引用本文： 肖华, 陈思, 张伟, 陆乘俊, 梁晓飞, 沈鹤柏, 金海, 吴俊杰, 李强. 抗体免疫脂质磁球法检测肺癌循环肿瘤细胞初探. 中国呼吸与危重监护杂志, 2016, 15(2): 147-152. doi: 10.7507/1671-6205.2016035 复制
最近的全球癌症统计表明肺癌是男性癌症死亡的主要原因，并且在发达国家中已经超过乳腺癌成为女性癌症死亡的主要原因[1]。远处转移是肿瘤的基本特征之一，是许多肿瘤致死的关键因素[2]。随着病情的进展，肺癌患者会出现骨、脑、肝、肾上腺等远处转移，严重影响预后。目前临床上用于肿瘤诊断及预后判断的方法主要包括肿瘤组织活检、影像学、血清肿瘤标志物等检查，这些方法在评估肿瘤转移上均具有一定的局限性[3-4]。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是存在于实体瘤患者外周血中的肿瘤细胞，有研究表明在肿瘤患者中CTCs计数对治疗疗效的评价优于血清肿瘤标志物，且CTCs对临床疗效的早期评估优于影像学检查，但是目前在肺癌患者中尚缺乏检测CTCs的有效手段[5-6]。
前期我们以十八烷基三甲基氯化铵对羧甲基壳聚糖和胆固醇为原料找到了一种简单快速制备磁性阳离子高聚物脂质体的方法，较传统脂质体相比，有许多优良的特性，如物理和热稳定性好，有良好的水溶性等，且表面可连接多种生物活性物质[7-9]。上皮细胞粘附分子(EpCAM)是最常用于上皮来源循环肿瘤细胞阳性富集法的细胞表面标志物，细胞角蛋白家族(CK8，CK18，CK19)是检测上皮表型肿瘤的金标准[10-11]。此外，有研究发现表皮生长因子受体(EGFR)在肺癌细胞表面高表达[12]。本研究通过将肺癌表面抗体anti-EpCAM和anti-EGFR接于磁性阳离子高聚物脂质体上获得EpCAM和EGFR抗体免疫脂质磁球，以此两种磁球为捕获材料检测CTCs，并与CellsearchTM系统进行比较，评估这两种磁球是否可用于捕获肺癌患者CTCs。
材料与方法
一 材料
1．细胞系、主要试剂、外周血样本：肺癌细胞系A549细胞购自美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)细胞库；DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶购于Gibco公司；EpCAM抗体购于Sigma公司；CD45-PE购自eBioscience公司；藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记的CK19抗体购自强生Veridex公司；Cellsearch循环肿瘤细胞检测试剂盒购于强生Veridex公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色液购自碧云天生物技术有限公司；EpCAM抗体衍生物购自上海锐劲生物技术有限公司；磁性纳米颗粒购自上海晟纳实业有限公司；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSAPC-APCG)购自Avanti公司；胆固醇、二氯甲烷以及其他常用试剂均购自国药公司。10名健康成年志愿者，其中8名志愿者每人抽取外周血15~21 mL，2名抽取3 mL；16例病理确诊肺癌患者(无其他部位肿瘤)，其中13例患者抽取外周血6 mL(甲组样本)，3例抽取15 mL(乙组样本)；健康志愿者和甲组血样置于EDTA抗凝管中，乙组血样置于强生专用采血管中，24 h内处理。所有样本均取自于长海医院，受试者知情同意，研究通过医学伦理会审查。
