔexon4会诱发肺上皮细胞发生ERS，随后引起Hrd1的表达上调。Hrd1会使组织内的胶原蛋白增加，该结论已在肾纤维化中证实[32]。同时Nakajima等[31]提到用Hrd1的特异性抑制剂LS-102，可使胶原蛋白的生成明显减少，因此可以利用Hrd1特异性抑制剂的抗纤维化作用为ILD的治疗提供新的治疗靶点。
四 结语
Hrd1为E3泛素连接酶，通过对底物蛋白的识别和逆向转运来参与ERAD。因Hrd1为ERAD的核心蛋白，延缓甚至阻止了组织细胞ERSIA的发生，从而起到了抗凋亡的作用。研究证实Hrd1与临床上多种疾病相关。因Hrd1在肺部组织中有表达，其与呼吸系统疾病的关系成为近年来的研究热点。虽然有大量理论依据和基础实验证实Hrd1与肺部疾病关系密切，但是其在临床的研究有待进一步深入。同时，Hrd1是否也参与肺部其他疾病如哮喘的发生发展有待进一步探讨。随着Hrd1研究的深入，其有望成为呼吸系统相关疾病新的治疗靶点。
肺部的细胞在受到缺氧、烟雾等外界刺激时会发生内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，而ERS参与多种肺部疾病的发生发展[1]。羟甲基戊二酰辅酶A还原酶降解蛋白1(Hmg-CoA reductase degradation 1，Hrd1)为一个六次跨膜的内质网膜蛋白，其生物学功能是作为E3泛素连接酶参与内质网相关性降解(ER-associated degradation，ERAD)[2]。ERAD作为细胞保护机制能缓解过强的ERS所致的细胞凋亡，从而参与疾病的发生发展并影响肺部疾病的预后[3]。现就ERAD的核心蛋白Hrd1与肺部相关疾病做一综述。
一 HRD的发现及其结构
1996年Hampton等[2]在酵母中鉴定出了羟甲基戊二酰辅酶A还原酶降解蛋白基因(HMG-CoA reductase degradation，HRD)，包括HRD1、HRD2、HRD3。1998年Bordallo等[4]在研究酵母突变羧肽酶(carboxypeptidase yscY，CPY)的降解中发现了基因DER3，并证实其与HRD1为相同基因，命名相关蛋白为Hrd1p/Der3p。2001年Deak等[5]发现Hrd1p/Der3p为一个6次跨膜的内质网膜蛋白，N末端为横跨内质网膜的疏水端，C末端为含RING结构域的亲水端。随后发现在人体组织中Hrd1p的同源物为Hrd1，其相关基因定位在人11号染色体的11q13区域，多肽链由617个氨基酸组成，约为85 kDa，在人体肝脏、脑、肺、肾脏、脾脏、心脏等都有表达，同时证实酵母的Hrd1p进化到人的Hrd1，其功能上有高度保守性[6]。Omura等[7]探讨了Hrd1各结构域的作用，其中RING尾端结构域是Hrd1发挥E3泛素连接酶作用最重要的结构域，其作用为将泛素从泛素结合酶E2转移到底物蛋白上，从而使底物泛素化；跨膜结构域起逆向转移作用，将底物蛋白从内质网腔内逆向转移到胞质内，另外该结构域对Hrd1的稳定性也起着重要作用；富含脯氨酸的结构域证实与底物蛋白被蛋白酶体降解密切相关。2003年Amano等[8]在大鼠的类风湿性关节炎的滑膜细胞中鉴定和克隆出了滑膜蛋白(synoviolin，SYVN1)，同时证实其与Hrd1p同源，并在类风湿性关节炎滑膜组织中高表达，参与了该病的发生发展。
二 Hrd1的生物学功能
当细胞受到缺氧、炎症等刺激时，内质网的功能将受阻，导致错误折叠或未折叠蛋白增加，即内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[9]。未折叠蛋白在内质网腔内的累积超过了内质网的承受能力，机体将启动细胞保护机制未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)及ERAD[10]。ERAD主要包括底物蛋白(未折叠或错误折叠蛋白)识别、底物泛素化与转运、降解三个过程[11]。通过泛素-蛋白酶体途径实现，即底物蛋白通过泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)的泛素化及转运，最后转运至胞质中与26蛋白酶体结合完成降解[12]。在ERAD中，底物泛素化与转运为最关键的一步，Hrd1作为内质网膜上的跨膜蛋白起着“门控通道”的作用，将底物蛋白泛素化后从内质网腔内转运至胞质中完成降解[13]。因此，Hrd1为ERAD的核心蛋白，起着关键性作用[14]。
ERAD作为细胞的保护机制，可以减轻甚至阻断过强的ERS所致的内质网应激诱导性凋亡(endoplasmic reticulum stress induced apoptosis，ERSIA)，所以Hrd1作为其核心蛋白具有抗细胞凋亡的作用[15]。Yagishita等[16]发现敲除了HRD1基因的小鼠子宫内胚胎不能正常发育，最终死亡，其机制主要为胎肝容易发生ERS，敲除了HRD1基因的胚胎肝脏细胞凋亡增加，导致最终不能发育成形。之后的研究发现在类风湿性关节炎患者的滑膜组织中Hrd1高表达，并参与了该病的发生发展，分析其机制发现Hrd1主要通过两条抗凋亡途径使滑膜细胞过度增殖从而最终导致增生性的关节病变，其中一条途径是Hrd1通过ERAD阻止滑膜细胞过度的ERS引起细胞发生ERSIA；另一条途径为滑膜细胞中高表达的Hrd1能与胞质中的肿瘤抑制因子p53结合，抑制p53的促细胞凋亡作用[17]。