2．实验仪器：磁力架(上海柏慧康生物科技有限公司)；离心机(上海安亭科学仪器厂)；荧光显微镜，OLYMPUS B×61；CellTracks(强生Veridex公司)；PE标记的CD45抗体(CD45-PE)和BD FACSEALIBUR流式细胞仪均为美国碧迪公司生产；强生CellTracks® AutoPrep® System CTCs检测仪(简称CellsearchTM系统，强生Veridex公司)。
二 方法
1．制备EpCAM和EGFR免疫脂质磁球：采用反向蒸发法制备免疫脂质磁球，后用EpCAM和EGFR抗体进行修饰，并用粒径分析仪分析，确保所制备的免疫脂质磁球的性能稳定。
2．制备磷酸缓冲盐溶液(PBS)CTCs模型：取肺癌A549细胞，计数后分别以1~10、11~50、51~100、 101~500、501~1 000个细胞5个梯度加入3 mL PBS溶液中，模拟CTCs模型。
3．制备外周血CTCs模型：取肺癌A549细胞，计数后分别以1~10、11~50、51~100、101~500、501~1 000个细胞5个梯度加入3 mL健康人外周血中，进一步模拟CTCs模型。
4．CTCs的捕获和鉴定：用EpCAM和EGFR免疫脂质磁捕获肺癌患者CTCs并使用DAPI、CK19-FITC、CD45-PE进行染色鉴定。本研究中CTCs捕获及鉴定为人工操作，方法原理与CellsearchTM相近[7]。具体步骤：将待测标本进行1 000 r/min离心10 min；小心取中上层液置于对应的EP管中后，加入与其等量的PBS(pH=7.4)充分混匀；随后加入选定免疫脂质磁球(EpCAM和EGFR免疫脂质磁球)120 μL，室温孵育30 min，每10 min混匀1次；将EP管插入磁分离架上吸附10 min，吸弃上清液，取出EP管；使用PBS对捕获的CTCs进行磁分离洗涤2次；加DAPI 30 μL、CK19-FITC 30 μL、CD45-PE 10 μL混匀避光染色15 min；染色结束后磁分离架上去离子水洗涤2次；最后，向EP管中加入30 μL去离子水重悬，混匀后的液体均匀涂于防脱载玻片中心，待液滴干后在荧光显微镜下拍照计数。
5．CTCs判断标准：荧光显微镜下蓝色通道观察DAPI染色，显示蓝色荧光为细胞核；绿色通道下观察呈绿色荧光表明该细胞表达CK，上皮来源可能性大；红色通道下显示红色荧光表明该细胞表达CD45，为白细胞。循环肿瘤细胞的判断标准为：将蓝色通道下显示蓝色荧光，绿色通道下显示绿色荧光且红色通道下不显示荧光的细胞判定为CTCs(图 1a、1b)；将蓝色通道下显示蓝色荧光，绿色通道下显示绿色荧光且红色通道下显示红色荧光的细胞判定为白细胞(图 1c)。
图1
免疫脂质磁球捕获肺癌患者CTCs后荧光显微镜下的观察与鉴定图像(×400，白场) a.EpCAM免疫脂质磁球捕获后 荧光显微镜下CTCs的图像；b.EGFR免疫脂质磁球捕获后荧光显微镜下CTCs的图像；c.荧光显微镜下观察到的白细胞的图像
三 统计学处理
将各组数据经SPSS 21.0统计软件处理。计数资料以
结 果
一 抗体修饰对免疫脂质磁球粒径的影响
用粒径分析仪检测纳米磁球，未经抗体修饰前的纳米磁球平均粒径为261.0 nm(图 2a)，经EpCAM抗体修饰后免疫脂质磁球平均粒径增大为319.5 nm(图 2b)，经EGFR抗体修饰后免疫脂质磁球平均粒径增大为325.4 nm(图 2c)。较小的粒径有助于抗体磁球保持在水相溶液中的稳定性，本实验制备的抗体磁球符合要求。
图2