三 Hrd1与肺部疾病
1.慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)：慢阻肺是一种长期的慢性炎症导致的呼吸系统疾病，主要表现为慢性支气管炎和肺气肿。α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，AAT)是丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor，serpin)超家族的成员之一，AAT缺陷(α1-antitrypsin deficiency，AATD)是一种常染色体隐性遗传性疾病，以Z突变表现最为典型，已被证实参与了慢阻肺的发生发展[18]。Wang等[19]发现内质网腔内的AAT突变体(Z variant of AAT，ATZ)的降解是通过内质网相关性降解来完成的，并且依赖于E3泛素连接酶Hrd1，所以可以通过该机制促进ATZ的降解，增加血清内AAT的水平，减缓疾病的发展。
2.肺癌：Wan等[20]和Swinson等[21]证实在低氧环境下，缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在肺组织中高表达并参与了肺癌的发生发展。凝集素蛋白(lectin proteinosteosarcoma amplified-9，OS-9)在ERAD中对未折叠蛋白的识别和招募中起重要作用[13]。Kim等[22]发现在低氧条件下，OS-9与其他E3泛素连接酶共同作用使HIF-1α泛素化随后降解。而作为ERAD的自我调节机制，Hrd1能降解0S-9来防止ERAD的过度激活，所以可以推测Hrd1能通过0S-9间接影响肿瘤细胞的发生发展[23]。此外，p53为肿瘤抑制基因，有促进细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、阻滞细胞周期等功能。Yamasaki等[24]于2007年发现当细胞发生ERS后Hrd1能与胞质中的p53结合并将其泛素化随后降解。利用该机制可抑制p53的降解，从而促进肿瘤细胞的凋亡[25]。研究发现抑制Hrd1的表达可增强ERS，增加人肺腺癌耐顺铂低敏细胞株A549/DDP细胞的凋亡，提高耐药细胞对顺铂的敏感性[26]。其机制可能是Hrd1被抑制后，ERAD途径被阻断，底物在内质网上不能及时清除，从而加重ERS，超过内质网负荷而最终导致细胞凋亡[26]。
3.囊性纤维化：囊性纤维化是由跨膜调节因子基因(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)的突变引起的常染色体隐形遗传性疾病。CFTR的重要结构域为ATP依赖的氯(Cl-)通道，定位于气道上皮细胞维持上皮细胞的水盐平衡。CFTR最常见的缺陷是在该蛋白的第508位苯丙氨酸残基缺失，即△F508-CFTR，△F508-CFTR仍保留了ATP依赖的Cl-通道结构域，但△F508-CFTR不能正常折叠从而激活内质网的ERAD系统，使△F508-CFTR降解[27]。E3泛素连接酶gp78在△F508-CFTR的降解中起着决定性的作用，Ballar等[28]发现Hrd1在gp78的自我降解中起着关键作用，从而负相调节了gp78对△F508-CFTR的降解。气道上皮细胞CFTR的缺失会导致气道上皮细胞的离子转运受阻，继而引起气道内的黏液堆积以及慢性炎症的产生，最终导致肺囊性纤维化和慢阻肺[29]。因此，可以利用Hrd1介导的ERAD来抑制△F508-CFTR的降解，从而改善肺囊性纤维化的相关症状。
4.间质性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)：ILD是以弥漫性肺实质、肺泡炎和间质纤维化为基本病理改变的肺部疾病。表面活性蛋白C(surfactant protein C，SP-C)是一个疏水性肺表面活性剂蛋白质组件，特异性表达在肺泡Ⅱ型上皮细胞，以往的研究证实，SP-C的突变促进了ILD的发生发展[30]。2014年Nakajima等[31]发现Hrd1在SP-C的突变体所致的ILD中起着重要作用，其主要机制是4号外显子缺失的SP-C突变蛋白SP-CΔexon4会诱发肺上皮细胞发生ERS，随后引起Hrd1的表达上调。Hrd1会使组织内的胶原蛋白增加，该结论已在肾纤维化中证实[32]。同时Nakajima等[31]提到用Hrd1的特异性抑制剂LS-102，可使胶原蛋白的生成明显减少，因此可以利用Hrd1特异性抑制剂的抗纤维化作用为ILD的治疗提供新的治疗靶点。
四 结语
Hrd1为E3泛素连接酶，通过对底物蛋白的识别和逆向转运来参与ERAD。因Hrd1为ERAD的核心蛋白，延缓甚至阻止了组织细胞ERSIA的发生，从而起到了抗凋亡的作用。研究证实Hrd1与临床上多种疾病相关。因Hrd1在肺部组织中有表达，其与呼吸系统疾病的关系成为近年来的研究热点。虽然有大量理论依据和基础实验证实Hrd1与肺部疾病关系密切，但是其在临床的研究有待进一步深入。同时，Hrd1是否也参与肺部其他疾病如哮喘的发生发展有待进一步探讨。随着Hrd1研究的深入，其有望成为呼吸系统相关疾病新的治疗靶点。