磁球粒径分布 a.未经抗体修饰前的纳米磁球平均粒径；b.经EpCAM抗体修饰后免疫脂质磁球平均粒径；c.经EGFR抗体修饰后的免疫脂质磁球平均粒径
二 EpCAM与EGFR免疫脂质磁球对PBS溶液CTCs模型中A549细胞捕获结果
取不同细胞密度梯度的PBS溶液CTCs模型6组，其中3组用EpCAM免疫脂质磁球法，另外3组用EGFR免疫脂质磁球法进行CTCs捕获及鉴定。在不同浓度梯度下，两种磁球均能有效捕获A549细胞(图 3a~e)，对A549细胞的中位检出率分别为92%和90%，同种磁球在不同浓度梯度的PBS溶液CTCs模型中捕获效率差异无统计学意义(P＞0.05)，不同磁球在同种细胞密度下捕获效率差异无统计学意义(图 3f)。
图3
EpCAM与EGFR免疫脂质磁球捕获鉴定不同浓度梯度的PBS溶液CTCs模型 a~e.分别为在3 mL的PBS溶液中加入1~10、11~50、51~100、101~500、501~1 000个A549细胞时两种磁球的捕获结果；f.5个浓度梯度下两种磁球捕获效率的比较(P＞0.05)
三 EpCAM与EGFR免疫脂质磁球对外周血CTCs模型中肺癌A549细胞的捕获结果
取不同浓度梯度的外周血CTCs模型8组，其中4组用EpCAM免疫脂质磁球，另外4组用EGFR免疫脂质磁球进行CTCs捕获鉴定。结果显示，在不同肿瘤细胞密度梯度下，两种磁球均能有效捕获外周血中的A549细胞(图 4a~e)，且捕获效率均大于70%；同种磁球在不同细胞密度的外周血CTCs模型中捕获效率差异无统计学意义(P＞0.05)(图 4f)；在同种溶剂中两种磁球的捕获效率差异无统计学意义(P＞0.05)(图 4g)；EpCAM免疫脂质磁球在PBS溶液CTCs模型中对A549细胞的捕获效率大于在外周血CTCs模型(P＜0.05)，EGFR免疫脂质磁球在PBS溶液CTCs模型中对A549细胞的捕获效率大于在外周血CTCs模型(P＜0.05)(图 4h)。
图4
EpCAM与EGFR免疫脂质磁球捕获鉴定不同浓度梯度的外周血CTCs模型 a~e.分别为在3 mL的健康者的外周血中加入1~10、11~50、51~100、101~500、501~1 000个A549细胞时两种磁球的捕获结果； f.外周血CTCs模型中5个浓度梯度下两种磁球捕获效率差异无统计学意义(P＞0.05)；g.在同种溶剂中两种磁球对A549细胞的捕获效率差异无统计学意义(P＞0.05)；h.两种磁球在PBS中对A549细胞的捕获效率均大于在外周血中的捕获效率(P＜0.05)
四 EpCAM与EGFR免疫脂质磁球对肺癌患者CTCs捕获结果
将13份甲组样本的每份血样平均分为2份，分别用EpCAM与EGFR免疫脂质磁球捕获鉴定CTCs，将检测结果标准化为7.5 mL血液标本。结果显示，两种磁球均能检测出肺癌患者CTCs，且两种磁球的捕获效率差异无统计学意义(P＞0.05)(图 5a、b)。取10名健康志愿者外周血的每份血样平均分为2份，分别用EpCAM与EGFR免疫脂质磁球捕获鉴定CTCs(作为阴性对照)，与肺癌患者检测结果进行比较，肺癌患者与对照组间差异有统计学意义(P＜0.05)(图 5c、d)，说明EpCAM免疫脂质磁球具有较低的假阳性率。
图5
EpCAM与EGFR免疫脂质磁球捕获鉴定肺癌患者CTCs a、b：EpCAM与EGFR免疫脂质磁球检测肺癌患者CTCs的结果；c、d：EpCAM与EGFR免疫脂质磁球检测健康志愿者与肺癌患者CTCs比较(P＜0.05)
①表示第12号患者EGFR检测结果缺失
五 EpCAM免疫脂质磁球与CellsearchTM系统对肺癌患者CTCs捕获结果比较
将乙组每例样本平均分成2份后分别用EpCAM免疫脂质磁球人工操作法和CellsearchTM系统检测CTCs。结果显示，EpCAM免疫脂质磁球对其中2例患者的CTCs检出量高于CellsearchTM系统(图 6)。
图6
EpCAM免疫脂质磁球法与CellsearchTM系统对肺癌患者CTCs捕获结果比较
讨 论
1869年Ashworth[13]首次报道了外周血中存在的CTCs，并认为CTCs是肿瘤进展和复发的原因。此后，尤其是近几十年来，科研工作者们不断地探索CTCs的检测方法，包括“免疫磁分离技术捕获血液中的CTCs”“微芯片分离技术”等[14-15]。研究发现，CTCs的数量与肿瘤患者的预后相关[16-17]。由于 CTCs较血细胞而言数量极少，约1个/1012~1个/109，捕获CTCs有如大海捞针，故目前尚无一种具有高敏感性、特异性且经济简便的检测方法可应用于临床。即便是FDA批准的CellsearchTM系统，也仅可用于乳腺癌、前列腺癌和结肠癌患者CTCs的检测，且因其检测费用高昂，在临床上并未广泛使用，而又因肺癌CTCs上皮标志物表达量低，CellsearchTM系统不能对其进行有效捕获[6]。
本课题组前期研制的脂质磁球具有稳定的理化性质和良好的水溶性，以及表面可更好地与抗体结合的特点，基于此设计了EpCAM及EGFR抗体免疫脂质磁球捕获CTCs，再以是否表达CK19和CD45作为判定的标准，检测CTCs。利用抗体免疫脂质磁球法检测肺癌CTCs，发现其能有效捕获1~300个/mL A549的CTCs模型，且可有效捕获不同类型肺癌患者的循环肿瘤细胞。与CellsearchTM系统进行对比的3例患者CTCs检测结果提示抗体免疫脂质磁球法CTCs检出率较高。由此可见，抗体免疫脂质磁球法具有较好的临床应用前景。但因检测临床样本数量限制，本研究未结合患者的临床资料作统计分析。EpCAM及EGFR抗体免疫脂质磁球对CTCs的捕获效能还需进一步扩大样本量进行临床验证。
最近的全球癌症统计表明肺癌是男性癌症死亡的主要原因，并且在发达国家中已经超过乳腺癌成为女性癌症死亡的主要原因[1]。远处转移是肿瘤的基本特征之一，是许多肿瘤致死的关键因素[2]。随着病情的进展，肺癌患者会出现骨、脑、肝、肾上腺等远处转移，严重影响预后。目前临床上用于肿瘤诊断及预后判断的方法主要包括肿瘤组织活检、影像学、血清肿瘤标志物等检查，这些方法在评估肿瘤转移上均具有一定的局限性[3-4]。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是存在于实体瘤患者外周血中的肿瘤细胞，有研究表明在肿瘤患者中CTCs计数对治疗疗效的评价优于血清肿瘤标志物，且CTCs对临床疗效的早期评估优于影像学检查，但是目前在肺癌患者中尚缺乏检测CTCs的有效手段[5-6]。
前期我们以十八烷基三甲基氯化铵对羧甲基壳聚糖和胆固醇为原料找到了一种简单快速制备磁性阳离子高聚物脂质体的方法，较传统脂质体相比，有许多优良的特性，如物理和热稳定性好，有良好的水溶性等，且表面可连接多种生物活性物质[7-9]。上皮细胞粘附分子(EpCAM)是最常用于上皮来源循环肿瘤细胞阳性富集法的细胞表面标志物，细胞角蛋白家族(CK8，CK18，CK19)是检测上皮表型肿瘤的金标准[10-11]。此外，有研究发现表皮生长因子受体(EGFR)在肺癌细胞表面高表达[12]。本研究通过将肺癌表面抗体anti-EpCAM和anti-EGFR接于磁性阳离子高聚物脂质体上获得EpCAM和EGFR抗体免疫脂质磁球，以此两种磁球为捕获材料检测CTCs，并与CellsearchTM系统进行比较，评估这两种磁球是否可用于捕获肺癌患者CTCs。
材料与方法
一 材料
1．细胞系、主要试剂、外周血样本：肺癌细胞系A549细胞购自美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)细胞库；DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶购于Gibco公司；EpCAM抗体购于Sigma公司；CD45-PE购自eBioscience公司；藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记的CK19抗体购自强生Veridex公司；Cellsearch循环肿瘤细胞检测试剂盒购于强生Veridex公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色液购自碧云天生物技术有限公司；EpCAM抗体衍生物购自上海锐劲生物技术有限公司；磁性纳米颗粒购自上海晟纳实业有限公司；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSAPC-APCG)购自Avanti公司；胆固醇、二氯甲烷以及其他常用试剂均购自国药公司。10名健康成年志愿者，其中8名志愿者每人抽取外周血15~21 mL，2名抽取3 mL；16例病理确诊肺癌患者(无其他部位肿瘤)，其中13例患者抽取外周血6 mL(甲组样本)，3例抽取15 mL(乙组样本)；健康志愿者和甲组血样置于EDTA抗凝管中，乙组血样置于强生专用采血管中，24 h内处理。所有样本均取自于长海医院，受试者知情同意，研究通过医学伦理会审查。
2．实验仪器：磁力架(上海柏慧康生物科技有限公司)；离心机(上海安亭科学仪器厂)；荧光显微镜，OLYMPUS B×61；CellTracks(强生Veridex公司)；PE标记的CD45抗体(CD45-PE)和BD FACSEALIBUR流式细胞仪均为美国碧迪公司生产；强生CellTracks® AutoPrep® System CTCs检测仪(简称CellsearchTM系统，强生Veridex公司)。
二 方法
1．制备EpCAM和EGFR免疫脂质磁球：采用反向蒸发法制备免疫脂质磁球，后用EpCAM和EGFR抗体进行修饰，并用粒径分析仪分析，确保所制备的免疫脂质磁球的性能稳定。
2．制备磷酸缓冲盐溶液(PBS)CTCs模型：取肺癌A549细胞，计数后分别以1~10、11~50、51~100、 101~500、501~1 000个细胞5个梯度加入3 mL PBS溶液中，模拟CTCs模型。
3．制备外周血CTCs模型：取肺癌A549细胞，计数后分别以1~10、11~50、51~100、101~500、501~1 000个细胞5个梯度加入3 mL健康人外周血中，进一步模拟CTCs模型。
4．CTCs的捕获和鉴定：用EpCAM和EGFR免疫脂质磁捕获肺癌患者CTCs并使用DAPI、CK19-FITC、CD45-PE进行染色鉴定。本研究中CTCs捕获及鉴定为人工操作，方法原理与CellsearchTM相近[7]。具体步骤：将待测标本进行1 000 r/min离心10 min；小心取中上层液置于对应的EP管中后，加入与其等量的PBS(pH=7.4)充分混匀；随后加入选定免疫脂质磁球(EpCAM和EGFR免疫脂质磁球)120 μL，室温孵育30 min，每10 min混匀1次；将EP管插入磁分离架上吸附10 min，吸弃上清液，取出EP管；使用PBS对捕获的CTCs进行磁分离洗涤2次；加DAPI 30 μL、CK19-FITC 30 μL、CD45-PE 10 μL混匀避光染色15 min；染色结束后磁分离架上去离子水洗涤2次；最后，向EP管中加入30 μL去离子水重悬，混匀后的液体均匀涂于防脱载玻片中心，待液滴干后在荧光显微镜下拍照计数。
5．CTCs判断标准：荧光显微镜下蓝色通道观察DAPI染色，显示蓝色荧光为细胞核；绿色通道下观察呈绿色荧光表明该细胞表达CK，上皮来源可能性大；红色通道下显示红色荧光表明该细胞表达CD45，为白细胞。循环肿瘤细胞的判断标准为：将蓝色通道下显示蓝色荧光，绿色通道下显示绿色荧光且红色通道下不显示荧光的细胞判定为CTCs(图 1a、1b)；将蓝色通道下显示蓝色荧光，绿色通道下显示绿色荧光且红色通道下显示红色荧光的细胞判定为白细胞(图 1c)。
图1
免疫脂质磁球捕获肺癌患者CTCs后荧光显微镜下的观察与鉴定图像(×400，白场) a.EpCAM免疫脂质磁球捕获后 荧光显微镜下CTCs的图像；b.EGFR免疫脂质磁球捕获后荧光显微镜下CTCs的图像；c.荧光显微镜下观察到的白细胞的图像
三 统计学处理
将各组数据经SPSS 21.0统计软件处理。计数资料以
结 果
一 抗体修饰对免疫脂质磁球粒径的影响
用粒径分析仪检测纳米磁球，未经抗体修饰前的纳米磁球平均粒径为261.0 nm(图 2a)，经EpCAM抗体修饰后免疫脂质磁球平均粒径增大为319.5 nm(图 2b)，经EGFR抗体修饰后免疫脂质磁球平均粒径增大为325.4 nm(图 2c)。较小的粒径有助于抗体磁球保持在水相溶液中的稳定性，本实验制备的抗体磁球符合要求。
图2
磁球粒径分布 a.未经抗体修饰前的纳米磁球平均粒径；b.经EpCAM抗体修饰后免疫脂质磁球平均粒径；c.经EGFR抗体修饰后的免疫脂质磁球平均粒径
二 EpCAM与EGFR免疫脂质磁球对PBS溶液CTCs模型中A549细胞捕获结果
取不同细胞密度梯度的PBS溶液CTCs模型6组，其中3组用EpCAM免疫脂质磁球法，另外3组用EGFR免疫脂质磁球法进行CTCs捕获及鉴定。在不同浓度梯度下，两种磁球均能有效捕获A549细胞(图 3a~e)，对A549细胞的中位检出率分别为92%和90%，同种磁球在不同浓度梯度的PBS溶液CTCs模型中捕获效率差异无统计学意义(P＞0.05)，不同磁球在同种细胞密度下捕获效率差异无统计学意义(图 3f)。
图3
EpCAM与EGFR免疫脂质磁球捕获鉴定不同浓度梯度的PBS溶液CTCs模型 a~e.分别为在3 mL的PBS溶液中加入1~10、11~50、51~100、101~500、501~1 000个A549细胞时两种磁球的捕获结果；f.5个浓度梯度下两种磁球捕获效率的比较(P＞0.05)
三 EpCAM与EGFR免疫脂质磁球对外周血CTCs模型中肺癌A549细胞的捕获结果
取不同浓度梯度的外周血CTCs模型8组，其中4组用EpCAM免疫脂质磁球，另外4组用EGFR免疫脂质磁球进行CTCs捕获鉴定。结果显示，在不同肿瘤细胞密度梯度下，两种磁球均能有效捕获外周血中的A549细胞(图 4a~e)，且捕获效率均大于70%；同种磁球在不同细胞密度的外周血CTCs模型中捕获效率差异无统计学意义(P＞0.05)(图 4f)；在同种溶剂中两种磁球的捕获效率差异无统计学意义(P＞0.05)(图 4g)；EpCAM免疫脂质磁球在PBS溶液CTCs模型中对A549细胞的捕获效率大于在外周血CTCs模型(P＜0.05)，EGFR免疫脂质磁球在PBS溶液CTCs模型中对A549细胞的捕获效率大于在外周血CTCs模型(P＜0.05)(图 4h)。
图4
EpCAM与EGFR免疫脂质磁球捕获鉴定不同浓度梯度的外周血CTCs模型 a~e.分别为在3 mL的健康者的外周血中加入1~10、11~50、51~100、101~500、501~1 000个A549细胞时两种磁球的捕获结果； f.外周血CTCs模型中5个浓度梯度下两种磁球捕获效率差异无统计学意义(P＞0.05)；g.在同种溶剂中两种磁球对A549细胞的捕获效率差异无统计学意义(P＞0.05)；h.两种磁球在PBS中对A549细胞的捕获效率均大于在外周血中的捕获效率(P＜0.05)
四 EpCAM与EGFR免疫脂质磁球对肺癌患者CTCs捕获结果
将13份甲组样本的每份血样平均分为2份，分别用EpCAM与EGFR免疫脂质磁球捕获鉴定CTCs，将检测结果标准化为7.5 mL血液标本。结果显示，两种磁球均能检测出肺癌患者CTCs，且两种磁球的捕获效率差异无统计学意义(P＞0.05)(图 5a、b)。取10名健康志愿者外周血的每份血样平均分为2份，分别用EpCAM与EGFR免疫脂质磁球捕获鉴定CTCs(作为阴性对照)，与肺癌患者检测结果进行比较，肺癌患者与对照组间差异有统计学意义(P＜0.05)(图 5c、d)，说明EpCAM免疫脂质磁球具有较低的假阳性率。
图5
EpCAM与EGFR免疫脂质磁球捕获鉴定肺癌患者CTCs a、b：EpCAM与EGFR免疫脂质磁球检测肺癌患者CTCs的结果；c、d：EpCAM与EGFR免疫脂质磁球检测健康志愿者与肺癌患者CTCs比较(P＜0.05)
①表示第12号患者EGFR检测结果缺失
五 EpCAM免疫脂质磁球与CellsearchTM系统对肺癌患者CTCs捕获结果比较
将乙组每例样本平均分成2份后分别用EpCAM免疫脂质磁球人工操作法和CellsearchTM系统检测CTCs。结果显示，EpCAM免疫脂质磁球对其中2例患者的CTCs检出量高于CellsearchTM系统(图 6)。
图6
EpCAM免疫脂质磁球法与CellsearchTM系统对肺癌患者CTCs捕获结果比较
讨 论
1869年Ashworth[13]首次报道了外周血中存在的CTCs，并认为CTCs是肿瘤进展和复发的原因。此后，尤其是近几十年来，科研工作者们不断地探索CTCs的检测方法，包括“免疫磁分离技术捕获血液中的CTCs”“微芯片分离技术”等[14-15]。研究发现，CTCs的数量与肿瘤患者的预后相关[16-17]。由于 CTCs较血细胞而言数量极少，约1个/1012~1个/109，捕获CTCs有如大海捞针，故目前尚无一种具有高敏感性、特异性且经济简便的检测方法可应用于临床。即便是FDA批准的CellsearchTM系统，也仅可用于乳腺癌、前列腺癌和结肠癌患者CTCs的检测，且因其检测费用高昂，在临床上并未广泛使用，而又因肺癌CTCs上皮标志物表达量低，CellsearchTM系统不能对其进行有效捕获[6]。
本课题组前期研制的脂质磁球具有稳定的理化性质和良好的水溶性，以及表面可更好地与抗体结合的特点，基于此设计了EpCAM及EGFR抗体免疫脂质磁球捕获CTCs，再以是否表达CK19和CD45作为判定的标准，检测CTCs。利用抗体免疫脂质磁球法检测肺癌CTCs，发现其能有效捕获1~300个/mL A549的CTCs模型，且可有效捕获不同类型肺癌患者的循环肿瘤细胞。与CellsearchTM系统进行对比的3例患者CTCs检测结果提示抗体免疫脂质磁球法CTCs检出率较高。由此可见，抗体免疫脂质磁球法具有较好的临床应用前景。但因检测临床样本数量限制，本研究未结合患者的临床资料作统计分析。EpCAM及EGFR抗体免疫脂质磁球对CTCs的捕获效能还需进一步扩大样本量进行临床验证。
